; 柠檬酸氢二铵 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸钠 5.0g; 磷酸氢二钾 2.0g; 硫酸镁 0.58g; 硫酸锰 0.25g; 吐温 80 l.OmL； 水 余1￡; pH6.2 ?6.4
[0096] 该MRS液体培养基有利于干酪乳杆菌增殖培养。
[0097] (e)所述的MRS固体培养基（平板）配制完成后，121°C灭菌15min，以1L计，由以 下量的组分组成：
[0098] 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 梓檬酸氧二按 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸钠 5.0g; 磷酸氢二钾 2.0g; 硫酸镁 0.58g; 硫酸锰 0.25g; 琼脂 20g; 吐温 80 l.OmL； 水 余量； pH6.2 ?6.4
[0099] 该MRS固体培养基有利于干酪乳杆菌菌落形成和筛选。
[0100] (f)所述的MRS固体培养基（斜面）配制完成后，121°C灭菌15min，以1L计，由以 下量的组分组成：
[0101] 蛋白胨 l〇.〇g; 牛肉膏 l〇.〇g;
[0102] 酵母膏 5.0g; 柠檬酸氢二铵 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸钠 5.0g; 磷酸氢二钾 2.0g; 硫酸镁 0.58g; 硫酸锰 0.25g; 琼脂 20g; 吐温 80 l.OmL； 水 余量； pH6.2 ?6,4 倒试管斜面
[0103] 该MRS固体培养基（斜面）有利于干酪乳杆菌保藏。
[0104] (g)所述的含黄米汁的发酵培养基以1L计，由以下量的组分组成：
[0105] 鹿糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麦芽糖 20.0g; V芽丨卜 lOOmL； 黄米汁 余量。
[0106] (h)黄米汁的制备包括：1000mL水中加210g黄米，浸泡7小时后，95°C碾磨成浆 汁。
[0107] 本发明实施例中，纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263采用现有技术，纳豆 芽孢杆菌10261来自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝阳区酒仙 桥中路24号院6号楼；保藏日期为2002年，菌种保持编号为10261;纳豆芽孢杆菌10263 来自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC)，地址：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院 6号楼；保藏日期为2002年，菌种保持编号为10263;干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei Shirota)来自养乐多（上海）有限公司；小鼠抗PQQIgG单抗PQQ-mAb采用市售产品，购 自嘉兴元科生物科技有限公司，商品号为YK-Ab-013。
[0108] 实施例1
[0109] 本发明通过纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌选育及其共发酵制备富含NK和PQQ的黄 米汁，包括以下步骤：
[0110] (1)高产NK兼PQQ的纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-308的选育
[0111] 采用底物诱导适应性策略，通过基因组重排及高通量筛选技术获得高产NK兼PQQ 的纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-308,具体方法为：首先构建纳豆芽孢杆菌突变库，将已获 得的产NK兼PQQ的纳豆芽孢杆菌10261和10263分别进行亚硝基胍诱变；然后混合二者诱 变后代，进行细胞融合（促融剂为聚乙二醇4000)，传代培养，实现基因组改组，使纳豆芽孢 杆菌10261和10623所有诱变后代的优势突变得到优化整合，选育出NK兼PQQ产率高且生 长旺盛、遗传稳定、适合作为生产菌株的高产NK兼PQQ的纳豆芽孢杆菌。
[0112] 突变库高通量筛选：①制备2个豆芽汁黄米汁固体培养基平板（黄米汁占平板总 量的10-15 %，使得选育培养基与发酵培养基之间发生关联，此即为本发明的底物诱导适应 性策略），其中一个将小鼠抗PQQIgG单抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一个将琼脂糖-纤 维蛋白配入，形成平板B;②将纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263的诱变融合后代 涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个平板，使平板A和平板B互为影印平板； ③平板A中，高产PQQ诱变融合后代菌落周围形成肉眼可见沉淀线，根据沉淀圈直径大小可 肉眼判断产PQQ量大小；④平板B中，高产NK诱变融合后代菌落周围形成透明圈，根据透明 圈直径大小可肉眼判断产NK活力高低；⑤平板A与平板B中，高产PQQ菌落与高产NK菌落 处于同一位置者，即为高产NK兼PQQ的纳豆芽孢杆菌。所获得的高产NK兼PQQ的纳豆芽 孢杆菌命名为BN-NKPQQ-RWX-308,保藏于豆芽汁黄米汁固体培养基（斜面）中。
[0113] (2)甲硫氨酸营养缺陷（Me〇的干酪乳杆菌（LcS-MeO的选育
[0114] 将干酪乳杆菌（LactobacilluscaseiShirota)进行亚硝基胍诱变，从中筛选出 甲硫氨酸营养缺陷型（LcS-MeO。
[0115] LcS-Metl帝选：①制备2个MRS固体培养基平板，其中一个将甲硫氨酸（Met)配 入（平板C，Met添加量为10-15mg/L)，另一个为单纯MRS平板（平板D);②将干酪乳杆菌 (LactobacilluscaseiShirota)的诱变后代涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至 另一个平板，使平板C和平板D互为影印平板；③在平板C与平板D的同一位置，平板C出 现菌落而平板D未出现菌落，或平板C上的菌落显著大于平板D上的菌落，则该菌落甲硫氨 酸营养缺陷型干酪乳杆菌，命名为LcS-Mef，保藏于MRS固体培养基（斜面）中。
[0116] (3)BN-NKPQQ-RWX-308 的活化培养
[0117] 将保存于豆芽汁黄米汁固体培养基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-308取一环，接种 至豆芽汁黄米汁液体培养基活化，培养温度35°C，培养结束菌种密度达到109cfu/mL左右。
[0118] (4)LcS_Met-的活化培养
[0119] 将保存于MRS固体培养基（斜面）中的LcS-Met_取一环，接种至MRS液体培养基 37°C活化培养，培养结束菌种密度达到109cfu/mL左右。
[0120] (5)富含NK和PQQ的黄米汁的发酵制备
[0121] 将活化的BN-NKPQQ-RWX-308与LcS-Met_混合，使混合菌液中二者密度比为 1:2 (1X108CFM/mL: 2X108CFM/mL)，混合菌液以1 %接种量接种含黄米汁的发酵培养基， 42°C六层纱布封口培养24h，得到富含NK和PQQ的黄米汁。含黄米汁的发酵培养基中所含 豆芽汁、酪氨酸、谷氨酸和麦芽糖对BN-NKPQQ-RWX-308合成NK和PQQ进行代谢调控，豆芽 汁有利于纳豆芽孢杆菌增殖，麦芽糖有利于NK合成，而PQQ由酪氨酸和谷氨酸通过肽键连 接环化而成。发酵结束后，黄米汁中NK活力402U/mL，PQQ含量79ng/mL。所获得的黄米汁 富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌，具有黄米汁固有的滋味和发酵后特有的风味。
[0122] 实施例2
[0123] 本发明通过纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌选育及其共发酵制备富含NK和PQQ的黄 米汁，包括以下步骤：
[0124] (1)高产NK兼PQQ的纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-308的选育
[0125] 采用底物诱导适应性策略，通过基因组重排及高通量筛选技术获得高产NK兼PQQ 的纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-308,具体方法为：首先构建纳豆芽孢杆菌突变库，将已获 得的产NK兼PQQ的纳豆芽孢杆菌10261和10263分别进行亚硝基胍诱变；然后混合二者诱 变后代，进行细胞质融合（促融剂为聚乙二醇4000)，传代培养，实现基因组改组，使纳豆芽 孢杆菌10261和10623所有诱变后代的优势突变得到优化整合，选育出NK兼PQQ产率高且 生长旺盛、遗传稳定、适合作为生产菌株的高产NK兼PQQ的纳豆芽孢杆菌。
[0126] 突变库高通量筛选：①制备2个豆芽汁黄米汁固体培养基平板（黄米汁占平板总 量的10-15 %，使得选育培养基与发酵培养基之间发生关联，此即为本发明的底物诱导适应 性策略），其中一个将小鼠抗PQQIgG单抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一个将琼脂糖-纤 维蛋白配入，形成平板B;②将纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263的诱变融合后代 涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个平板，使平板A和平板B互为影印平板； ③平板A中，高产PQQ诱变融合后代菌落周围形成肉眼可见沉淀线，根据沉淀圈直径大小可 肉眼判断产PQQ量大小；④平板B中，高产NK诱变融合后代菌落周围形成透明圈，根据透明 圈直径大小可肉眼判断产NK活力高低；⑤平板A与平板B中，高产PQQ菌落与高产NK菌落 处于同一位置者，即为高产NK兼PQQ的纳豆芽孢杆菌。所获得的高产NK兼PQQ的纳豆芽 孢杆菌命名为BN-NKPQQ-RWX-308,保藏于豆芽汁黄米汁固体培养基（斜面）中。
[0127] (2)甲硫氨酸营养缺陷（Me〇的干酪乳杆菌（LcS-MeO的选育
[0128] 将干酪乳杆菌（LactobacilluscaseiShirota)进行亚硝基胍诱变，从中筛选出 甲硫氨酸营养缺陷型（LcS-MeO。
[0129]LcS-