专利名称：新的人衣被蛋白亚基编码序列、其编码的多肽及制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人衣被蛋白ζ亚基即人ζ-COP的cDNA序列，该蛋白是ζ-COP的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
真核生物细胞中，蛋白质在各细胞器间的运输是通过运输小泡的出芽和融合实现的。研究发现，细胞中存在两种不同蛋白组成外壳的有被运输小泡一种是笼形蛋白(clathin)包被的小泡，内吞时从细胞膜上出芽形成，或从高尔基体成熟面出芽运至其它内源细胞器(Cell 791199-1207，1994)；另一种是衣被蛋白(COP)包被的小泡，定位于高尔基体膜和过渡内质网(transitional ER)的特殊区域(Nature362648-652，1993)。这两种蛋白都是由多个亚基组成(Annu.Rev.Biochem.59415-438，1990；Nature 355409-415，1992)，并且两者的亚基之间有一定的同源性。另外在酿酒酵母中发现COPII包被的小泡从内质网膜上产生(Cell 77895-908，1994)。
COP蛋白复合物于1986年由Orci等人分离纯化得到。实验表明它不含有笼形蛋白，并且承担高尔基体囊之间的蛋白运输功能(Cell 46171-184，1986)。90年代初，Serafini和Stenbeck等人克隆了该复合物的部分亚基(如α、β’、γ)(Nature349215-220，1991；FEBS Lett.314195-198，1992)。1993年Kuge等人从牛的肝细胞中分离得到了COP蛋白的又一个亚基ζ(Zeta)-COP蛋白，并克隆了其cDNA序列(J.Cell.Biol.123(6)1727-1734，1993)。1996年，Cosson等人利用遗传突变研究得到了酵母的ζ(Zeta)-COP同源物(EMBO J.15(8)1792-1798，1996)。
在本发明公布之前，尚没有任何人公开过本申请中涉及的人类ζ(Zeta)-COP蛋白和cDNA序列。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码人衣被蛋白ζ亚基即人ζ-COP蛋白，本发明的基因被命名为人ζ-COP。
本发明的另一个目的是提供一种新的蛋白，该蛋白被命名为人ζ-COP。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人ζ-COP蛋白的方法。
本发明还提供了这种人ζ-COP编码序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人ζ-COP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ IDNO.3中从核苷酸18-551位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸18-551位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸18-551位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的人ζ-COP蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人ζ-COP蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有人ζ-COP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人ζ-COP蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸18-551位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人ζ-COP蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人ζ-COP蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人ζ-COP蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为652个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于18-551位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“人ζ-COP蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人ζ-COP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中18-551位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框18-551位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中18-551位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地，在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸18-551位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸18-551位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中开放读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“人ζ-COP蛋白多肽”指具有人ζ-COP蛋白活性的SEQ IDNO.4序列的多肽。该术语还包括具有与人ζ-COP相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人ζ-COP蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与人ζ-COP DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人ζ-COP多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人ζ-COP多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人ζ-COP多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人ζ-COP多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人ζ-COP蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人ζ-COP多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括人ζ-COP多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人ζ-COP的表达。
本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有人ζ-COP多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人ζ-COP的核酸分子。
本发明还包括检测人ζ-COP核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人ζ-COP多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对人ζ-COP DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人ζ-COP基因产物或片段。较佳地，指那些能与人ζ-COP基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人ζ-COP蛋白的分子，也包括那些并不影响人ζ-COP蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人ζ-COP基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人ζ-COP基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人ζ-COP或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人ζ-COP功能的抗体以及不影响人ζ-COP功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人ζ-COP基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与ζ-COP基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
在附图中，
图1为本发明的人ζ-COP与牛ζ-COP的核酸序列的同源比较图。其中，相同的核苷酸用“|”标出。
图2为本发明的人ζ-COP与牛ζ-COP的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用“|”标出。
在本发明中，人ζ-COP的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，合成正向引物A15′-ACCAGCTGCGGGGCAAGATGGAG -3′和反向引物A25′-CCGAGATGACCCTGAGAGCATCG-3′进行PCR，获得652bp的目的片段。测序后得到SEQ ID NO.3的全长cDNA序列。
衣被运输小泡(COP-coated vesicles)外的蛋白复合物主要由ADP核糖基化因子(ARF)和衣被蛋白(coatomer)组成(FEBS Lett..36989-92，1995)。当高尔基体膜形成小泡时，首先结合胞液中ARF，当它们结合了GTP并在膜表面达到饱和后，衣被蛋白开始结合于小泡表面，并促进衣被小泡的最终形成(Curr.Opin.Cell.Biol.5621-627，1993)。当ARF水解了GTP后，被膜小泡的衣被蛋白开始解体，小泡与目标膜融合(J.Cell.Biol.1221365-1371，1993)。研究表明，衣被蛋白是由七个亚基的一个复合物(Nature 349248-251，1991)，ζ-COP是其中最小的一个亚基，并不直接和高尔基体膜上的衣被蛋白结合位点作用(J.Cell.Biol.1231727-1734，1993)。它在复合物中和γ-COP有相互作用，可以在体外免疫共沉淀实验中被共同沉淀下来(J.Bio.Chem.270(52)31364-31371，1995)。ζ-COP在胞液中可以是可溶性单体，也可以与衣被蛋白相结合。当ζ-COP与衣被蛋白结合，它就开启了衣被蛋白的功能，反之衣被蛋白就处于无活性状态。ζ-COP的这种特性表明它具有调节衣被装配、进而调节生物合成的蛋白质的运输速率的功能(J.Cell.Biol.1231727-1734，1993)。衣被运输小泡不仅参与蛋白质在高尔基体中的正向运输，也能将其从高尔基体反向运输至内质网(EMBO J.15(8)1792-1798，1996)。另外，在有丝分裂时，衣被小泡也是高尔基体降解分裂的主要产物，提示COP不仅在蛋白质运输方面而且在细胞器形成方面都具有极为重要的作用(FEBS Lett.38966-69，1996)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人ζ-COP的cDNA序列的克隆和测定1.引物扩增以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用寡核苷酸引物——A15′-ACCAGCTGCGGGGCAAGATGGAG-3′(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸A25′-CCGAGATGACCCTGAGAGCATCG-3′(SEQ ID NO.2)为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、68℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片段，A1/A2为652bp的目的片段。
2.PCR产物的测序将上述获得的PCR扩增产物与pGEM-TTM载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共652bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于18-551位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出人ζ-COP的氨基酸序列，共177个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.4。
实施例2同源比较用人ζ-COP的全长cDNA序列及其编码蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundantGenBankCDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST进行核酸和蛋白同源检索。结果发现它们与牛ζ-COP基因及其编码蛋白具有极高同源性，用PCGENE软件比较发现，它们在核酸水平上的同一性达到94.5％(图1)，在蛋白水平上的同一性达到98.9％(图2)。因此，确定它们构成了一个家族，而且本发明的人ζ-COP具有与同一家族中其他成员相同或相似的功能。
衣被运输小泡(COP-coated vesicles)外的蛋白复合物主要由ADP核糖基化因子(ARF)和衣被蛋白(coatomer)组成。这些蛋白成分的重要作用有1)使扁平膜变成芽；2)防止小泡未成熟或随机的融合；3)对泡内装载蛋白起到分拣和集中的作用(FEBS Lett..36989-92，1995)。当高尔基体膜形成小泡时，首先结合胞液中ARF，ARF是一类小型GTP结合蛋白，当它们结合了GTP并在膜表面达到饱和后，衣被蛋白开始结合于小泡表面，并促进衣被小泡的最终形成(Curr.Opin.Cell.Biol.5621-627，1993)。当ARF水解了GTP后，被膜小泡的衣被蛋白开始解体，小泡与目标膜融合(J.Cell.Biol.1221365-1371，1993)。研究表明，衣被蛋白是由七个亚基的一个复合物(Nature 349248-251，1991)，复合物的空间结构和各亚基的作用尚不明了，已知ζ-COP是其中最小的一个亚基，并不直接和高尔基体膜上的衣被蛋白结合位点作用(J.Cell.Biol.1231727-1734，1993)。它在复合物中和γ-COP有相互作用，可以在体外免疫共沉淀实验中被共同沉淀下来(J.Bio.Chem.270(52)31364-31371，1995)。不同于其它亚基，ζ-COP被发现在胞液中可以是可溶性单体。ζ-COP也可以与衣被蛋白相结合，使得每个衣被蛋白复合物中ζ-COP的平均分子数小于1。当ζ-COP与衣被蛋白结合，它就开启了衣被蛋白的功能，反之当它解离下来，衣被蛋白就处于无活性状态。ζ-COP的这种特性表明它具有调节衣被装配、进而调节生物合成的蛋白质的运输速率的功能(J.Cell.Biol.1231727-1734，1993)。各种实验结果表明，衣被运输小泡不仅参与蛋白质在高尔基体中的正向运输，它也能识别蛋白质上的双赖氨酸标志，将其从高尔基体反向运输至内质网(EMBO J.15(8)1792-1798，1996)。另外，在有丝分裂时，衣被小泡也是高尔基体降解分裂的主要产物，大约有60％的高尔基体膜碎片组成了衣被运输小泡，使高尔基体能在两个子细胞中平均分配，这提示了COP不仅在蛋白质运输方面而且在细胞器形成方面都具有极为重要的作用(FEBS Lett.38966-69，1996)。
本发明的人ζ-COP除了可作为该家族亚基一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人ζ-COP还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人ζ-COP的N端与牛ζ-COP的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的亚基和/或蛋白。
针对本发明人ζ-COP的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
实施例3人ζ-COP在大肠杆菌中的表达在该实施例中，将编码人ζ-COP的cDNA序列用对应于该DNA序列5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人ζ-COPcDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5’-AGTTGTCGACATGGAGGCGCTGATTTTGG-3′(SEQ ID NO.5)，该引物含有SalI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人ζ-COP编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5’-AAGGAAGCTTTCACCGAAGGAGTGACCAC-3’(SEQ ID NO.6)，该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人ζ-COP的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用SalI和HindIII消化pQE-9载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，用BamHI酶切鉴定插入片段大小及方向，并测序验证人ζ-COP的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人ζ-COP。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱人ζ-COP。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出纯化蛋白，纯化后的蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质对含PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为l0％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为约20KDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例4人ζ-COP在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，将编码人ζ-COP的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人ζ-COP cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5’-CGTTAAGCTTATGGAGGCGCTGATTTTGG-3′(SEQ ID NO.7)
该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人ζ-COP编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5’-AAGTGAGCTCTCACCGAAGGAGTGACCAC-3’(SEQ ID NO.8)该引物含有SacI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和人ζ-COP的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindIII和SacI分别消化pcDNA3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coliDH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用BamHI酶切鉴定插入片段大小及方向，并测序验证人ζ-COP的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染CHO细胞是用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行，转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为20KDa。
此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例5制备抗体将实施例3和4获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人ζ-COP基因翻译产物的能力加以评估。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人上海新黄浦复旦基因工程有限公司(ii)发明名称新的人衣被蛋白亚基编码序列、其编码的多肽及制备方法(iii)序列数目8(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1ACCAGCTGCGGGGCAAGATGGAG 23(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.2CCGAGATGACCCTGAGAGCATCG 23(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)长度652bp
(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.31 ACCAGCTGCG GGGCAAGATG GAGGCGCTGA TTTTGGAACC TTCCCTGTAT ACTGTCAAAG61 CCATCCTGAT TCTGGACAAT GATGGAGATC GACTTTTTGC CAAGTACTAT GACGACACCT121 ACCCCAGTGT CAAGGAGCAA AAGGCCTTTG AGAAGAACAT TTTCAACAAG ACCCATCGGA181 CTGACAGTGA AATTGCCCTC TTGGAAGGCC TGACAGTGGT ATACAAAAGC AGTATAGATC241 TCTATTTCTA TGTGATTGGC AGCTCCTATG AAAATGAGCT GATGCTTATG GCTGTTCTGA301 ACTGTCTCTT CGACTCATTG AGCCAGATGC TGAGGAAAAA TGTAGAAAAG CGAGCACTGC361 TGGAGAACAT GGAGGGGCTG TTCTTGGCTG TGGATGAAAT TGTAGATGGA GGGGTGATCC421 TAGAGAGTGA TCCCCAGCAG GTGGTACACC GGGTGGCATT AAGGGGTGAA GATGTCCCCC481 TTACGGAGCA GACCGTGTCT CAGGTGCTGC AGTCAGCCAA AGAACAGATC AAGTGGTCAC541 TCCTTCGGTG AAGACCTCAC TGTTCCTGGC TCTTCATCCT CTTCAAAAAA TTTGCATGTC601 TGCTGTGAAT TTTCATCTAG TTCCCCAATC GATGCTCTCA GGGTCATCTC GG(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)长度177个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.41 Met Glu Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Val Lys Ala16 Ile Leu Ile Leu Asp Asn Asp Gly Asp Arg Leu Phe Ala Lys Tyr31 Tyr Asp Asp Thr Tyr Pro Ser Val Lys Glu Gln Lys Ala Phe Glu46 Lys Asn Ile Phe Ash Lys Thr His Arg Thr Asp Ser Glu Ile Ala61 Leu Leu Glu Gly Leu Thr Val Val Tyr Lys Ser Ser Ile Asp Leu76 Tyr Phe Tyr Val Ile Gly Ser Ser Tyr Glu Asn Glu Leu Met Leu91 Met Ala Val Leu Asn Cys Leu Phe Asp Ser Leu Ser Gln Met Leu106 Arg Lys Asn Val Glu Lys Arg Ala Leu Leu Glu Asn Met Glu Gly121 Leu Phe Leu Ala Val Asp Glu Ile Val Asp Gly Gly Val Ile Leu136 Glu Ser Asp Pro Gln Gln Val Val His Arg Val Ala Leu Arg Gly151 Glu Asp Val Pro Leu Thr Glu Gln Thr Val Ser Gln Val Leu Gln166 Ser Ala Lys Glu Gln Ile Lys Trp Ser Leu Leu Arg(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5AGTTGTCGACATGGAGGCGCTGATTTTGG 29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6AAGGAAGCTTTCACCGAAGGAGTGACCAC 29(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7CGTTAAGCTTATGGAGGCGCTGATTTTGG29(2)SEQ ID NO.8的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.8AAGTGAGCTCTCACCGAAGGAGTGACCAC29
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人ζ-COP蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸18-551位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸18-551位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列是SEQ ID NO.3中核苷酸18-551位的序列。
4.一种分离的人ζ-COP蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。
9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。
10.一种产生具有人ζ-COP蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有人ζ-COP蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人ζ-COP蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸18-551位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人ζ-COP蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人ζ-COP蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人ζ-COP蛋白活性的多肽。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.3中从核苷酸18-551位。
12.一种能与权利要求4所述的人ζ-COP蛋白多肽特异性结合的抗体。
13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说,本发明涉及人衣被蛋白ζ亚基即人ζ－COP的cDNA序列,该蛋白是ζ－COP的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽,这些多核苷酸和多肽的应用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
文档编号C12P21/00GK1248624SQ9811974
公开日2000年3月29日 申请日期1998年9月22日 优先权日1998年9月22日
发明者余龙, 屠强, 傅强, 张宏来, 赵寿元 申请人:上海新黄浦复旦基因工程有限公司