专利名称：蛋白质生产方法
最近几年人们研究了将甲基营养酵母作为异源蛋白质的合适的表达系统。尤其是多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)已被描述成大量外源基因的容易操纵的宿主有机体(可参见综述Gelissen & Melber 1996以及Gregg & Madden 1988)。由于发现甲醇代谢中涉及的酶的启动子很强，所以它们通常被用于控制蛋白质的异源表达(见EP 0173378,EP 0299 108,EP 0183 071)。
已知用于培养这些有机体的碳源对启动子调节有巨大影响。Gelissen等(1994)描述了在靠甲醇生长期间，多形汉逊酵母中大量存在甲醇代谢的关键酶。还发现在甘油生长细胞中可检测到大量甲醇氧化酶(MOX)和甲酸脱氢酶(FMDH)这些酶，但如果将葡萄糖用作碳源就不存在这些酶(例如见EP 0 299 108)。基于这些信息，可总结出这些酶是由甲醇诱导的。在靠甘油生长期间，MOX和FMDH的表达可用启动子的脱阻抑解释。在多形汉逊酵母和克勒克酵母菌(Kloeckerasp.)2201的葡萄糖限制的恒化培养物中，FMDH只是在小于0.1h-1的生长速率下被很少量地产生(Egli等1980)。因此，迄今一直将非阻抑碳源用于由甲基营养酵母异源表达蛋白质。培养多形汉逊酵母用于按补料分批法生产多种药物蛋白质，该补料分批法或以应用甘油的单一碳源方式或以应用甘油另加甲醇的两种碳源方式(Gelissen & Melber1996)。Weydemann等(1995)更详细地描述了生产水蛭素的一般方法。Chen等(1996)描述了也应用甘油作为非阻抑碳源由巴斯德毕赤酵母菌株生产凝血调节蛋白的方法。
但是，由于甘油昂贵，所以该方法至今都不适于生产例如饲料酶或工业酶的低成本蛋白质。因此，本发明的一个目的是克服这些障碍并提供一种通过培养转化的或未转化的真核细胞而制备内源蛋白质或异源蛋白质的方法，该方法的特征在于将阻抑基质用作碳源，在加料阶段限制碳源而在整个培养期间没有连续的氧限制；或者这种方法，其中该蛋白质是酶，特别是饲料酶，例如肌醇六磷酸酶、纤维素酶、木聚糖酶，或者是工业酶，例如淀粉酶、蛋白酶、转化酶、脂肪酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡糖氧化酶、醇氧化酶、果胶酶、柚苷酶(naraginase)、胶原酶、过氧化物酶或支链淀粉酶；或者这种方法，其中该细胞是甲基营养细胞和/或用DNA序列转化了，该DNA序列包括甲醇代谢中涉及的酶的启动子，如甲酸脱氢酶(FMD或FMDH)启动子、甲醇氧化酶(MOX)启动子或二羟丙酮合酶(DAS或DHAS)启动子；或者这种方法，其中该细胞是甲基营养酵母，优选是汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)或球拟酵母属(Torulopsis)，例如多形汉逊酵母或巴斯德毕赤酵母；或者这种方法，其中阻抑基质占碳源的1-100％，优选40-100％或更优选90-100％或是唯一的碳源；或者这种方法，其中该基质是糖如单糖、二糖、寡糖或多糖，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糖原、纤维素或右旋糖或者含糖的混合物，如糖蜜、葡萄糖浆或果糖糖浆；或者这种方法，它以多次补料分批的方式进行。此外，本文中这种方法的特征在于加料速率范围受限于微生物的代谢特性和生物反应器中特别是氧的传质性能。加料速率优选保持在允许生产的最小值和避免培养物中氧限制的最大值之间。
至于生产异源蛋白质的方法，已经用DNA序列或包括编码这种异源蛋白质(例如在本案中的肌醇六磷酸酶)的DNA序列的载体转化真核细胞。分子生物学领域中的技术人员熟悉制备这类转化的真核细胞的方法，例如参见本案例EP684313或欧洲专利申请No.97810175.6的具体实施例。
本发明上下文中的“培养”具有本领域技术人员熟悉的普通含义。具体培养条件将取决于应用的细胞和待生产的蛋白质及其表达系统。发酵生产蛋白质领域中的技术人员也熟悉这类条件。此外，应懂得就本发明的实施来说，在短的分批阶段即细胞的生长阶段中，可应用阻抑的或非阻抑的碳源，分别如葡萄糖或甘油。在补料分批阶段即所需蛋白质的生产阶段中，培养过程是按本发明提供的方式进行的。
此外，实施本发明的令人感兴趣的甲基营养酵母例如可得自EP173378，第37和38页。
图1表示加料阶段中应用甘油或葡萄糖作唯一碳源培养多形汉逊酵母的时间过程比较；图2表示多次补料分批培养循环，加料溶液中葡萄糖比例递增；其中CDM表示细胞干质量。
实施例实施例1应用甘油或葡萄糖作为主碳源由多形汉逊酵母生产烟曲霉(A.fumigatus)肌醇六磷酸酶为了比较应用甘油或葡萄糖作加料基质的肌醇六磷酸酶的生产，在15l反应器中用多形汉逊酵母菌株进行两个补料分批实验，该多形汉逊酵母菌株含有得自烟曲霉的在FMD启动子控制下的野生型肌醇六磷酸酶基因(Pasamontes等，1997)的大约80个拷贝。
摇瓶培养始于将保持在-70℃下的1ml甘油储备细胞悬浮液接种入50ml下列组成的培养基30.0g/l甘油；2.5g/l KH2PO4；5g/lNH4H2PO4；2.25g/l MgSO4·7H2O；2.5g/l (NH4)2SO4；1.15g/l KCl；0.25g/l NaCl；0.375g/l CaCl2·2H2O；0.25mg/l H3BO3；0.05g/l(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O；4mg/l CuSO4·5H2O；15mg/l ZnSO4·7H2O；20mg/l MnSO4·H2O；0.05g/l Na-EDTA；0.5mg/l NiSO4·6H2O；0.5mg/l CoCl2·6H2O；0.5 mg/l Na2MoO4·2H2O；0.5mg/l KI；0.05g/l盐酸硫胺素；0.15mg/l生物素。将它们在30℃和200rpm下培养24h，将30ml转至具有300ml相同培养基的第二个摇瓶阶段，又在30℃和200rpm下培养24h。
将300ml该种子培养物用作含5l包括下列物质的初始培养基的15l发酵罐的接种物10.0g/l甘油；5.0g/l KH2PO4；10g/l NH4H2PO4；4.5g/l MgSO4·7H2O；5.0g/l (NH4)2SO4；2.3g/l KCl；0.5g/lNaCl；0.2ml/l消泡剂；0.75g/l CaCl2·2H2O；0.5mg/l H3BO3；0.1g/l(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O；8mg/l CuSO4·5H2O；30mg/lZnSO4·7H2O；40mg/l MnSO4·H2O；0.1g/l Na-EDTA；1.0mg/lNiSO4·6H2O；1.0mg/l CoCl2·6H2O；1.0mg/l Na2MoO4·2H2O；1.0mg/l KI；0.1g/l盐酸硫胺素；0.3mg/l生物素。在整个过程中，温度、pH和通气分别保持恒定在30℃、pH4.6和5l/h。pH是通过加入25％NH3而控制的。通过控制搅拌器速率和压力(0～0.5巴)将氧饱和度维持在反应器中20％饱和度这一最小值。培养基中初始甘油的全部消耗导致pO2值的迅速增大，指示分批阶段的结束。此时，开始加料700g/l甘油或葡萄糖的溶液。首批18h加料中初始加料速率为每小时25g溶液，然后将速率增高到50g/h。由于加料约6升碳源溶液而使培养物体积增大到培养结束时的约11升。
就加料葡萄糖的培养而言，在培养过程中代谢的全部碳源的98％是葡萄糖，余下的2％相当于分批期间应用的甘油。在整个过程中，上清液中没有定量分析出葡萄糖。
165h操作时间之后，应用Bradford蛋白质测定法对取自用甘油培养的样品定量分析出5.86g/l肌醇六磷酸酶。从用葡萄糖培养160小时操作时间后的样品用同样方法测定出7.12g/l肌醇六磷酸酶。这些结果证实，葡萄糖的阻抑效果可应用保证加料阶段中严格的碳限制的加料法来避免。图1示出应用甘油和应用葡萄糖作为主碳源进行培养的时间过程比较。
实施例2应用蔗糖作为主碳源由多形汉逊酵母生产烟曲霉肌醇六磷酸酶在本实施例中，应用与实施例1中相同的菌株在15l生物反应器中进行培养。种子培养物和主要培养条件与实施例1的完全相同，只是加料溶液所含的是700g/l蔗糖。在操作期间，上清液样品中的蔗糖浓度决不高于1g/l，而同样的样品中既检测不到葡萄糖也检测不到果糖。167h培养期后，应用Bradford蛋白质测定法可测知培养基中5.27g/l的肌醇六磷酸酶。
实施例3应用葡萄糖作为唯一碳源由多形汉逊酵母生产烟曲霉肌醇六磷酸酶在本实施例中，应用与实施例1和2的相同菌株在15l生物反应器中进行培养。种子培养物是在与实施例1和2相同条件下获得的。在生物反应器中用5l与实施例1中所述相同组成的初始培养基开始进行主培养，只是初始10g/l甘油被10g/l葡萄糖代替。加料溶液由700g/l葡萄糖组成，它是在与实施例1中所述完全相同的条件下加入培养物中的。160h操作时间之后，由Bradford法可测知培养基中7.21g/l肌醇六磷酸酶。
实施例4应用多次补料分批方式由多形汉逊酵母生产烟曲霉肌醇六磷酸酶在本实施例中，在15l反应器中应用与实施例1、2和3中相同的多形汉逊酵母菌株进行多次补料分批培养。第一次培养时，种子培养物是这样获得的，即将1ml保持在-70℃的甘油储备细胞悬浮液接种入300ml具有下列组成的培养基30.0g/l甘油；13.3g/l NH4H2PO4；3.0g/lMgSO4·7H2O；6.7g/l(NH4)2SO4；3.3g/l KCl；0.33g/l NaCl；1.0g/lCaCl2·2H2O；0.67mg/l H3BO3；0.067g/l(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O；5.3g/l CuSO4·5H2O；20mg/l ZnSO4·7H2O；26mg/l MnSO4·H2O；0.067g/l Na-EDTA；0.67mg/l NiSO4·6H2O；0.67mg/l CoCl2·6H2O；0.67mg/l Na2MoO4·2H2O；0.67mg/l KI；0.13g/l盐酸硫胺素；0.4mg/l生物素。在30℃和200rpm下将摇瓶培养30h，将300ml用作含下列物质的15l生物反应器中主培养物的接种物150.0g甘油；100.0gNH4H2PO4；22.5g MgSO4·7H2O；50.0g (NH4)2SO4；25g KCl；2.5gNaCl；7.5g CaCl2·2H2O；5mg H3BO3；0.5g (NH4)2Fe(SO4)2·6H2O；40mg CuSO4·5H2O；150mg ZnSO4·7H2O；40mg MnSO4·H2O；0.5g Na-EDTA；5.0mg NiSO4·6H2O；5.0mg CoCl2·6H2O；5.0mgNa2MoO4·2H2O；5.0mg KI；1g盐酸硫胺素；3mg生物素，初始体积为7.5l培养基。
在整个过程中，温度、pH和通气分别保持恒定在30℃、5.0和9.0l/min。pH是通过加入25％NH3而控制的。通过控制搅拌器速率和压力(0～0.5巴)将氧饱和度维持在反应器中20％饱和度这一最小值。培养基中初始甘油的全部消耗导致pO2值的迅速增大，指示分批阶段的结束。此时，开始加料含40％葡萄糖和60％甘油的溶液至总碳源浓度为700g/l。在整个加料阶段将加料速率控制在45g/h。
至于下面的多次补料分批培养，操作结束时将上一轮的0.5～1l培养液保持在该生物反应器中作为下一轮的接种物。将含相同总量上述盐但不含碳源的新无菌培养基加入该生物反应器达规定的初始体积。因此，不存在分批阶段且如上所述立即开始加料。加料溶液含总计700g/l碳源。应用下面给出的甘油和葡萄糖的各种比例以及初始体积第2次循环-66％葡萄糖，34％甘油，7.5l初始体积第3次循环-90％葡萄糖，10％甘油，7.5l初始体积第4和第5次循环-100％葡萄糖，5l初始体积如图2所示，第1至第5次循环的每次循环结束时达到的肌醇六磷酸酶浓度分别为4.7g/l、3.9g/l、4.3g/l、6.0g/l和4.4g/l。在第4次循环中，生长阶段结束时，更慢、更长久的加料方式导致更高的产物浓度。
实施例5由多形汉逊酵母生产共有(consensus)肌醇六磷酸酶在本实施例中，在15l生物反应器中应用与实施例1中所述相同的培养基和相同的条件培养含大约40个拷贝的在FMD启动子控制之下的共有肌醇六磷酸酶基因的多形汉逊酵母菌株(欧洲专利申请No.97810175.6)，补料分批阶段应用含700g/l葡萄糖的加料溶液。165h培养期之后，由Bradford法测得培养基中肌醇六磷酸酶浓度为13.1g/l。
参考文献J.M.Cregg和K.R.Madden(1988)开发甲基营养酵母即巴斯德毕赤酵母作为生产外源蛋白质的宿主系统，工业微生物学进展(Developments in Industrial Microbiology)29,33-41Gelissen和K.Melber(1996)作为重组药物生产有机体的甲基营养酵母多形汉逊酵母，药物研究(Drug Res.),46,943-948G.Gelissen,C.P.Hollenberger,Z.A.Janowicz(1994)甲基营养酵母中的基因表达。参见Smith A.(编辑)重组微生物中的基因表达(Gene expression in recombinant microorganisms),Dekker,NewYork,195-239Weydemann,P.Keup,M.Piontek,A.W.M.Strasser,J.Schweden,G.Gelissen,Z.A.Janowicz(1995)多形汉逊酵母高水平分泌水蛭素，应用微生物学及生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)44,377-385Th.Egli,J.P.Van Dijken,M.Veenhuis,W.Harder,A.Fiechter(1980)酵母中的甲醇代谢分解代谢酶合成的调节，微生物学文献(Arch.Microbiol.124,115-121Y.Chen,J.Krol,和D.Freedman(1996)从巴斯德毕赤酵母发酵连续生产凝血调节蛋白，化学技术与生物技术杂志(J.Chem.Tech.Biotechnol.)67,143-148L.Pasamontes,M.Haiker,M.Wyss,M.Tessier,A.P.G.M.VanLoon(1997)得自烟曲霉真菌的热稳定性肌醇六磷酸酶的基因克隆、纯化和鉴定，应用环境微生物学(APPl.Environ.Microbiol.)63,1696-1700。
权利要求
1．通过培养转化的或未转化的真核细胞而制备内源蛋白质或异源蛋白质的方法，该方法的特征在于将阻抑基质用作碳源，在进料阶段限制碳源而在整个培养期间没有连续的氧限制。
2．权利要求1的方法，其中的蛋白质是酶，特别是饲料酶，例如肌醇六磷酸酶、纤维素酶、木聚糖酶，或者是工业酶，例如淀粉酶、蛋白酶、转化酶、脂肪酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡糖氧化酶、醇氧化酶、果胶酶、柚苷酶、胶原酶、过氧化物酶或支链淀粉酶。
3．权利要求1或2的方法，其中的细胞是甲基营养细胞和/或用DNA序列转化了，该DNA序列包括甲醇代谢中涉及的酶的启动子，如甲酸脱氢酶(FMD或FMDH)启动子、甲醇氧化酶(MOX)启动子或二羟丙酮合酶(DAS或DHAS)启动子。
4．权利要求1到3中任一权利要求的方法，其中的细胞是甲基营养酵母，优选是汉逊酵母属如多形汉逊酵母，毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母，假丝酵母属或球拟酵母属。
5．权利要求1到4中任一权利要求的方法，其中的阻抑基质占碳源的1-100％，优选40-100％或更优选90-100％或是唯一的碳源。
6．权利要求1到5中任一权利要求的方法，其中的阻抑基质是糖如单糖、二糖、寡糖或多糖，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糖原、纤维素或右旋糖或者含糖的混合物如糖蜜、葡萄糖浆或果糖糖浆。
7．权利要求1到6中任一权利要求的方法，其中该方法是以多次补料分批的方式实施的。
全文摘要
本发明公开了通过将阻抑基质用作碳源培养转化的或未转化的真核细胞而制备内源蛋白质或异源蛋白质的方法。
文档编号C12P21/02GK1218112SQ9811899
公开日1999年6月2日 申请日期1998年9月30日 优先权日1997年10月1日
发明者K·海尔穆斯, R·罗派茨－尤里巴利, A·F·梅尔, H·W·施里克, A·范伦 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司