一种烟叶在线醇化酶制剂及其制备方法

专利名称：：一种烟叶在线醇化酶制剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及烟叶加工
技术领域：
，具体地说是一种用于烟叶在线醇化的酶制剂及其制备方法。技术背景在烟叶最后进入到巻烟机之前，巻烟制造历经了烟叶田间生产、收获、初烤、等级评定及流通环节、复烤、发酵或醇化、烟叶调配、备料、分片、真空回潮、定量喂料、超回加料、预配贮叶、切丝、烘丝、贮丝等重要的生产过程。其中，烟叶调配、备料、分片、真空回潮、定量喂料、超回加料、预配贮叶、切丝、烘丝、贮丝等是巻烟制造过程中的一系列在线处理过程。烟叶在线处理对于提高巻烟质量、优化组叶配方、改善巻烟香味及吃味至关重要。然而，由于烟叶本身在种植过程中自然环境和种植水平的差异，导致同一品种、同一部位的烟叶都存在不同的质量缺陷，在线处理环节中的加香加料工艺虽然在一定程度上能起到修饰和掩盖缺陷、赋予巻烟新风味的作用，但是由于其添加的多是人工合成的香精香料，无法从本质上改善烟叶品质。因此，如何改良烟叶在线处理技术工艺以去除烟叶质量缺陷、提高和稳定巻烟品质成为巻烟企业多年来关注的技术难题。而本发明专利即是针对这一技术难题而研究开发的。烟叶内在质量由香气、吃味、刺激性及生理强度构成，这些质量特点主要是通过新鲜烟叶初烤、复烤及发酵(醇化)等环节的内在物质，即底物的酶解作用而显露出来的。对于烟叶底物的酶解机理研究，早在1950年Frankenburg就提出了烟叶内含物的酶催化理论框架，随着研究的深入和积累，各国科学家及研究人员一致认为，烟叶内在底物的酶催化类型以氧化还原为主，而且这种酶解过程是多种酶联合作用下完成的，最终达到底物向多种香气物质成分有效转化的结果。这些酶促反应过程主要包括一下几个方面1、萜烯类化合物降解过程类胡萝卜素是烟叶中最重要的一类萜烯化合物，而类胡萝卜素是一类风味和香气物质的前体物质，类胡萝卜素很容易被氧化，其分子中的多烯烃链可在多处断裂，产物主要有C13、Cu、d。、"等降解物，可生成一大类挥发性芳香化合物，有不少是烟草中关键的致香成分，如紫罗兰酮、大马酮、巨豆三烯酮等，它们对巻烟吸食品质有重要影响。2、Mailard反应该反应过程是还原糖和氨基酸经分子重排后生成56种杂环化合物一类黑素，使烟叶表现陈烟香气。尽管Mailard反应本身不是由酶催化的反应，但其底物一还原糖和氨基酸是酶促反应的产物。蛋白质在蛋白酶的作用下水解成氨基酸，淀粉和糖在水解酶的作用下水解生成葡萄糖、果糖等还原糖。因此，促进多糖和蛋白质的转化将有利于Mailard反应的进行。3、叶绿素的降解反应烟叶中叶绿素的含量与烟叶品质有关，因为在烟叶调制过程中，叶绿素的降解是烟叶黄色品质形成和香气物质形成的基础。如果调制后的烟叶中残留的叶绿素过多，会使烟叶产生青杂气。具体原理是，叶绿素在叶绿素氧化酶作用下被降解。即在叶绿素降解过程中产生的叶绿醇(植醇)脱水可产生新植二烯，而新植二烯在烟草挥发物性中含量最大，其本身是一种C2。聚类异戊二烯，是烟叶中重要的萜烯类化合物，也是烟草中一种重要的致香物质，其本身具有清香气，并且新植二烯可进一步分解转化形成低分子香味成分，如新植二烯发生光氧化反应后产生植物呋喃。因此，新植二烯进一步降解的产物能增加烤烟香气。尽管烟叶叶绿素绝大部分已经在烟叶烘烤过程中被降解，但残存的叶绿素仍然会对巻烟制品带来不良影响，所以，促进烟叶中残存叶绿素的降解能有效改善烟叶品质。4、游离烟碱降解，消除强烈刺激性和不良余味烟碱被烟碱氧化酶降解主要通过吡啶途径产生多种致香物质，烟碱的吡咯烷被氧化脱氢并自发水解打开，生成吡啶化合物——烟酸，烟酸又可与脱氨作用中的氨气化合形成维生素P(烟酰胺)，吡啶环也可通过羟基化被打开，相应降解物有3-吡啶基甲基酮、3-吡啶基丙酮、可的宁等。5、蛋白质降解与易分解氨氮化合物的脱氨挥发作用蛋白质是烟叶含氮化合物中含量最丰富的一大类组成性成分，过高的蛋白含量对巻烟具有极为明显的不利影响，其降解的中间产物氨基酸为多种生理生化过程的顺利完成提供物质准备。蛋白质和其他含氮化合物在蛋白酶和氨基化合物脱氨酶作用下产生各种有机酸和氨气，如a-酮酸、a-酮戊二酸、草酰乙酸等。氨气在发酵过程中挥发掉，而各种有机酸与烟叶中的游离烟碱结合形成有机酸盐，使游离烟碱变成结合态，减少了烟叶中游离烟碱的含量，显著降低了烟气的刺激性。以上五个方面是烟叶内含物(糖类、含氮化合物及其它化学成分)在生物酶调控参与条件下发生的主要酶促反应过程，这些反应过程对提高烟叶内在品质、协调化学成分、改善烟叶可用性至关重要。然而，烟叶在烘烤过程中的高温和干燥脱水使烟叶内酶群的活力丧失殆尽，因此上述酶促反应无法进行，从而导致了烟叶在经历自然(或人工)发酵后，烟叶仍然会存在诸多质量缺陷。由于生物酶具有高效催化、专一性强的特点，因此，通过烟叶在线处理过程中添加专一性酶系或复合酶种在短时间内快速促进烟叶内含物转化，从而可以达到进一步增加烟叶香气、改善烟叶质量缺陷的目的。张立昌报道了一种适合在打叶复烤时添加的酶制剂，对自然醇化和人工发酵烟叶的质量有明显的改善作用。该酶制剂可明显增加巻烟香气，减轻青杂气和刺激性，改善巻烟吸味品质。赵铭钦等利用4种具有生物活性的ci-淀粉酶、蛋白酶等配制而成的烟草发酵增质剂进行烟叶发酵，试验表明烟叶香气质改善、香气量增加、烟叶固有杂气和刺激性减轻，烟叶内部的糖、氮、碱等主要化学成分及其比值趋于协调、平衡。在这些研究过程中所用的酶主要为糖化酶、纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶。阮祥稳等申请的中国专利CN200510042773.7公开了一种由多种外源生物酶(纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、淀粉酶、糖化酶)及酵母粉组成的复合酶制剂，其特征在于多种生物酶及酵母粉按照特定的比例直接进行组配。专利CN03114578.7公开了由纤维素酶、蛋白酶、转化酶、麦芽糖酶、溶菌酶组成的酶制剂。武怡等(CN1947604)等公开了一种烟叶在线改性处理生物隧道装置，但对处理过程中使用的酶制剂没有进行描述。以上文献和专利的共同特征，一是外源(微)生物酶的组配利用，二是其作用环节是针对烟叶发酵，而且他们采用的酶均是来自于商业化酶。
发明内容本发明的目的是提供一种烟叶在线醇化酶制剂及其制备方法，该酶制剂由复合酶组成，其酶群均来源于新鲜烟叶，具有安全、高效、活性可靠及针对性强的特点，满足了巻烟工业的烟叶在线醇化技术要求。烟叶在线处理特指巻烟生产企业通过生产线设备在封闭或半封闭条件下对烟叶原料进行一段连续的生产工艺处理过程，其目的在于通过控制一系列环境条件(温、湿度)、添加香精香料及改变烟叶物理性状(切丝)等，从而根据原料的功能特征进行组合配方而赋予巻烟制品新风味及适于进行巻烟的工艺要求。烟叶在线处理一般包括烟叶备料、分片、真空回潮、定量喂料、超回加料、预配贮叶、定量喂料、润叶加料、配叶贮叶、切丝、定量喂料、HT(高温)、烘丝、冷却以及其他下游处理过程，直至贮丝完成烟叶的在线处理。其中在润叶加料在线处理过程中施加生物活性酶，促使烟叶内含物(底物)在贮叶期间(2-4hr)内进行酶促分解，不利成分的转化达到了改善烟丝口腔余味、去除青杂气及烟香丰满的目的。本发明中的酶全部来源于新鲜烟叶，按照自主设计的一套生物酶纯化和活性保护措施，可得到主要包括葡萄糖氧化酶、叶绿素氧化酶、类胡萝卜素氧化酶、蛋白酶、烟碱氧化酶在内的复合型酶制剂。制备环节包括新鲜烟叶组织匀浆、酶群纯化、辅基置换分子f彦饰及蔗糖低聚物保护，最后得到由葡萄糖氧化酶、叶绿素氧化酶、类胡萝卜素氧化酶、蛋白酶及烟碱氧化酶五类酶组成的复合酶制剂。具体生产工艺如下1、取鲜活烟叶或顶杈，破碎细胞得汁液，按体积比V缓冲is:V汁液二l:810加缓冲液A:0.1MTris-HCL'pH7.7,0.1MPMSF(苯甲基磺酰氟)，于4'C，2600g离心20min;2、取上清液，缓慢加入(NH4)2S04溶液(144g/L，即每升含(NH4)2S04144g)至饱和，4。C缓慢混合30min，4。C15000g离心40min;3、取上清液，加入等体积(NH4)2S。4溶液(390g/L,即每升含(NH4)2S04390g)，缓慢混合2小时或过夜，4°C15000g离心2h，收集沉淀，加缓冲液A:0.1MTris-HCL,pH7.7，0.1MPMSF(苯甲基磺酰氟)至沉淀充分溶解；4、溶解完全后，按1:0.10.2体积比加入缓冲液B:0.1MTris-HCl，pH7.7，0.1%EDTA(W/W)(乙二胺四乙酸)于4。C沉淀20min，8000g离心10min，获上清液，弃沉淀；5、上清液按1:0.0010.002体积比先后加入0.3%Ca(N03)2'4H20和0.2%MgS(V溶液，充分混匀，静置8—12小时或过夜；，6、按1:0.010.02体积比加入0.01%蔗糖低聚物溶液，静置1一1.5小时；溶液样品于-8'C干燥浓縮至原体积的1/8时停止，4'C解冻分装即获得烟叶在线醇化酶制剂原液。酶活测定按国标QB/T1803-93《工业酶制剂通用试验方法》执行。成品酶制剂在施用前用水稀释至0.10.3%，烟叶分片后在真空回潮至含水率15.5%时，均匀喷施于烟叶上，用量约50ml/50kg烟叶，酶促反应在lt叶柜中经2-4小时完成(具体施用方法见附图1)。本发明的烟叶在线醇化酶制剂的特点与效果本发明满足了巻烟在线的生产工艺要求，即酶制剂在烟叶真空回潮后添加(含水率至15.5%)，酶在后续的在线处理过程中发挥催化作用，快速促进底物转化。由于该酶制剂来源于新鲜烟叶，因此不存在一些食品添加剂的安全性问题，并且可增加烟叶纯正天然烟香，减少人工合成化合物的使用量，从而显著改善烟叶品质。与现有酶制剂相比，用本发明工艺生产的新型烟叶发酵酶制剂具有安全、针对性强、作用迅速的特点。具体表现在如下9个方面1、酶源安全性所有酶种都来自于新鲜烟叶，不存在食品安全方面的问题；2、酶制剂中含有的5种酶(葡萄糖氧化酶、叶绿素氧化酶、类胡萝'卜素氧化酶、蛋白酶、烟碱氧化酶)均来自于烟叶，可催化烟叶内相应底物的酶促氧化还原反应)，无需添加外源酶；3、降解烟叶残存叶绿素，消除青杂气；4、催化分解烟叶内部萜烯类化合物，为香气物质的产生提供前体，达到增强烟叶天然香气，发挥烟叶潜在品质；5、加速烟叶在线醇化的酸化过程；降低pH值一个单位，提高烟叶可用性；6、加快氨氮化合物脱氨挥发，降低烟叶总氮含量，减少刺激性，改善吃味；7、促进游离烟碱分解，降低巻烟刺激性；8、保持自然烟香，减少人工香精香料的使用量；9、酶活性在烘丝过程的高温下自然终止，达到可调控的目的。感官评吸结果表明，处理烟样品质有较明显改善，具体表现为劲头、刺激性减弱，香气质、口感得到改善。表1中，CKA1、CKB1和CKB2为对照烟样，7-Al、7-Bl和7-B2为处理样。(下同)表1酶制剂处理烟样评吸结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>吸烟机分析结果显示处理烟样与对照烟样相比，烟气总粒相物平均下降了8.4%，焦油量下降了5.1%,烟气烟碱量下降了28.0%，一氧化碳下降了1.6%，说明该酶制剂的在线处理有利于巻烟产品的降焦减害(表2)。表2吸烟机烟气分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>同时，常规化学成分分析结果表明，处理烟样与对照样相比，其烟碱下降9.3%，总氮下降5.7%，蛋白质下降7.1%，这一结果说明，通过该酶制剂的在线处理可进一步协调烟叶的内在化学成分(表3)。表3烟叶常规分析部分结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>图1是本发明的烟叶酶制剂在线处理工艺流程图。具体实施方式实施例1:1、取鲜活烟叶或顶杈，破碎细胞，按体积比VSM:V赚=1:9加缓冲液A:0.1MTris-HCL，pH7.7，0.1MPMSF，于4。C，2600g离心20min;2、取上清液，缓慢加入(NH4)2S(V溶液(144g/L)至饱和，4'C缓慢混合30min，于4。C，15000g离心40min;3、取上清液，加入等体积(NH4)2S(X溶液(390g/L)，缓慢混合2小时或过夜，于4。C，15000g离心2h，收集沉淀，加缓冲液A:0.1MTris-HCL,pH7.7,0.1MPMSF至沉淀充分溶解；4、溶解完全后，按1:0.1体积比加入缓冲液B:0.1MTris-HC1，pH7.7，0.1%EDTA(W/W)，于4。C沉淀20min，8000g离心10min，获上清液，弃沉淀；5、上清液按1:0.001体积比先后加入0.3%Ca(N03)24H20和0.2%MgS(X溶液，充分混匀，静置8—12小时或过夜；6、按1:0.01体积比加入0.01%蔗糖低聚物溶液，静置1一1.5小时；溶液样品于-8t干燥浓縮至原体积的1/8时停止，4'C解冻分装即获得烟叶在线醇化酶制剂原液。实施例2:1、取鲜活烟叶或顶杈，破碎细胞，按体积比Vg冲液:V汁液=1:10加缓冲液A:0.1MTris-HCL，pH7.7,0.1MPMSF，于4°C,2600g离心20min;2、取上清液，缓慢加入(NH4)2S04溶液(144g/L)至饱和，4。C缓慢混合30min，于4。C，15000g离心40min;3、取上清液，加入等体积(NH4)2S(V溶液(390g/L)，缓慢混合2小时或过夜，于4。C，15000g离心2h，收集沉淀，加缓冲液A:0.1MTris-HCL,pH7.7，0.1MPMSF至沉淀充分溶解；4、溶解完全后，按1:0.2体积比加入缓冲液B:0.1MTris-HC1,pH7.7，0.1%EDTA(W/W)，于4。C沉淀20min，8000g离心10min,获上清液，弃沉淀；5、上清液按1:0.002体积比先后加入0.3%Ca(N03)24H20和0.2%MgS04溶液，充分混匀，静置8—12小时或过夜；6、步骤5所得上清液再按1:0.02体积比加入0.01%蔗糖低聚物溶液，静置l一l.5小时；溶液样品于-8'C干燥浓縮至原体积的1/8时停止，4'C解冻分装即获得烟叶在线醇化酶制剂原液。以上实施例所得的醇化酶制剂按如下方法加入1、配制0.10.3%醇化酶制剂溶液，烟叶定量喂料后均匀喷施烟叶至含水率15.5%±1.5，设置清水对照；2、超回加料保持工艺条件(40_52°C，烟叶含水率18.5-20%)2hr;3、切丝保持含水率20.5士1.0;4、烘丝保持热风温度ll(TC，叶面温度85。C以上，45min;5、反应完成后对烟样进行专业评吸、吸烟机分析与常规化学分析；6、应用MATLAB统计分析软件进行数据分析。如图1所示，烟叶酶制剂在线处理工艺流程首先从鲜活烟叶中获取生物活性酶群，经活性保护后于烟叶在线处理过程中的"超回加料"前施加，酶反应经历预配贮叶、定量喂料、润叶加料、配叶贮叶、切丝、定量喂料六个生产工艺过程。在这一连续的在线处理(酶解反应)过程中，温度维持在40-52'C，烟叶含水率保持在15.5±1.521%±1.5，反应2-4小时后，酶活性在高温阶段受到抑制并在接下来的烘丝阶段(热风温度ll(TC)完全失活，酶制剂在线处理过程全部结束。权利要求1、一种烟叶在线醇化的酶制剂的制备方法，其特征在于按以下步骤进行1)取鲜活烟叶或顶杈，破碎细胞，按体积比V缓冲液∶V汁液＝1∶9～10加缓冲液A0.1MTris-HCL，pH7.7，0.1MPMSF，于4℃，2600g离心20min；2)取上清液，缓慢加入(NH4)2SO4溶液至饱和，4℃缓慢混合30min，4℃15000g离心40min；3)取上清液，加入等体积(NH4)2SO4溶液，缓慢混合2小时或过夜，4℃15000g离心2h，收集沉淀，加缓冲液A0.1MTris-HCL，pH7.7，0.1MPMSF至沉淀充分溶解；4)溶解完全后，按1∶0.1～0.2体积比加入缓冲液B0.1MTris-HCl，pH7.7，0.1％EDTA(W/W)于4℃沉淀20min，8000g离心10min，获上清液，弃沉淀；5)上清液按1∶0.001～0.002体积比先后加入0.3％Ca(NO3)2·4H2O和0.2％MgSO4溶液，充分混匀，静置8-12小时或过夜；6)按1∶0.01～0.02体积比加入0.01％蔗糖低聚物溶液，静置1-1.5小时；溶液样品于-8℃干燥浓缩至原体积的1/8时停止，4℃解冻分装即获得烟叶在线醇化酶制剂原液。2、一种用权利要求1所述的烟叶在线醇化的酶制剂的制备方法制备的烟叶在线醇化的酶制剂。3、权利要求2所述的烟叶在线醇化的酶制剂的应用，其特征在于成品酶制剂在施用前用水稀释至0.10.3%，烟叶分片后在真空回潮至含水率15.5%时，均匀喷施于烟叶上。全文摘要本发明是一种烟叶在线醇化酶制剂及其制备方法。主要解决烟叶在线工艺中在短时间内如何改善烟叶品质的技术问题。原料用新鲜烟叶或顶杈，经硫酸铵分级沉淀获得粗酶液后，用蔗糖低聚物完成酶活性保护，由此提高酶活性的稳定性和高效性，延长酶制剂的半衰期。酶制剂主要由氧化还原酶类组成，即葡萄糖氧化酶、叶绿素氧化酶、类胡萝卜素氧化酶、蛋白酶及烟碱氧化酶五类酶，这些酶全部来源于新鲜烟叶或顶杈，其配比均是自然生成，不添加任何外源酶。该酶制剂在烟叶的在线处理过程中用清水稀释至施用，酶促反应在烟叶柜中2-4小时内完成。该技术利用生物酶的专一性和高效性，在短时间内促进烟叶内含物转化，达到烟叶在线处理过程中提高烟叶品质的目的，满足卷烟企业生产工艺的要求。文档编号A24B15/00GK101260387SQ20081005818公开日2008年9月10日申请日期2008年3月14日优先权日2008年3月14日发明者何宝玉,勇谢,伟韩申请人:云南万芳生物技术有限公司