专利名称：栀子细胞组织培养产生天然生根剂的方法
技术领域：
本发明提供了一种由栀子细胞培养生成的促进植物生根物质--栀子甙(Geniposide，Jasminoidin)的方法，利用植物细胞培养的方法，可以得到较高产率的植物细胞，进而提取促进植物生根作用的栀子甙。
栀子体内特别是栀子果实中都含有能促进植物生根的物质环烯醚萜甙类成分，如栀子甙(Geniposide，Jasminoidin)，羟异栀子甙(Gardenoside)及京尼平-1-0-龙胆双糖甙(Genipin1-0-1-gentiobioisde)等。但无论是野生还是人工栽培均存在野生资源少，缺乏环境保护，栽培技术跟不上和劳力昂贵等问题。将其应用于大力提高现有土地面积上的农作物的产量和质量的农业技术中，还存在着严重的供不应求之势。
本发明的目的在于提供一种栀子细胞组织培养天然生根剂的方法，其可以实现大规模地工业生产，不受季节和土地面积的限制。
本发明提供了一种栀子细胞组织培养生产天然生根剂的方法，所生产的生根剂中除含有部分色素和糖外，主要含有栀子甙1～9‰，羟异栀子甙1～9‰，京尼平-1-0-龙胆双糖甙1～9‰，该方法包括栀子细胞组织的建立、培养及栀子甙提取步骤，其特征在于(1)采用的栀子细胞组织是由栀子叶诱导产生的愈伤组织；(2)所使用的培养基为改良的MS培养基，组分如下大量元素NH4NO31000～2000(mg/L)KNO31500～2500CaCl2·2H2O 300～500MgSO4·7H2O 150～200微量元素KI1.5～1.7H3BO35.5～7.0MnSO4·7H2O 20～25ZnSO4·7H2O 5～15Na2MoO4·2H2O 0.1～0.5
CuSO4·5H2O 0.01～0.03CoCl2·6H20.01～0.03Na2EDTA35～40FeSO4·7H2O 20～30生长调节物质肌醇80～120烟酸0.3～0.7盐酸吡哆醇B10.3～0.7盐酸硫胺素B60.05～0.2甘氨酸 1.0～3.0α-萘乙酸(NAA) 0.5～5激动素(KT) 0.05～0.5蔗糖1.0～5.0琼脂0～5.0pH值5.0～6.5(3)栀子细胞的培养条件(a)固体培养改良的MS固体培养基，接种量1～5g/100ml，温度20～30℃，湿度60～85％，光强1000～3000lx；(b)液体培养改良的MS液体培养基，接种量1～5g/100ml，温度20～30℃，转速50～150rpm，光强1000～3000lx。
本发明中栀子愈伤组织的诱导过程是取栀子植株上的叶片，清洗，消毒，切片，平铺在改良的固体MS培养基上，温度为20～30℃，湿度60～85％，光强1000～3000lx条件下培养20～40天，叶片切口部分隆起，长出的一团团淡黄色细胞团即为栀子愈伤组织。
本发明中栀子甙的提取为将栀子细胞用甲醇浸提。
本发明提供的栀子细胞组织培养的天然生根剂，在使用时需要稀释100～1000倍，高于此浓度对植物生长有抑制作用，通常情况下浸种稀释500～1000倍；拌种稀释500～1000倍；叶面喷施稀释300～600倍。
本发明由于采用细胞组织培养的方法生产栀子甙天然生根剂，因而不受季节限制(一年四季均可生产)，占地面积小，易于筛选优秀品种，所生产的栀子甙易溶于水，含量高，能促进植物生根，便于工业化生产，具有广阔的市场前景。下面通过实施例详述本发明。
附
图1为栀子细胞优良株系的选育流程。
实施例11.栀子愈伤组织的诱导1)从栀子植株上取叶片用清水洗净(以下步骤均在无菌室超净工作台上进行)；2)洗净的叶片用8％NaClO3消毒10min后用无菌水冲洗3～5次，将水用无菌纸吸干；3)将叶片切成约1cm的小方块，平铺在改良的MS培养基上，在温度为25℃，湿度为75％，光强2000lx的光照培养箱中培养4)培养一个月左右的叶片，其边缘切口部分隆起，长出一团团淡黄色的细胞团，即为栀子愈伤组织。
2.改良的MS培养基大量元素NH4NO31650(mg/L)KNO31900CaCl2·2H2O 400MgSO4·7H2O 190KH2PO4170微量元素KI 1.66H3BO36.20MnSO4·7H2O 22.3ZnSO4·7H2O 8.60Na2MoO4·2H2O 0.25CuSO4·5H2O 0.025CoCl2·6H2O 0.025Na2EDTA 37.3FeSO4·7H2O 27.8肌醇100烟酸0.5盐酸吡哆醇B10.5
盐酸硫胺素B60.1甘氨酸 2.0α-萘乙酸(NAA) 1.0激动素(KT) 0.1蔗糖3.0(％)琼脂0.8pH值5.83.栀子固体细胞及悬浮细胞培养的建立1)将以上生长旺盛的淡黄色细胞团取下，转入新配制了的改良MS固体培养基中，接种量1g/100ml，在温度为25℃，湿度为75％，光强为2000lx的光照培养箱中继续培养。经多次重复，即可获得性状比较一致的细胞株系，即为细胞固体培养。
2)将继代3～5次的固体培养细胞，压碎转接到改良MS液体培养基中，接种量2g/100ml，在温度为25℃，转速为80rpm，光强为2000lx的摇床上培养。
3)培养一个月左右后，将所培养的栀子细胞上清培养液滤去，加入新的液体改良MS培养基，继续培养即为栀子悬浮培养。
4.栀子愈伤组织和悬浮细胞的生物量
植物组织培养的细胞生长速率一般固体培养为10g/L.d，悬浮培养为20g/L.d。
5.栀子细胞中粗栀子甙的制备方法1)栀子悬浮细胞离心，除去水分；2)沉淀的细胞加400ml甲醇冷浸48h后离心，上清待用；
3)沉淀后再加300ml甲醇冷浸2h后离心，此过程重复三次，上清待用；4)将离心所得全部上清液合并，用减压蒸馏法浓缩，除去甲醇；5)浓缩后的干品加入1～3倍的蒸馏水溶解，即为栀子甙粗提取液，粗栀子甙液中除含有部分色素和糖外，其主要成分为栀子甙 0.297％环烯醚萜甙类羟异栀子甙 0.260％京尼平-1-0-龙胆双糖甙 0.212％实施例2 栀子细胞改良MS培养基中激素对细胞生物量的影响
实施例3 不同培养方式所产生的粗栀子甙
实施例4 粗栀子甙用于小麦的生根作用
>本发明栀子甙可以用作为一般植物如粮食、蔬菜、水果等促进其根系生长的生根剂。应用浸种、沾根、拌种及叶面喷施等方法，均能促使植物根系发达，提高产量，使用浓度范围为稀释100～1000倍。
权利要求
1.一种栀子细胞组织培养生产天然生根剂的方法，所生产的生根剂中除含有部分色素和糖外，主要含有栀子甙1～9‰，羟异栀子甙1～9‰，京尼平-1-0-龙胆双糖甙1～9‰，该方法包括栀子细胞组织的建立、培养及栀子甙提取步骤，其特征在于(1)采用的栀子细胞组织是由栀子叶诱导产生的愈伤组织；(2)所使用的培养基为改良的MS培养基，组分如下大量元素NH4NO31000～2000(mg/L)KNO31500～2500CaCl2·2H2O 300～500MgSO4·7H2O 150～200微量元素KI1.5～1.7H3BO35.5～7.0MnSO4·7H2O 20～25ZnSO4·7H2O 5～15Na2MoO4·2H2O 0.1～0.5CuSO4·5H2O 0.01～0.03CoCl2·6H20.01～0.03Na2EDTA 35～40FeSO4·7H2O 20～30生长调节物质肌醇 80～120烟酸0.3～0.7盐酸吡哆醇B10.3～0.7盐酸硫胺素Be0.05～0.2甘氨酸 1.0～3.0α-萘乙酸(NAA) 0.5～5激动素(KT) 0.05～0.5蔗糖1.0～5.0琼脂0～5.0pH值 5.0～6.5(3)栀子细胞的培养条件(a)固体培养改良的MS固体培养基，接种量1～5g/100ml，温度20～30℃，湿度60～85％，光强1000～3000lx；(b)液体培养改良的MS液体培养基，接种量1～5g/100ml，温度20～30℃，转速50～150rpm，光强1000～3000lx。
2.按照权利要求1所述栀子细胞组织培养生产天然生根剂的方法，其特征在于栀子愈伤组织的诱导过程是取栀子植株上的叶片，清洗，消毒，切片，平铺在改良的固体MS培养基上，温度为20～30℃，湿度60～85％，光强1000～3000lx条件下培养20～40天，叶片切口部分隆起，长出的一团团淡黄色细胞团即为栀子愈伤组织。
3.按照权利要求1所述栀子细胞组织培养生产天然生根剂的方法，其特征在于栀子甙的提取为将栀子细胞用甲醇浸提。
全文摘要
一种栀子细胞组织培养生产天然生根剂的方法,该方法包括栀子细胞组织的建立、培养及栀子甙提取步骤,其特征在于:(1)采用的栀子细胞组织是由栀子叶诱导产生的愈伤组织;(2)所使用的培养基为改良的MS培养基;(3)栀子细胞的培养条件:(a)固体培养:改良的MS固体培养基, 接种量1～5g/100ml,温度20～30℃,湿度60～85%,光强1000～3000lx;(b)液体培养;改良的MS液体培养基,接种量1～5g/100ml,温度20～30℃,转速50～150rpm,光强1000～3000lx。本发明可以实现大规模地工业生产,不受季节和土地面积的限制。
文档编号C12N5/04GK1276424SQ99112969
公开日2000年12月13日 申请日期1999年6月2日 优先权日1999年6月2日
发明者白雪芳, 杜昱光, 王靖楣, 王毓福, 朱亮 申请人:中国科学院大连化学物理研究所