专利名称：应力可调控旋转式细胞/组织三维培养器的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及生物医学工程中组织医学工程技术中的细胞/组织培养器，特别是涉及一种具有应力可调控旋转式细胞/组织三维培养器。
细胞培养技术和装置的发展已有百余年历史，但是，90年代中期以前，医学界未能培养出具有与在体组织功能相同或相似的生物细胞/组织来。其主要原因是不可避免的重力作用使得细胞(或微载体)沉降于培养器底部，这样细胞在培养器器壁之间的接触抑制使得所培养的细胞不能真正三维生长，从而限制了细胞功能分化，长不成所需要的组织。另外一般生物化学工程中使用的生物反应器，如借助于机械搅拌(包括实验室用的摇瓶、摇床等)或吹入气体引起强迫对流等方法避免培养物沉降，并改善x营养供应。这种方法在微生物培养(如抗生素生产)中是成功的，但对于哺乳动物细胞培养来说是不适宜的。因为(1)哺乳动物细胞培养比微生物‘娇嫩’得多，机械搅拌造成的流动剪切和直接作用很容易损伤乃至破坏细胞，造成坏死。
(2)机械搅拌造成的流动剪切使得细胞难以(甚至不能)聚集，而细胞聚集是从细胞培养成组织的第一步。
空间微重力环境为细胞三维生长创造了条件，美国宇航局(NASA)从80年代中期着手发展空间生物反应器，90年代初期发展了旋转式生物反应器(RWV)。在文献[1]Culturinga Future，Fall，1998，Microgravity News中有介绍；应用旋转式生物反应器在低剪应力条件下实现了细胞三维培养，并在1995、1997年两次航天飞机搭载实验中成功地培养出结肠癌等组织。经组织切片观察表明它具有和在体组织相似的结构，而且其尺寸比用传统方法培养的组织大的多，达厘米量级。但是，该装置是在两个同步旋转的同心圆筒之间进行细胞培养，可以利用流体动力学效应，使细胞或微载体悬浮，进行三维培养，而且流动剪应力趋于零。
但从生物力学的观点来看，过分强调零剪应力对于培养功能高度分化的组织来说违背了生物力学的应力—生长适应性原理，因为(1)生物体内的器官和组织都是在一定力学环境里发挥其功能的，正常生物条件下，活体器官、组织内的应力(应变)分布应符合该组织、器官功能，而合理的应力分布是诱导细胞分化，长成具有和在体组织相同(或相似)功能的组织的重要条件。
(2)国外和我们关于流体动力对血管内皮细胞生长的影响的研究均表明，在培养细胞的过程中应力是调控细胞结构和功能(基因表达)的一个重要的因素。在细胞离体培养过程中，力学环境不仅影响细胞的聚集、粘附(细胞—细胞，细胞—基质表面等)，还影响其微结构和基因表达，进而影响细胞间通讯和功能分化。合理的力学环境将诱导、维持、促进并优化细胞的分化，形成一定的结构，长成具有特定功能的组织。
(3)实验表明(i)细胞生长过程中必然在周围介质里造成应力(即细胞生长本身将改变自身的力学微环境)。(ii)细胞生长引起的应力导致周围生物大分子排列有序化，可见应力是细胞间通讯的重要内容，也是细胞功能分化、进行组织构建的一个重要的信号系统。
另外，以1997年进行的软骨培养实验为例，如表1所示，尽管地面上用RWV培养的关节软骨GAG的含量及集合强度与天然软骨无统计差异，但细胞含量及动力学刚度与天然软骨有显著差异。前者和软骨组织的活性密切相关，而后者则是关节软骨的功能的重要表征。关节软骨是承受动力学载荷的组织，故从生物力学观点来看，造成RWV系统培养的关节软骨和天然软骨这种重大差异的主要原因在于RWV系统中的应力不能满足诱导并节软骨功能分化的需要。
表1 RWV系统在地基和空间培养的软骨组织的若干性能参数与天然软
<p>本实用新型的目的在于克服已有技术存在的原理性缺陷，按应力—生长适应性原理，提供一种既可满足细胞三维生长条件，又可随着培养过程中细胞生长，聚集、功能分化的需要来调控培养介质应力水平(从零剪应力到所培养细胞/组织的生理应力)以创造一个合理的力学环境，来诱导细胞功能定向分化的，生长成一定结构的、具有特定功能的细胞/组织的可对应力分布进行有效调控的应力可调控旋转式细胞/组织三维培养器。
本实用新型的目的是这样实现的本实用新型提供的应力可调控旋转式细胞/组织三维培养器，包括由气室、细胞培养室、培养液流动室三层同心圆筒套装构成的培养器主体、底座上固定的支架、由马达和变速器组成的传动机构，供液-排液及供气-排气系统，其特征在于筒壁上设有篓孔的内筒外表面上贴敷有液/液交换膜，其内腔为培养液流动室，筒壁上设有篓孔的中筒外表面上贴敷有气/液交换膜，其内腔为细胞培养室，外室筒壁上设有进气孔和出气孔，其内腔为气室，作为气室的外筒固定在支架上，不作轴向旋转，而作为培养液流动室的内筒和作为细胞培养室的中筒分别由各自的由马达和变速器组成的传动机构驱动作轴向旋转，其轴向旋转的角速度相同或不同，作为培养液流动室的内筒中同心地设置一根端部超出培养液流动室筒壁上设置的液/液交换膜轴向边缘的细长培养液流动管，其进口端的内筒上安装一与支架固定的隔离器，隔离器为一空心圆柱体，其内部径向设置与其中心线垂直的培养液进口和代谢物出口，培养液进口和代谢物出口中分别安装进液管和代谢物出液管，进液管与内筒中设置的培养液流动管相连通，代谢物出液管与内筒中培养液流动管管外的空腔，即代谢物环形回流通道相连通，隔离器中培养液进口和代谢物出口之间设置将其密封隔开的密封圈；供气-排气系统包括气源、气泵及输气管道，与气泵相连的输气管道与外筒上的进气口相连通；供液-排液系统包括培养液储液器、液泵及输液管道，与液泵相连的输液管道与隔离器上的培养液进液管相连通。所述的气源与气室相连的输气管道上设有稳压、调压阀，气室的出气口通过输气管道连接余气收集器；隔离器上的代谢物出液管通过输液管道连通阻尼器，阻尼器出口连通培养液透析器，培养液透析器出口分别连通代谢物收集器和气/液交换器，气/液交换器连通培养液储液器，储液器出口通过输液管道与隔离器上的进液管相连通。
使用上述应力可调控旋转式细胞/组织三维培养器对细胞/组织进行三维培养，可按常规培养工艺将培养物、新鲜培养液装入本实用新型的应力可调控旋转式细胞/组织三维培养器内，培养条件与常规工艺的培养条件相同，特点是培养器内应力可调控，即在细胞培养之初，作为细胞培养室的中筒及作为培养液流动室的内筒轴向同步旋转，转速为5-40转/分，此时，细胞培养室内剪应力分布趋于零，随着细胞培养过程细胞聚集体的形成，调控细胞培养室内的剪应力由零剪应力到所培养细胞/组织的生理应力，在培养过程中，其供气-排气系统的气源对气室的供气流量为0.4-10ml/min，供液-排液系统对细胞培养室的供液流量为0.1-10ml/min。
所述的细胞培养器内剪应力可调控是这样实现的在细胞培养之初，内筒和中筒同步旋转，转速为5-40转/分决定于不同培养物的尺度在培养介质中的悬浮，转速大于或等于培养物悬浮的最小角速度，随着细胞培养过程细胞聚集体的形成，内筒和中筒的轴向旋转由同步旋转变为差动旋转，并且可调控，其差动范围为
所述的细胞培养室内剪应力可调控通过调节内筒的转速和/或通过供液-排液系统中阻尼器调节液泵的输出压力和/或调节液泵的输出压力改变培养液流动室内的压力分布，来改变细胞培养室内的二次流。
所述的细胞培养器内剪应力可调控通过供气-排气系统中的稳压、调压阀改变气室内压力，以调节细胞培养室内的压力。
所述的细胞培养器内剪应力可调控在培养液中加入调节细胞培养室内介质粘度，改变剪应力的无毒、有利细胞生长的粘度与培养液不同的添加物，所加入的添加物包括高分子右旋糖酐。
本实用新型原理根据流体力学原理若两个同轴圆筒以等角速度旋转，经过一定的时间，充满于其间的粘性流体就会象固体一样以和圆筒相同的角速度旋转，各层流体之间没有相对运动，因而整个流场中流动剪应力为零，这就不会损伤细胞，而且有利于细胞聚集。而且在一定的角速度下，细胞、微载体细胞聚集体等可以借助于流体动力的作用，克服重力沉降而悬浮于培养液中，避免了与容器壁接触而导致接触抑止，从而确保细胞能真正三维生长。
本实用新型提供的应力可调控旋转式细胞/组织三维培养器，按常规培养工艺将培养物、新鲜培养液装入本实用新型的培养器内，培养条件和常规培养条件相同，其区别在于培养器内剪应力可调控。在细胞培养之初，内筒和中筒同步旋转，转速决定于不同培养物(细胞、微载体、细胞—材料构架种植体)的尺度在培养介质中的悬浮(不沉降条件)，如
图1所示。此时，介质内剪应力水平趋于零，有利于细胞聚集、粘附；而随着细胞聚集体的形成，再把内筒和中筒的旋转变为差动旋转，来调控细胞培养室内的剪应力分布，以诱导细胞功能的定向分化。剪应力水平的控制，因培养目标、生长状况而异。应力调控可通过以下途径实现(1)内筒和中筒的旋转差动旋转，在稳定性界限内，流动剪应力水平的改变可达3～4个量级；(2)调节内筒转速，和/或通过供液-排液系统中的阻尼器和/或液泵的输出压力改变培养液流动室内的压力分布，从而改变细胞培养室内的二次流，一达到调控细胞培养室内介质应力分布的目的；(3)通过供气排气系统中稳压、调压阀调控进入气室的气流来改变气室内压力，调节细胞培养室内的压力水平；(4)通过培养液供液-排液系统，在培养液中加入添加物，调节细胞培养室内介质的粘度，以改变其剪应力水平，而实现从细胞培养开始时细胞培养室内剪应力为零到随细胞聚集体形成剪应力为所培养的细胞/组织的生理应力，所加入的添加物的添加的量视培养目标来定。
本实用新型的既可用于细胞悬浮培养、微载体培养，亦可用於细胞—材料构架件聚集体等培养。至于培养液的组分则因培养对象而异。PH值、温度等条件和常规的细胞培养相同。只是在必要时，可加入添加物调节培养液的粘度和密度，以利于培养物悬浮，并改变介质剪应力水平。所述的添加物包括高分子右旋糖酐等。
为维持细胞生长化学微环境的稳态，必须保证足够的氧和营养的供应，并能及时带走代谢产物。单纯靠扩散是不能满足需要的，而传统生物反应器的搅拌或气升法也是不适用的(会损伤细胞或改变其结构、功能)。这是细胞/组织三维培养器的又一关键技术问题。本实用新型的培养器具有合理的流体力学设计，既可形成一定强度的对流扩散，又可将流体动力控制在一个合理的范围内，不致损伤细胞或导致细胞结构—功能的质的改变。
本实用新型的培养器借助流体动力避免重力沉降，确保培养物悬浮三维生长。
本实用新型的效果1.本实用新型提供的应力可调控旋转式细胞/组织三维培养器按照不同的培养对象(细胞、组织等)，在不同的细胞培养阶段，有效地调控细胞培养室内介质的剪应力分布，改善生长环境以利于细胞生长、运动、聚集、粘附，并诱导其分化，以形成所需要的特定组织。
2.本实用新型中培养液流动室、细胞培养室和气室是三层同心圆筒，内筒为培养液流动室，新鲜培养液进入培养液流动室，经液/液交换膜进入细胞培养室，代谢物由液/液交换膜流出后，由于离心力的作用，形成二次流。从扩散输运变为对流—扩散输运，营养供应效率提高且趋于均匀，不易形成“死区”。另一方面，气室在细胞培养室外侧，氧气通过气/液交换膜进入培养场后，可借助细胞培养室流动径向压力梯度传向深部，同样，细胞培养室内介质的二次流亦有利于氧输运且趋于均匀。
3.本实用新型可通过供液-排液系统和供气-排气系统中阻尼器和泵，改变流动参数，并对氧和培养液输运进行在线调节，从而提高对氧和营养输运效率，以利于细胞生长、运动、聚集、粘附，并诱导其分化，以形成所需要的组织。
4.该培养器有自动供气-排气、供液-排液系统，实现了在线供气、供液的连续运行；并通过气路上的稳压、调压阀可调节培养液流动室内压力分布，而改变液/液交换膜的交换效率，利用流体动力效应，提高氧和营养物的输运效率。
5.当其转速和培养物尺寸符合一定的匹配条件时，该培养器也可在地面重力环境里使用，利用流体动力克服重力沉降，确保细胞三维生长，实现真正的三维培养。
以下结合附图和实施例对本实用新型进行详细说明；附
图1为本实用新型的培养器中培养物尺寸d和悬浮培养所需最低转速示意图；附图2为本实用新型的隔离器结构示意图；附图3为本实用新型的三维培养器结构示意图；附图4为内筒、中筒和外筒的转速及半径示意图；附图5为本实用新型三维培养器的输液-排液路径方块图附图6为本实用新型三维培养器的输气-排气路径方块图其中细胞培养室1 液/液交换膜2 培养液流动室3进液管4 代谢物出液管5 隔离器6气室7 气/液交换膜8 进气口9出气口10 变速器11、12 马达13、14支架15底座16 培养器主体17内筒18中筒19 外筒20
培养液流动管21培养液进口22 代谢物出口23代谢物环形回流通道24 密封圈25 储液器26液泵27输液管道28阻尼器29透析器30 气/液交换器31 代谢物收集器32气源33稳压、调压阀34输气管道35、36余气收集器37 内筒半径R1中筒半径R2外筒半径R3内筒转速ω1中筒转速ω2外筒转速ω3实施例1按图3制作一台应力可调控旋转式细胞/组织三维培养器，包括由气室7、细胞培养室1、培养液流动室3三层同心圆筒套装构成的培养器主体17、底座16上固定的支架15、由马达和变速器组成的传动机构，供液-排液及供气-排气系统，其特征在于筒壁上设有篓孔的内筒18外表面贴敷有液/液交换膜2，其内腔为培养液流动室3，半径为R1，由马达13驱动的变速器11带动培养液流动室3的轴转动，培养液流动室3随轴一起以角速度ω1旋转，通过贴敷在培养液流动室3外表面上的液/液交换膜2与细胞培养室1进行物质交换，细胞获得营养，排出代谢产物；筒壁上设有篓孔的中筒19外表面贴敷有气/液交换膜8，其内腔为细胞培养室1，半径为R2，由另一套马达14驱动的变速器12带动细胞培养室1的轴转动，细胞培养室1随轴一起以角速度ω2旋转；外筒20筒壁上设有进气孔9和出气孔10，其内腔为气室7，由进气口9进入的新鲜气体，在气室7中通过贴敷在细胞培养室1外表面上的气/液交换膜8进行气体交换，为细胞培养室1提供氧气，交换的二氧化碳气由出气口10排出，作为气室7的外筒20固定在支架15上，不作轴向旋转，而作为培养液流动室3的内筒18和作为细胞培养室1的中筒19分别由各自的由马达13、14和变速器11、12组成的传动机构驱动作轴向旋转，其轴向旋转的角速度ω1和ω2相同或不同，作为培养液流动室3的内筒18中同心地设置一根培养液流动管21，其进口端的内筒上安装一与支架15固定的隔离器6，隔离器6为一空心圆柱体，其内部径向设置与其中心线垂直的培养液进口22和代谢物出口23，培养液进口22和代谢物出口23中分别安装进液管4和出液管5，进液管4与内筒中设置的培养液流动管21的相连通，出液管5与内筒内腔中的代谢物环形回流通道24相连通，液泵19将新鲜培养液从固定在隔离机构6培养液进口管4泵入，隔离器6中培养液进口22和代谢物出口23之间及代谢物出口2的另一侧分别设置将其密封隔开的密封圈25，供气-排气系统包括气源、气泵及输气管道，与气泵相连的输气管道上装有调压、稳压阀并与外筒20上的进气口9相连通，进气口9入口处设有进气滤膜，外筒20上的出气口10通过输气管道连通余气收集器。供液-排液系统包括培养液储液器、液泵及输液管道，与液泵相连的输液管道与隔离器6上的培养液进液管4相连通，隔离器6上的代谢物出液管5通过输液管道连通阻尼器，阻尼器出口连通培养液透析器，培养液透析器出口分别连通代谢物收集器及气/液交换器，气/液交换器连通培养液储液器，培养液储液器出口通过输液管道及隔离器6上的进液管4与位于内筒18中的培养液流动管21相连通。
平行的两支架15支撑培养器主体17，一个马达14固定其上；16为底座，另一个马达固连其上培养液供液-排液系统的路径，如图5所示，在图中26为鲜培养液储液器，27为流量、压力可调的液泵，28为培养液输液管道，它与培养液进口管4相连，进入培养液流动室3经代谢物出口管5流出，29为阻尼器，可采用可调节软管松紧的夹持在输气管道的气管夹子，其作用是调节细胞培养室1内的气体压力分布，30是培养液透析器，31是气/液交换器，培养器主体用聚碳酸脂材料制作，交换膜用市售的半透膜，以上所用的其他部件均是普通市售的，32是代谢物收集器，供液-排液系统中液泵27将新鲜培养液从储液器26通过输液管道28经进液管4输入培养液流动室3，通过贴敷在培养液流动室3筒壁上的液/液交换膜2，为细胞培养室1提供养份，代谢物经出口管5流出，流出培养器的液体中，由于含有新鲜培养液，为节约原料，降低成本，将流出的液体通过阻尼器29送入培养液透析器30进行透析，透析后，将分离出来的代谢产物流入代谢产物收集器32，经透析的培养液流经气/液交换器31，调节培养液的氧含量和PH值，并添加营养和生长因子后流回培养液存储器26，以供循环使用。
供气-排气系统的路径，如图6所示，在图中33为气源，为一储有氧气的气瓶，34为稳压、调压阀，市售的气体稳压、调压阀，35为输气管道，36为输气管道，均为普通气管，37为余气收集器；气源33中的新鲜气体经稳压、调压阀34调压后，由输气管道35经进气口9进入气室7，在气室7经气/液交换膜8进行气体交换，为细胞培养室1提供氧气，交换后的二氧化碳气体由气室7的出气口10和输气管道36流至余气收集器37。
实施例2使用实施例1的培养器进行人胃癌细胞悬浮培养，微载体可用一般材料，温度、pH值条件和常规的细胞培养相同。只是在必要时加入高分子右旋糖酐添加物来调节培养液的粘度和密度，以利于培养物悬浮，并改变介质剪应力水平。其次，为维持细胞生长化学微环境的稳态，必须保证足够的氧和营养的供应，并能及时带走代谢产物。本实施例中的供气供液系统对气室供气的供气流量为0.4-10ml/min，供液-排液系统对细胞培养室供液的供液流量为0.1-10ml/min，在培养的初期，其培养器同步旋转的转速为5-40转/分。通过本实用新型的培养器合理的流体力学设计，既可形成一定强度的对流扩散，又可将流体动力控制在一个合理的范围内，不致损伤细胞或导致细胞结构，功能的质的改变。
本实施例的培养条件与常规工艺的培养条件相同，特点是培养器内应力可调控，即在细胞培养之初，作为细胞培养室的中筒及作为培养液流动室的内筒轴向同步旋转，此时，细胞培养室内应力分布趋于零，随着细胞培养过程细胞聚集体的形成，调控细胞培养室内的剪应力由零剪应力到所培养细胞/组织的生理应力。
本实施例所述的细胞培养器内剪应力的调控是这样实现的在细胞培养之初，内筒和中筒同步旋转，转速ω1＝ω2，其转速决定于不同培养物的尺度在培养介质中的悬浮，即为胃癌细胞悬浮的最小角速度；随着细胞培养过程细胞聚集体的形成，内筒和中筒的轴向旋转由同步变为差动旋转，ω1≠ω2，并且可调控。
本实施例所述的细胞培养器内剪应力的调控液液可这样实现通过调节内筒的转速和/或通过供液-排液系统中阻尼器调节液泵的输出压力和/或调节液泵的输出压力改变培养液流动室内的压力分布，来改变细胞培养室内的二次流。
本实施例所述的细胞培养器内剪应力的调控还可以这样实现通过供气-排气系统改变气室内压力，来调节细胞培养室内的压力。
本实施例所述的细胞培养器内剪应力的调控又可以这样实现通过在培养液中加入调节细胞培养室内介质粘度，改变剪应力的添加物，添加物为dextran2000T高分子右旋糖酐。
权利要求1.一种应力可调控旋转式细胞/组织三维培养器，包括由气室、细胞培养室、培养液流动室三层同心圆筒套装构成的培养器主体、底座上固定的支架、由马达和变速器组成的传动机构，供液-排液及供气-排气系统，其特征在于筒壁上设有篓孔的内筒外表面上贴敷有液/液交换膜，其内腔为培养液流动室，筒壁上设有篓孔的中筒外表面上贴敷有气/液交换膜，其内腔为细胞培养室，外室筒壁上设有进气孔和出气孔，其内腔为气室，作为气室的外筒固定在支架上，不作轴向旋转，而作为培养液流动室的内筒和作为细胞培养室的中筒分别由各自的由马达和变速器组成的传动机构驱动作轴向旋转，其轴向旋转的角速度相同或不同，作为培养液流动室的内筒中同心地设置一根伸至超出培养液流动室筒壁上设置的液/液交换膜的轴向边缘的细长培养液流动管，其进口端的内筒上安装一与支架固定的隔离器，隔离器为一空心圆柱体，其内部径向设置与其中心线垂直的培养液进口和代谢物出口，培养液进口和代谢物出口中分别安装进液管和代谢物出液管，进液管与内筒中设置的培养液流动管相连通，代谢物出液管与内筒中培养液流动管管外的空腔，即代谢物环形回流通道相连通，隔离器中培养液进口和代谢物出口之间设置将其密封隔开的密封圈；供气-排气系统包括气源、气泵及输气管道，与气泵相连的输气管道与外筒上的进气口相连通；供液-排液系统包括培养液储液器、液泵及输液管道，与液泵相连的输液管道与隔离器上的培养液进液管相连通。
2.按权利要求1所述的所述的应力可调控旋转式细胞/组织三维培养器，其特征在于气源与气室相连的输气管道上设有稳压、调压阀，气室的出气口通过输气管道连接余气收集器。
3.按权利要求1所述的所述的应力可调控旋转式细胞/组织三维培养器，其特征在于隔离器上的代谢物出液管通过输液管道连通阻尼器，阻尼器出口连通培养液透析器，培养液透析器出口分别连通代谢物收集器和气/液交换器，气/液交换器连通培养液储液器，储液器出口通过输液管道与隔离器上的进液管相连通。
专利摘要本实用新型涉及应力可调控旋转式细胞/组织三维培养器,由三层同心圆筒套装的内、中、外筒即培养液流动室、细胞培养室、气室,内、中筒筒壁上分别有液/液交换膜和气/液交换膜,并分别作轴向旋转,角速度相同或不同,与液泵相连的输液管道与内筒内的流动管进口相通,与气泵相连的输气管道与气室进气口相通;将培养物、培养液装入培养器内,培养器内剪应力随着细胞聚集体的形成,从零调控至培养细胞/组织的生理应力。
文档编号C12M3/00GK2396058SQ99254070
公开日2000年9月13日 申请日期1999年11月16日 优先权日1999年11月16日
发明者陶祖莱, 姚永龙, 张奕毅, 高宇欣 申请人:中国科学院力学研究所