专利名称：脂质体异体、自体肿瘤疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制品的制备方法，即为肿瘤细胞抗原疫苗的制备方法。
应用肿瘤疫苗诱导肿瘤宿主产生抗肿瘤免疫反应，以主动免疫治疗肿瘤是目前肿瘤生物治疗有效的方法之一，受到国内外学者的广泛重视。我们已开展了自体肿瘤疫苗的研究并已取得一定进展(论著“疫苗主动免疫疗法的实验研究”发表在《中国人兽共患病杂志》1996；12(3)30)。在动物实验取得成功的基础上，我们开展了自体疫苗临床应用的研究，分别对恶黑、平滑肌肉瘤、肺癌、食管癌和肝癌等300余例多种肿瘤进行了研究，观察到自体疫苗具有安全、无毒副反应、抑瘤效果明显的特点。
自体疫苗的制备方法文献已有报道，国内已申报专利的肿瘤疫苗制备方法有两家(专利号分别为97105061.9和93112060.8)。
专利号97105061.9公开的方法是取自体肿瘤组织石蜡包埋切片，制成单细胞悬液，经大蒜素、芦荟提取液处理后加卡介苗佐剂及醛类固定剂。这种制备的自体疫苗方法有以下不足(1)自体疫苗材料来源受限和可能含有抑制免疫反应的成分；(2)石蜡包埋组织，经酒精、二甲苯及石蜡处理，醛类固定，其抗原成分受到破坏，而且抗原受醛类封闭，减弱了抗原性，该法所制备的疫苗未经抗原蛋白测定，其量很难估计；(3)所加卡介苗或PPD作为佐剂作用时间短，增强抗原性的作用弱；(4)动物实验结果显示治疗组与对照组肿瘤重量近似，只有转移瘤数目和动物存活天数有差异，并未经统计分析，很难确切地评价其抑瘤效果。
专利号93112060.8公开的方法是采用自体新鲜癌组织制成单细胞悬液，与β-榄香烯、新城鸡瘟病毒相混和并加入醛类固定剂，用丝烈霉素、紫外线灭活，制成细胞水平的自体疫苗。其不足之处有(1)上述自体疫苗材料受限，只能用于自体；(2)所用中成药成份功能不明确；(3)完整瘤细胞用醛类处理抗原被封闭，抗原性减弱；(4)动物实验缺乏抑瘤率，仅用动物存活数来评价抑瘤效果是不够的。
本发明目的是公开一种脂质体异体、自体疫苗的制备方法。该方法制备疫苗的材料取自于人体癌组织的新鲜标本，其最大特点是肿瘤疫苗除应用于自体外，并可应用于相同器官、相同组织学类型的异体肿瘤患者的治疗，克服自体疫苗材料来源的限制，具有安全、无毒副反应，作用持久和高效等特点。
为了达到上述目的，本发明采取下列步骤来实现(1)取人体肿瘤新鲜标本，制成瘤细胞悬液；(2)采用液氮反复冻融使瘤细胞碎裂与灭活，去除脂性物质；(3)用梯度离心、透析、超速离心去除细胞核与大的胞浆颗粒，保证获取高纯度、高浓度的肿瘤细胞相关抗原(TAA)；(4)用Lowry’s法检测上清液抗原蛋白浓度合格；(5)用质脂体作为异体疫苗的载体与佐剂包裹制成疫苗。
本发明的更具体的实现步骤如下(1)取人新鲜肿瘤组织去除外膜和坏死组织后剪碎，按1g组织加3～5ml生理盐水的比例在组织研磨器中研磨成组织匀浆，再经200目筛网过滤成瘤细胞悬液；(2)瘤细胞悬液用台盼兰拒染法观察活瘤细胞数在92％以上；(3)将瘤细胞悬液于液氮中反复冻融，使瘤细胞碎裂并灭活，去除脂性物质；(4)用2.5％(V/V)正丁醇PBS液(PH7.4)重新悬浮，震荡均匀；(5)将上液经500×g(4℃)离心，取上清液再经2000×g(4℃)离心取上清液；(6)将上清液透析50～100h(4℃，100V)；(7)透析液经200000×g(4℃)超速离心，上清液即为制备的TAA(肿瘤相关抗原)；(8)用Lowry’s法检测上清液抗原蛋白浓度合格；(9)将脂质体制成稀释液(按脂质体∶甲醇∶氯仿以一定的比例混合摇匀成脂质体稀释液)；(10)将脂质体稀释液与TAA按1∶2～3的比例震荡混合后，即为脂质体包裹的疫苗。
与现有的肿瘤疫苗制备方法对比，本发明具有如下实质性特点1、异体疫苗，克服了自体疫苗材料受限的困难，可以一瘤多用，为临床应用提体供了依据。
2、脂质体是国际公认的无毒高效的佐剂，包裹的肿瘤疫苗容易被吞噬细胞吞噬，将增强的抗原信息体传递给TH细胞，诱发强烈的细胞免疫与体液免疫杀伤瘤细胞，且其作用释放缓慢持久。
3、疫苗的提取方法先进、科学，所提取的瘤细胞相关抗原的纯度与浓度高，并经抗原蛋白测定，保证高效可靠。
下面列举本发明的脂质体异体疫苗和脂质体自体疫苗的具体应用两例对本发明作进一步的描述。
实施例1人乳腺低分化腺癌新鲜标本制备为脂质体疫苗用于治疗动物肿瘤。(脂质体异体疫苗治疗应用实例)(1)人乳腺癌手术切除新鲜标本在无菌条件下称其重量，剥除其表面脂肪等非肿瘤组织，切成约1mm2大小的碎块。
(2)将肿瘤碎块放入组织研磨器中，按1g组织加4ml生理盐水研磨成组织匀浆，再经200目筛网过滤成瘤细胞悬液。
(3)瘤细胞悬液用台盼兰拒染法观察活瘤细胞数在95％以上；(4)将瘤细胞悬液用Hank’s液洗涤3次，然后在液氮中反复冻融3次，使瘤细胞碎裂与灭活，去除脂性物质；(5)用2.5％(V/V)正丁醇PBS液(PH7.4)重新悬浮，室温下轻震荡20min。
(6)悬浮液经500×g(4℃)离心10min，取上清液再经2000×g(4℃)离心20min，取上清液。
(7)上清液抽提透析72h(100V)。
(8)透析液经200000×g(4℃)超速离心1h，取上清液即为肿瘤相关抗原(TAA)。
(9)用Lowry’s法测定疫苗中抗原蛋白含量，并调整蛋白浓度为1mg/ml。
(10)将脂质体制成稀释液(按脂质体∶甲醇∶氯仿以1.5ml∶2ml∶5ml的比例混合摇匀成脂质体稀释液)；(11)将上述脂质体稀释液进行脂质体包裹成为疫苗。
(12)应用将上述脂质体异体疫苗0.2ml注入荷小鼠左腋部皮下已生长乳腺癌(Scc891)的Balb/c小鼠右腋部皮下。然后每隔5天同样注射疫苗2次，共3次，第16天活杀动物观察疫苗抑瘤效果和各脏器有无病变及毒副作用，实验结果见表一实施例2小鼠乳腺癌细胞株脂质体包裹疫苗及用于治疗动物肿瘤。(脂质体自体疫苗治疗应用)(1)取小鼠自发性乳腺癌细胞株(Scc891)细胞悬液，细胞含量1×107/ml。
(2)瘤细胞悬液用台盼兰拒染法观察活瘤细胞数在95％以上；(3)瘤细胞悬液用Hank’s液洗涤3次，使瘤细胞碎裂与灭活，去除脂性物质；(4)用2.5％(V/V)正丁醇PBS液(PH7.4)重新悬浮，室温下轻震荡20min。
(5)悬浮液经500×g(4℃)离心10min，取上清液再经2000×g(4℃)离心20min，取上清液。
(6)上清液抽提透析72h(100V)。
(7)透析液经200000×g(4℃)超速离心1h，取上清液即为去细胞核性细胞膜抗原(TAA)。
(8)用Lowry’s法测定抗原蛋白含量合格，并调整蛋白浓度为1mg/ml。
(9)将脂质体制成稀释液(按脂质体∶甲醇∶氯仿以1.5ml∶2ml∶5ml的比例混合摇匀成脂质体稀释液)；(10)将上述脂质体稀释液进行脂质体包裹成为疫苗。
(11)应用将脂质体自体疫苗0.2ml注入荷小鼠左腋部皮下已生长乳腺癌(Scc891)的Balb/c小鼠右腋部皮下，每隔5天同样注射疫苗2次，共3次，第16天活杀动物观察疫苗抑瘤效果和各脏器有无毒副作用损害。
通过严格的动物实验证明其脂质体异体疫苗及脂质体自体疫苗的抑制效果和安全性。本疫苗经动物实验证明脂质体异体与自体疫苗均有非常显著的抑瘤效果(P＜0.01)。每组10只动物均有5只动物无肿瘤生长，抑瘤率分别为73％与68％，且无毒副反应，结果见表一
表一组别 动物数(只) 肿瘤重量(×±SD) 抑瘤率％(1)对照组10 1.12±0.42(2)脂质体自体疫苗组 10 0.30±0.35 73.22(3)脂质体异体疫苗组 10 0.36±0.45 67.86说明1、3组瘤体重量统计学处理结果分别(1)-(2)P＜0.01 (1)-(3)P＜0.01 (2)-(3)P＞0.052、对照组10只动物均有肿瘤生长。
3、治疗组每组均有5只(50％)末见肿瘤生长，动物全成活。
4、治疗组组织切片显示肿瘤组织周围有多量淋巴浸润包绕(免疫组化染色证明为T淋巴细胞，UCHL-1阳性)。
5、治疗组动物的脾脏脾小体较对照组有明显的增生。
6、治疗组动物的心、肝、肾、肺等主要脏器未见明显病理改变。
注对照组右侧腋部皮下注射PBS液0.2ml，每隔5天同样注射2次共3次。
权利要求
1.脂质体异体、自体肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于采用下述制备步骤(1)取人体肿瘤新鲜标本，制成瘤细胞悬液；(2)采用液氮反复冻融使瘤细胞碎裂与灭活，去除脂性物质；(3)梯度离心，透析，超速离心去除细胞核与大的胞浆颗粒，保证获取高纯度，高浓度的肿瘤细胞相关抗原(TAA)；(4)用Lowry’s检测上清液抗原蛋白浓度含量合格；(5)用脂质体作为疫苗的载体与佐剂包裹成为疫苗。
2.根据权利要求1所述的脂质体异体、自体肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于采取下述更具体的制备步骤(1)取人新鲜肿瘤组织去除外膜和坏死组织后剪碎，按1g组织加3～5ml生理盐水的比例在组织研磨器中研磨成组织匀浆，再经200目筛网过滤成瘤细胞悬液；(2)瘤细胞悬液用台盼兰拒染法观察活瘤细胞数在92％以上；(3)将瘤细胞悬液于液氮中反复冻融，使瘤细胞碎裂并灭活，去除脂性物质；(4)用2.5％(V/V)正丁醇PBS液(PH7.4)重新悬浮，震荡均匀；(5)将上液经500×g(4℃)离心，取上清液再经2000×g(4℃)离心取上清液；(6)将上清液透析50～100h(4℃，100V)；(7)透析液经200000×g(4℃)超速离心上清液即为制备的TAA(肿瘤相关抗原)；(8)用Lowry’s检测上清液抗原蛋白浓度含量合格；(9)将脂质体制成稀释液(按脂质体∶甲醇∶氯仿以一定的比例混合摇匀成脂质体稀释液)；(10)将脂质体稀释液与TAA按1∶2～3的比例震荡混合后，即为脂质体包裹的疫苗。
全文摘要
本发明的主要过程是:(1)取人体肿瘤新鲜标本制成瘤细胞悬液;(2)冻融法瘤细胞碎裂与灭活;(3)正丁醇悬浮去除脂性物质;(4)离心法去除细胞核;(5)Lowry's法检测上清液合格;(6)脂质体作为载体与佐剂包裹制成疫苗。本发明的显著特点:(1)异体肿瘤疫苗的材料不受限制;(2)肿瘤疫苗的提取方法先进、科学、高效、安全、无毒副反应;(3)脂质体包裹疫苗可明显增强疫苗的抗原性,诱导肿瘤宿主产生细胞免疫,作用释放缓慢持久。
文档编号A61K39/00GK1340361SQ0011736
公开日2002年3月20日 申请日期2000年8月25日 优先权日2000年8月25日
发明者甘岫云 申请人:广州市肿瘤医院, 甘岫云