专利名称：Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体地是涉及一种Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗及其制备方法。
目前世界上大量生产的乙脑疫苗有两种，一种是以日本为代表的用感染乙脑病毒的小白鼠脑组织经过研磨、乳化、浓缩、超速离心制备的纯化乙脑疫苗，一种是中国生产的原代地鼠肾细胞培养的乙脑灭活疫苗和原代地鼠肾乙脑活疫苗，这些疫苗的细胞基质均来源于普通级动物，无法保证不携带外源因子。
鼠脑纯化乙脑疫苗是用脑组织制造的，而脑组织疫苗在历史上曾发生过严重的过敏反应，因而用脑组织制备的疫苗虽经纯化处理仍不免有此忧虑；其次鼠脑纯化乙脑疫苗的制备必须经过一只一只小白鼠的脑腔接种，一个一个感染鼠脑的收获，其操作过程繁琐，无法形成工业化生产规模，所以若制成大批量的均质疫苗，成本很高，价格昂贵，对于一些主要靠进口乙脑疫苗的国家，由于价格的原因，很难满足供应。
据美国CDC发起的一项调查研究表明鼠脑提纯乙脑灭活疫苗二针注射后的抗体阳转率(≥1∶8)77％，6～12个月加强一针后阳转率(1∶16)100％，但是副反应发生率较高，包括局部反应和全身反应达41％。丹麦和澳大利亚使用日本鼠脑提纯乙脑疫苗后也有发生严重过敏性反应的报导，在印度使用这种疫苗测定抗体反应，结果并不理想。
中国当前生产的地鼠肾乙脑灭活疫苗对于降低乙脑发病率确实起了明显作用，使乙脑发病率稳步下降。但是其血清中和抗体阳转率并不理想，在非流行区学龄儿童或流行区1岁内儿童的中和抗体阳转率只有60％左右，加强一针后达到90％左右，并且，疫苗注射后的副反应主要是过敏反应，虽然普遍来讲比较轻微而尚可接受，但据调查统计的结果，在北京市，其副反应发生率在几种儿童普遍接种的疫苗中位居第二，仅次于百白破。还有一种AS14-14-2株乙脑活疫苗，由于只需注射一针就有较好的血清抗体反应，而且生产工艺简单成本低廉，故受到了生产厂家和使用者的欢迎，但是仍不能排除原代地鼠肾细胞外源污染因子的可能，而且有研究表明乙脑活病毒接种免疫抑制动物皮下可引起病毒入脑繁殖，所以在活疫苗的推广应用中也需予以适当注意，安全之策可以采取1岁之内灭活疫苗初次免疫，之后用活疫苗加强的办法。
中国生产的地鼠肾细胞乙脑疫苗所用的生产毒种仍是用感染普通小白鼠脑制备的，虽经多年使用证明是安全有效的，但抗原含量较低，其脑组织不仅是过敏源之一，而且饲养管理动物和制备毒种及其使用等均较麻烦，其生产工艺也不利于控制外源因子的污染，更不适合大规模工业化生产。
为了制备更好的乙脑疫苗，从80年代开始有关于基因工程乙脑疫苗的研究报导，其载体多种多样，表达蛋白大多是E蛋白、PrM和NS1，经过实验室检定和诱生抗体反应均比较满意，但是经病毒攻击的保护试验均不及全病毒疫苗理想。
Vero细胞是日本学者1962年从非洲绿猴(cercopithecus aethiops monkey)肾建立的猴肾细胞系。其名称的由来是取自世界语中“绿”字的VERDE前两个字母和“肾”字前两个字母合在一起，但世界语中不允许VERE存在，而需以“O”结尾，故命名为“Vero”。其第93代被带到美国NIH的过敏与传染病研究所热带病毒研究室，第113代被提交给ATCC，编号为ATCC NO.CCL-81。
经过全面的研究鉴定，Vero细胞具有胞核学稳定，没有外源因子污染和致瘤性的优点，完全符合1987年WHO关于用于生物制品的传代细胞的规程要求，并已被WHO批准可用作疫苗生产的基质。于是，Vero细胞小儿麻痹灭活疫苗、小儿麻痹活疫苗、Vero细胞狂犬病疫苗相继在法国被研制出来并获批准生产，并且有关用Vero细胞制备人用疫苗的研究报告亦时有报道，但关于用Vero细胞制备乙型脑炎疫苗的研究还未见系统报道。
本发明的目的之一在于提供一种Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗，该疫苗中不含鼠脑组织，纯度高，免疫效果好，使用安全性高。
本发明的目的之二在于研究提出一种Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的制备方法，以Vero细胞培养取代原来的地鼠肾细胞培养，以Vero细胞毒种取代目前的鼠脑组织毒种，并通过浓缩纯化，提高疫苗质量和使用效果，实现乙脑疫苗的大规模工业化生产。
本发明提供的Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗，是指在Vero细胞上接种Vero细胞乙脑病毒毒种得到的纯化乙型脑炎灭活疫苗。
本发明提出的制备方法包括以下步骤(1)、Vero细胞的培养扩增；(2)、在Vero细胞上接种Vero细胞乙脑病毒毒种；(3)、收获病毒；(4)、灭活病毒制成粗疫苗；(5)、超滤浓缩；(6)、疫苗的纯化。
本发明使用的Vero细胞种来自ATCC，首先建立Vero细胞种子库和Vero细胞工作库，并对细胞库细胞进行系统的检定。在制备疫苗之前，需先进行细胞的复苏、培养和扩增，以达到生产批量的需要。可以使用动物细胞培养液加入牛血清配制而成的细胞营养液，所说的培养液可以选择199培养液、MEM培养液等，其中以使用199培养液效果较为理想，细胞营养液中最好含有2～10％的牛血清，PH7.0～8.0，在37±1℃进行培养扩增。
各种用于制备疫苗的哺乳动物细胞均为附着依赖性细胞，细胞在培养过程中需要附着在一定的载体上生长，本发明中细胞的培养方式可以有转瓶培养，也可以使用微载体反应器培养。
Vero细胞在微载体反应器中培养时，微载体使用量2～7克/升，转速30～55转/分钟，其中可供选择使用的微载体有多种，如Cytodex1、2、3型(pharmacia)，CT1、CT2、CT3(华东化工学院)以及购自中国医科院血研所和中科院东风生化试剂厂的微载体等，经试验证明都能满足要求。
为防止细菌污染，在配制细胞营养液的同时可加入适量的庆大霉素。
培养过程中，细胞分种率根据生产批量的需要确定，一般可以是1∶2～1∶10，当细胞长成致密单层后，即可接种乙脑病毒，细胞维持液中最好加入0.1％(w/w)以上的人白蛋白，同时调整PH7.2～8.0，培养温度32～37℃，并可加入适量的氨基酸和抗生素，可供使用的培养液包括199液、MEM液等，接种过程包括先用培养液如Earle氏液等冲洗细胞表面，去除残留的牛血清，然后在已经生长成片的Vero细胞上接种乙脑病毒毒种及上述细胞维持液，MOI 0.1～0.00001，培养约24小时后更换新鲜细胞维持液，继续培养48小时左右，即可收获病毒。
本发明在Vero细胞上接种的乙脑病毒为在Vero细胞上传代的乙脑病毒种，有实验结果显示，乙脑病毒在Vero细胞上能够很好地生长繁殖，而Vero细胞传代乙脑病毒10代以内很稳定，并且在制备Vero细胞乙脑疫苗方面，10代以内的细胞传代毒种的免疫原性没有明显改变，而10代以后毒种的免疫原性则有明显的下降，也就是说，制备疫苗最好选用10代以内的传代毒种，10代以后的毒种不宜用于制备灭活疫苗。至于毒种则优选乙脑鼠脑毒种P3株在Vero细胞的传代毒种。
乙脑病毒在Vero细胞上的生长繁殖可维持较长时间，因此病毒的收获可采取多次收取的方式，最好是每1～2天收获一次，对收获的病毒液及时测定病毒滴度，要求每批所收获病毒液的病毒滴度均应在107LD50/ml以上，因为只有高滴度的病毒液才能保证疫苗的高效力。
收获的病毒液用福尔马林液灭活病毒得到的是粗疫苗。
灭活后的粗疫苗需要进行浓缩提纯制备成纯疫苗制品，本发明选用超滤浓缩的方法对得到的粗疫苗进行浓缩，一般是用截留10万～30万分子量的超滤器浓缩疫苗，浓缩至10倍以上，然后纯化疫苗。
以传代细胞制备生物制品安全性的关键是细胞残余DNA的含量。按WHO规程要求，疫苗的基质DNA必须小于100pg/剂量。有关疫苗的纯化方法包括化学法和物理方法等可以有多种，经反复试验和研究，本发明提出了两种优选的纯化方法一种是先使用硫酸鱼精蛋白使疫苗中的残余DNA沉淀，经高速离心，取上清液，再利用蔗糖密度梯度区带离心的方法提纯，收取合并蛋白低、抗原活性高的组分。其中，硫酸鱼精蛋白的使用浓度与疫苗是否浓缩以及浓缩倍数有关，在本发明提出的工艺条件下，浓缩疫苗在0.8～2.0mg/ml的硫酸鱼精蛋白的作用下，不仅可有效除去残余DNA，而且抗原活性无明显丢失，研究中还发现，硫酸鱼精蛋白在去除DNA过程中还除去了疫苗中部分杂蛋白(约20～60％)，起到了初步纯化的作用。至于DNA残余量则可以通过已有报导的同位素标记Vero细胞DNA探针或光敏生物素标记Vero细胞DNA探针方法进行测定。
具体操作中，硫酸鱼精蛋白可以先以磷酸缓冲盐水(PBS)溶解成50mg/ml的溶液，向疫苗中滴加并不断摇动，然后在2～8℃下静置2～3小时，经6000～10000转/分高速离心5～30分钟，使DNA与鱼精蛋白共同沉淀出来。
上述以硫酸鱼精蛋白沉淀除去DNA后的疫苗上清液再采用蔗糖密度梯度区带离心的方法进行提纯，操作条件蔗糖液浓度36～60％(w/w)，2～10℃，23000～28000转/分钟离心4～6小时，分部收集组分，对其取样测定蛋白、抗原和蔗糖，合并蛋白低、抗原活性高的组分，其测定方法属公知技术，不再详述。
本发明中浓缩疫苗的纯化还可以通过柱层析法来实现即浓缩疫苗先经离子交换柱层析除去部分杂蛋白和细胞DNA，再经凝胶过滤柱层析进一步去除残留杂质。离子交换柱如DEAE-Sepharose FF等，选择性地吸附浓缩疫苗液中的杂蛋白和DNA；而凝胶过滤层析是层析技术中最简单，条件最温和，对保持生物大分子的活性最有利的方法，适合分离分子量悬殊的物质，乙脑病毒的分子量在400万以上，与疫苗中的杂蛋白分子量相差较大，故使用凝胶柱层析可以非常方便有效地去除浓缩疫苗中残留的小分子杂质，该凝胶过滤柱可以是Sepharose CL-6B、Sepharose 4FF、Sphacryl S-500 HR柱或其他凝胶，而检测结果表明，经两步层析柱纯化后，疫苗总蛋白含量减少约99％以上，牛血清和细胞DNA的残余量均符合WHO的有关规程要求。
纯化疫苗在最终冻干制成成品之前，需加入保护剂，该保护剂可以有多种选择，如人白蛋白保护剂与麦芽糖、人白蛋白保护剂与蔗糖、明胶，等等。
总之，本发明提出了一种制备乙脑疫苗的新途径，即使用Vero细胞作为疫苗的生产基质，并且以Vero细胞的传代毒种代替现有的鼠脑组织毒种，通过相应的工艺方法生产制备出高质量的乙脑疫苗。
本发明与目前使用的来自鼠脑组织病毒的乙脑疫苗相比，最主要的优点如下(1)Vero细胞已被证明不含有任何污染因子和致瘤性，作为生产疫苗的基质，明显优于现行疫苗的地鼠肾细胞和鼠脑组织；(2)Vero细胞乙脑疫苗的毒种是细胞培养毒种，从根本上甩掉了鼠脑提纯疫苗和地鼠肾乙脑疫苗使用的鼠脑组织；(3)用传代细胞的Vero细胞生产疫苗工艺，适于工业化生产批量的均质疫苗，这是现行的地鼠肾细胞疫苗和鼠脑提纯疫苗办不到的；(4)本发明疫苗经提纯后抗原活性明显提高，杂蛋白减少99％以上，疫苗的纯度大大提高；(5)经1000余人的人体观察结果显示，本发明疫苗在非流行区学龄儿童和流行区1岁儿童中注射二针后的血清中和抗体阳转率达到90％以上，加强一针后的血清抗体阳转率达到100％，除偶有一过性发热外，未发现局部反应和全身反应，可以说有比较可靠的安全性。
附图
提供了本发明制备方法的方框流程图。
实施例1Vero细胞来自ATCC，使用138～150代，细胞营养液为199培养液中含有4％牛血清和25Iu/ml庆大霉素，并调整PH到7.2，用15L转瓶37℃培养成致密单层后按照1∶5分种率扩增，扩增到生产批量时，经过4天左右，当细胞长成致密单层，弃去细胞营养液，用PH7.2的Earl氏液冲洗细胞面，接种Vero细胞乙脑病毒，使用乙脑鼠脑毒种P3株在Vero细胞上传代的第二代工作毒种(P3V2)，毒种浓度MOI0.05，细胞维持液为含0.1％(w/w)人白蛋白的MEM液，PH7.6，35℃下培养，24小时后换以新鲜细胞维持液继续培养2天，开始收获病毒，每2天收获一次，共收5次，每批病毒液均取样进行病毒滴定和无菌试验，要求收获病毒液的病毒滴度达到107LD50/ml以上；合并病毒液加入福尔马林(终浓度1/2000)置于26±1℃，8天灭活病毒，得到粗疫苗，用截留30万分子量的超滤器浓缩成20倍浓缩疫苗。
取硫酸鱼精蛋白以PBS溶成50mg/ml的溶液，然后滴加入浓缩疫苗液中同时不断摇动，加入硫酸鱼精蛋白的终浓度1.0mg/ml，4℃下静置2小时，7000rpm快速离心30分钟，取上清液进行蔗糖密度梯度区带离心，上样PBS 100ml，硫酸鱼精蛋白处理后的浓缩疫苗1000ml，36-60％(w/w)蔗糖590ml，4℃，使用日立55P-72型离心机，RP-50T角形转头，23000rpm离心4小时，收集组分，每25ml一管，分别取样测定蛋白、抗原和蔗糖，合并蛋白低、抗原高的组分，用超滤除去蔗糖，加入0.2％的人白蛋白保护剂和5％麦芽糖并根据抗原滴定结果，用磷酸缓冲盐水稀释至酶标抗原320单位，分装成0.5ml/剂疫苗的剂型，经冻干制成疫苗成品。
实施例2Vero细胞来自ATCC，以常规胰蛋白酶消化传代，使用138代，细胞浓度3×l05/mg，使用Cytodexl 1，3g/L在5L的Celligen生物反应器(NBS Co.Inc)内培养，工作体积3.8L，转速40～45转/分钟，溶解氧25～50％，培养温度37℃，细胞生长液为含有3％(w/w)小牛血清的199液，PH7.0～7.2。第三天开始换液，随时观察细胞的生长情况，根据细胞的生长情况每天换液1/3～1/2，连续培养7天，直到细胞长成致密单层，当细胞密度达到2.16×106时，用Earle氏液洗涤2次后，加入不含牛血清、含0.1％(w/w)人白蛋白的MEM液(PH7.4～7.6)，并接种Vero细胞P3株乙脑病毒，MOI0.01～0.001，病毒培养温度36℃，24小时后换以新鲜的细胞维持液，并于种毒后72小时开始收获病毒，每36～48小时收获一次病毒悬液，直到所有细胞病变为止，病毒滴度达到8.20～9.20log LD50/ml。
将收获的病毒悬液以福尔马林灭活制成粗疫苗，澄清后用截留30万分子量的超滤器浓缩成20倍浓缩疫苗，超滤后的浓缩疫苗过离子交换柱DEAE-SepharoseFF和凝胶过滤柱Sepharose 4FF，经二步柱层析，得到纯化疫苗，加入保护剂后冻干制成纯化疫苗成品，经检定疫苗效力超过了中国乙脑疫苗参考品和日本乙脑疫苗参考品，其他各项检定均符合WHO有关该疫苗的要求。
权利要求
1.一种Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗，其特征在于该疫苗是在Vero细胞上接种Vero细胞乙脑病毒毒种得到的纯化乙型脑炎灭活疫苗。
2.一种Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)、Vero细胞的培养扩增；(2)、在Vero细胞上接种Vero细胞乙脑病毒毒种；(3)、收获病毒；(4)、灭活病毒制成粗疫苗；(5)、超滤浓缩；(6)、疫苗的纯化。
3.根据权利要求2所述的Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，疫苗的纯化方法是先使用硫酸鱼精蛋白使疫苗中的残余DNA沉淀，经高速离心，取上清液，再利用蔗糖密度梯度区带离心的方法提纯，收取合并蛋白低、抗原活性高的组分。
4.根据权利要求2所述的Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，浓缩疫苗的纯化还可以通过柱层析法来实现浓缩疫苗先经离子交换柱层析除去部分杂蛋白和细胞DNA，再经凝胶过滤柱层析进一步去除残留杂质。
5.根据权利要求2所述的Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，该细胞营养液可以使用199培养液加入2～10％牛血清配制而成。
6.根据权利要求2或5所述的Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，Vero细胞在转瓶内培养。
7.根据权利要求2或5所述的Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，Vero细胞在微载体反应器中培养，微载体使用量2～7克/升。
8.根据权利要求2或4所述的Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，在配制细胞营养液的同时可加入适量的庆大霉素。
9.根据权利要求2所述的Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，细胞维持液中加入0.1％以上的人白蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗及其制备方法,该疫苗是在Vero细胞上接种Vero细胞乙脑病毒毒种得到的纯化乙脑灭活疫苗,制备方法包括Vero细胞的培养扩增、在Vero细胞上接种Vero细胞乙脑病毒毒种、收获病毒及灭活、浓缩、纯化等步骤,由于使用Vero细胞培养及Vero细胞毒种,不含有污染因子和致瘤性,具有纯度高,免疫效果好,使用安全性高的优点,也有助于实现乙脑疫苗的大规模工业化生产。
文档编号C12N7/00GK1248471SQ9811936
公开日2000年3月29日 申请日期1998年9月23日 优先权日1998年9月23日
发明者丁志芬, 石慧颖, 庞成华, 常振彦, 杨春婷, 赵敏, 杨抗抗, 李荆, 顾佩伟 申请人:卫生部北京生物制品研究所