的改良，令其在pH4.0下乳酸产量为出发野生菌株的3倍；Gao等（2012)通过两轮基因 组重排，使ClostridiumacetobutylicumCICC8012 产Acetone-Butanol-Ethanol(ABE) 提高了 34. 53%;Ge等（2012)通过基因组重排获得SaccharomycescerevisiaeGS3-10， 其对五碳糖和六碳糖的转化率达到69. 48 %和100%，而出发菌株为14. 83 %和100%， 乙醇产率达到47.08g/L，而出发菌株为18. 12g/L;Kang等（2011)通过基因组重排，使 Aureobasidiumpullulans产普鲁蓝多糖大幅度提高，并且遗传稳定；Zheng等（2010)通 过基因组重排提高了SporolactobacillusinulinusATCC15538的D-乳酸产率和耐 酸性；John等（2008)通过原生质体融合式的基因组重排，获得了以木薯-甘蔗渣为基质 的乳酸高产菌株；Yu等（2008)通过基因组重排获得了糖耐度提高从而乳酸产率增加的 Lactobacillusrhamnosus;Wang等（2007)通过基因组重排获得了耐酸度提高从而乳酸产 率增加的Lactobacillusrhamnosus。
[0024] 基因组重排也为进行微生物代谢组学分析提供了支撑。经过基因组重排而代谢 优化的目的菌其遗传背景来源于出发菌，故通过比对目的菌与出发菌的蛋白表达谱差异， 辅以代谢流和代谢控制分析技术，即可解析导致代谢优化的关键酶及有关途径的调控机 制。Luo等（2012)通过基因组重排使StreptomycesgilvosporeusATCC13326 的游霉素 (natamycin)产率明显升高，StreptomycesgilvosporeusATCC13326 的蛋白表达谱发生 明显改变，34种蛋白表达上升而20种蛋白表达下降，提示与游霉素合成有关的牵涉广泛的 代谢网络得到优化；Zhang等（2010)通过基因组重排，使Propionibacteriumshermanii产 VB12大幅度提高，重排后菌株38种蛋白表达发生改变，其中22种蛋白表达上升而16种蛋白 表达下降，在表达上升的22种蛋白中，有6种是VB12合成途径中的酶，提示与VB12合成有关 的牵涉广泛的代谢网络得到优化。
[0025] 但目前基因组重排在策略上存在一定缺陷，主要是选育培养基与发酵培养基之间 无关联，使得选育到的菌株在发酵时目标产物产率远低于预期。针对此问题，本发明在进行 基因组重排选育时，选育平板中添加一定比例的发酵培养基组分，而发酵培养基中添加一 定比例的选育平板组分，使得选育与发酵两环节之间形成关联，保障了选育环节表现出高 产表型的菌株在发酵时依然表现出高产表型，此即为本发明的底物诱导适应性策略。因此， 在对纳豆芽孢杆菌高产NK兼PQQ表型进行基因组重排选育时，在选育平板中添加一定比例 黄米汁，而在黄米汁发酵时则添加一定比例豆芽汁。
【发明内容】
[0026] 本发明提供了 一种食疗黄米汁的制备方法。本发明在基因组重排技术基础上进一 步采用底物诱导适应性策略，对纳豆芽孢杆菌所有可能与NK和PQQ合成有关的主流及旁支 途径统筹优化，实现多位点协同突变，进而通过高通量筛选使多位点协同突变的表型从突 变库中凸显，获得能够在黄米汁发酵中高产NK兼PQQ的纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-308。 同时，通过随机诱变获得甲硫氨酸营养缺陷（Me〇干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei Shirota-Met?LcS-Me〇。LcS-Met-在生长速度上高于BN-NKPQQ-RWX-308,但前者对后者 营养依赖，两者之间形成稳定共生关系，保障了共发酵顺利完成，从而获得富含NK和PQQ的 黄米汁。
[0027] 一种食疗黄米汁的制备方法，包括以下步骤：
[0028] 1)、将产NK兼PQQ的纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263分别进行亚硝基 胍诱变；然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，在基因组重排技术基础上进一步 采用底物诱导适应性策略，高通量筛选得到高产NK兼PQQ的纳豆芽孢杆菌，命名为纳豆芽 孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-308 ;
[0029] 细胞融合传代培养实现基因组改组，使纳豆芽孢杆菌10261和10623所有诱变后 代的优势突变得到优化整合。如有必要，可对融合后代进行第二轮或者多轮诱变及融合，直 至选育出NK兼PQQ产率高且生长旺盛、遗传稳定、适合作为生产菌株的高产NK兼PQQ纳豆 芽孢杆菌。
[0030] 2)、将干酪乳杆菌（LactobacilluscaseiShirota)进行亚硝基胍诱变，从中筛选 出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌LcS-Meif(Lactobacilluscasei Shirota-Met-)；
[0031] 3)将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-308和干酪乳杆菌LcS-Met_共发酵黄米汁，得 到富含NK和PQQ的黄米汁。
[0032] 本发明在基因组重排技术基础上进一步采用底物诱导适应性策略，对纳豆芽孢杆 菌所有可能与NK和PQQ合成有关的主流及旁支途径统筹优化，实现多位点协同突变，进而 通过高通量筛选使多位点协同突变的表型从突变库中凸显，获得能够在黄米汁发酵中高产 NK兼PQQ的纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-308。同时，通过随机诱变获得甲硫氨酸营养缺陷 (Met)干酷乳杆菌LcS-Met。
[0033] 欲使干酪乳杆菌与纳豆芽孢杆菌顺利共发酵，两者之间应形成共生关系。本发 明的策略是使通常情况下竞争占优的干酪乳杆菌成为甲硫氨酸营养缺陷（LcS-MeO,从 而在代谢上对纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-308形成依赖，其所需要的甲硫氨酸（Met) 由纳豆芽孢杆菌供给，即形成严格的偏利共生关系。虽然LcS-Mef在生长速度上高于 BN-NKPQQ-RWX-308,但前者对后者营养依赖，两菌之间形成稳定共生关系，保障了共发酵顺 利完成，从而获得富含NK和PQQ的黄米汁。
[0034] 所用纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌均属于食品级安全微生物，共发酵得到的富含NK 和PQQ的黄米汁中，PQQ含量达到79-110ng/mL，高于天然食品中含量最高的纳豆（55-63ng/ mL)和豆腐（25-30ng/mL)。NK活力达到402-753U/mL。所获得的黄米汁富含纳豆激酶和吡 咯喹啉醌，具有黄米汁固有的滋味和发酵后特有的风味。
[0035] 步骤1)中，纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263采用现有技术，纳豆芽孢 杆菌10261来自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝阳区酒仙桥中 路24号院6号楼；保藏日期为2002年，菌种保持编号为10261 ;纳豆芽孢杆菌10263来自中 国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼； 保藏日期为2002年，菌种保持编号为10263;干酪乳杆菌（LactobacilluscaseiShirota) 来自养乐多（上海）有限公司；小鼠抗PQQIgG单抗PQQ-mAb采用市售产品，购自嘉兴元科 生物科技有限公司，商品号为YK-Ab-013。
[0036] 所述的底物诱导适应性基因组重排后的高通量筛选具体包括：①制备2个平板豆 芽汁黄米汁固体培养基（黄米汁占平板总量的10% -15%，使得选育培养基与发酵培养基 之间发生关联，此即为本发明的底物诱导适应性策略），其中一个将小鼠抗PQQIgG单抗 PQQ-mAb配入，形成平板A，另一个将琼脂糖-纤维蛋白配入，形成平板B;②将纳豆芽孢杆 菌10261和纳豆芽孢杆菌10263的诱变融合后代涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印 至另一个平板，使平板A和平板B互为影印平板；③平板A中，高产PQQ诱变融合后代菌落 周围形成肉眼可见沉淀线，根据沉淀圈直径大小可肉眼判断产PQQ量大小；④平板B中，高 产NK诱变融合后代菌落周围形成透明圈，根据透明圈直径大小可肉眼判断产NK活力高低； ⑤平板A与平板B中，高产PQQ菌落与高产NK菌落处于同一位置者，即为高产NK兼PQQ的 纳豆芽孢杆菌。
[0037] 所获得的高产NK兼PQQ的纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-308保藏于斜面豆芽汁黄 米汁固体培养基中。
[0038] 所述的平板豆芽汁黄米汁固体培养基和斜面豆芽汁黄米汁固体培养基以1L计， 由以下量的组分组成：
[0039] 黄米汁 100?150mL;
[0040] 鹿糖 4.0?6.0g; 琼脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
[0041] 进一步优选，所述的平板豆芽汁黄米汁固体培养基和斜面豆芽汁黄米汁固体培养 基以1L计，由以下量的组分组成：
[0042] :设米汀 100?150mL; 蔗糖 5.0g; 琼脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
[0043] 所述的豆芽汁的制备：刚出芽的大豆500g，加水2500mL，煮沸浓缩至1000mL后过 滤，得到豆芽汁。
[0044] 该平板豆芽汁黄米汁固体培养基的配方有利于纳豆芽孢杆菌菌落形成和高通量 筛选。该斜面豆芽汁黄米汁固体培养基的配方有利于纳豆芽孢杆菌保藏。