专利名称：呋异丙苷在制备抗乙肝病毒新药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及呋异丙苷的用途，尤其涉及其医药用途。
呋异丙苷，化学命名为1，2∶5，6-二异丙叉葡萄呋喃糖，是一已知化合物，其结构式如下所示 该化合物可通过葡萄糖和丙酮在酸性条件反应制得。对该化合物的具体应用未见有报道。
本发明的目的是给出呋异丙苷的新用途，即在制备新药中的应用。
实际上本发明涉及呋异丙苷在制备抗乙肝病毒的药物中的应用。
中国专利，专利号为96115901.4的，申请日为1996年7月26号，公开了抗乙肝病毒化合物八宝素，该化合物化学名称为异丙叉景酮糖酐(I sopropylidene Sedoheptulosan)，结构式为 八宝素有显著的抗乙肝病毒活性，但是缺乏抑制停药反跳的特性。本发明的发明人根据构效关系，提出呋异丙苷具有抑制乙肝病毒的活性的特性，经实验研究表明呋异丙苷除了毒性低且具有显著的抗乙肝病毒活性外，更具有抑制停药反跳的特性。
为了更好地说明本发明的实质，下面将用呋异丙苷的药理实验及其结果来说明其在制药领域中的新用途。
一、呋异丙苷的制备方法1.称取葡萄糖100g，加入含有质量百分比为4％的H2SO4的丙酮2000ml，振摇4个小时；2.加入无水碳酸钠中和酸至中性；3.滤去固体，滤液蒸发至干，残渣用冷水溶解；4.溶液以苯提取三次以除去丙酮自身缩合产物，提取液以少量水洗涤二次，洗液并入水液；5.合并水液加活性碳振摇，过滤，溶液以氯仿提取6次，每次提取的氯仿用量是溶液体积的1/5；6.氯仿液通过无水硫酸钠脱水，真空蒸发至干，得102克粗产品；上述产品以丙酮-乙醚混合溶媒重结晶，得白色针状结晶，该晶体味苦，熔点为110℃-111℃。
本品的13C-NMR和1H-NMR结果如下序数位 移值ppm(δ) 氢序数位移值ppm(δ，及偶合常数)C-1105.24(CH)H-15.94(d，3.5Hz)C-285.06(CH) H-24.53(d，3.51Hz)C-375.11(CH) H-34.35(m)C-481.14(CH) H-44.07(dd，2.5，7.8Hz)C-573.38(CH) H-54.33(m)C-667.62(CH2)H-6a 4.17(dd，6.2，8.6Hz)H-6b 4.00(dd，6.2，8.6 Hz)C-7111.80(C)C-826.81(C) H-81.45(s)
C-9 25.11(CH3)H-9 1.32(s)C-10109.62(C)C-1126.73(CH3)H-111.44(s)C-1225.11(CH3)H-121.37(s)本品的HMBC相关峰C-1和H-2，H-3；C-2和H-1，3-OH；C-3和H-1，H-2，H-4；C-4和H-1，H-2，H-3，H-6；C-5和H-4；C-6和H-4；C-7和H-1，H-8，H-9；C-10和H-5，H-6，H-11，H-12COSY相关峰H-1和H-2；H-3和3-OH；H-3和H-4；H-5和H-4，H-6，H-6b；H-6a和H-6b质谱分子式为C12H20O6质谱上出现M-CH3(245)峰本品以高效液相色谱法测定，按干燥品计算，含有呋异丙苷不低于99％。
二、呋异丙苷针剂的制备以上述方法制备的呋异丙苷，直接作为针剂使用，也可以按冻干粉针剂的通用方法，加入常规量的赋形剂，赋形剂是葡萄糖也可以是氯化钠，赋形剂还可是葡萄糖与氯化钠等质量的混合物，呋异丙苷加入赋形剂后溶解分装，置冷冻干燥机中冻干，得网状冻干粉块。
三、呋异丙苷在2.2.15细胞内对乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原的抑制作用(1)细胞培养实验细胞采用的2.2.15细胞是乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆转染人肝癌细胞(Hep G2)细胞系，美国Mount Sinai医学中心构建。
所用试剂Eagles MEM干粉，胎牛血清，G-418(Geneticin)均为美国Gibco公司产品。
细胞培养液为MEM培养液，每100ml含胎牛血清10ml，质量百分比浓度为3％的谷氨酰胺溶液1ml，G418 380ug/ml，卡那霉素50U/ml；细胞消化液为含质量百分比为0.25％胰酶溶液，用Hanks液配置。
细胞培养方法在长满2.2.15细胞的培养瓶中加入细胞消化液37℃消化3分钟，加培养液吹打，1∶3传代，10天长满，加入细胞计数板计数，配置成每毫升10万个细胞接种细胞培养板，96孔板每孔0.2ml，24孔板每孔1ml，37℃，5％CO2培养24小时，细胞长成单层后进行后续实验。
(2)呋异丙苷对细胞毒性试验在接种细胞24小时后，分别加入药物呋异丙苷25，12.5，6.25，3.125，1.56mg/ml，设无药物细胞对照组以观察细胞病变为指标，8天显微镜下观察细胞病变，完全破坏为4；75％破坏为3；50％破坏为2；25％破坏为1；无病变为0。计算每浓度药液平均细胞病变程度和抑制百分率。按Reed-Muench法计算半数有毒浓度(TC50)，最大无毒浓度(TCO)。每个浓度呋异丙苷进行两批实验，每批进行3组平行实验，得平均TC50为4.42mg/ml，TCO为3.125mg/ml。
(3)呋异丙苷在2.2.15细胞培养内对HbeAg和HbsAg抑制实验往每个孔的培养细胞中分别加入无毒浓度以下2倍稀释实验药液，4个稀释度分别为含呋异丙苷3.125mg/ml，1.56mg/ml，0.78mg/ml，0.39mg/ml，每批每个浓度3孔，按细胞培养方法培养8天后，培养液-20℃保存。三批实验同时测定HbeAg和HbsAg。HbeAg和HbsAg采用中国同位素北方免疫试剂研究产品，固相放射免疫测定盒测定，方法见说明书，用γ-计数仪测定每孔cpm值。实验设HbeAg，HbsAg阳性和阴性对照及细胞对照。按Reed-Muench法计算P/N值和抑制百分率(％)，半数有效浓度(IC50)及选择指数(SI)。
三批实验呋异丙苷对HbsAg的平均抑制率分别为3.125mg/ml抑制率51.1±4.3％(P＜0.01)，1.56mg/ml抑制率29.4±10.7％(P＜0.01)，0.78mg/ml抑制率22.4±6.5％(P＜0.01)，0.39mg/ml抑制率16.5±5.1％(P＜0.01)。三批实验IC50平均为3.87±1.58mg/ml，选择指数SI为1.26±0.43，有抑制作用。
三批实验呋异丙苷对HBeAg的平均抑制率分别为3.125mg/ml抑制率为31.7±1.2％(P＜0.01)，1.56mg/ml抑制率为24.6±0.8％(P＜0.01)，0.78mg/ml抑制率为19.6±4.4％(P＜0.01)，0.39mg/ml抑制率为17.1±1.8％(P＜0.01)。IC50及选择指数无法计算。
从上述结果可以看到呋异丙苷对HBsAg及HbeAg的抑制作用均有剂量反应关系。
目前用于治疗乙型肝炎的阿糖腺苷单磷酸(Ara-AMP)，阿昔洛韦(ACV)，磷甲酸钠(PFA)等在2.2.15细胞中虽能抑制HBV-DNA，但是对HBeAg表达抑制率低于50％，不能计算IC50。
四、呋异丙苷在鸭体内对乙型肝炎病毒感染的治疗效果为了证明本发明对乙型肝炎病毒的治疗效果，以目前国内外公认的动物实验模型在乙型肝炎病毒感染鸭体内进行治疗效果实验。实验采用一日龄北京鸭静脉注射乙型肝炎病毒，7天后开始对感染鸭随机分组进行药物治疗实验，每组6只；给药分别为75，150，300mg/kg，呋异丙苷用生理盐水配制，腹腔注射，一天2次，治疗10天.设病毒对照组(DHBV)，以生理盐水代替药物；阳性药物对照组，阳性药物采用阿昔洛韦(ACV)，用生理盐水配置，腹腔注射，1天2次，给药10天。在感染后第7天即用药前(TO)，用药第5天(T5)，用药第10天(T10)和停药后第3天(P3)，分别自鸭腿胫静脉取血，分离血清，按缺口翻译试剂盒说明书方法测定血清杂交斑点OD值，并按下式计算血清DHBV-DNA的抑制率。
结果如表一所示表1 在乙型肝炎病毒感染鸭体内腹腔注射呋异丙苷治疗组病毒感染对照组鸭血清DHBV-DNA水平抑制率的比较
统计处理*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。三批实验结果表明乙型肝炎病毒感染鸭在感染后第7天腹腔注射途径给药呋异丙苷治疗，150mg/kg及300mg/kg组一天两次给药，10天对感染鸭血清DHBV-DNA水平的抑制效果显著，并有抑制停药反跳的特点，而75mg/kg组无效。阳性药阿昔洛韦(ACV)腹腔注射对DHBV-DNA的抑制作用显著，但是没有抑制停药反跳的特点，与以往多次实验一致。以上实验结果表明呋异丙苷治疗乙型肝炎病毒感染鸭有效，有效剂量为150-300mg/kg一天2次，给药10天，停止给药后对乙肝病毒仍具有抑制作用。
下面再以一个实施例来对本发明进行进一步描述。
按上述呋异丙苷的制备方法得到呋异丙苷纯品，按冻干粉针剂的通用方法与葡萄糖混合，呋异丙苷与葡萄糖质量比为4∶1，混合后的混合物用蒸馏水溶解分装后，置冷冻干燥机中冻干，得网状冻干粉块。
权利要求
1.呋异丙苷在制备抗乙肝病毒新药中的应用。
2.按权利要求1所述的呋异丙苷在制备抗乙肝病毒新药中的应用，其特征在于呋异丙苷用于制备抗乙肝病毒的冻干粉针剂。
全文摘要
本发明公开了呋异丙苷在制备抗乙肝病毒新药中的应用。呋异丙苷,化学命名为1,2∶5,6－二异丙叉葡萄糖呋喃糖,结构式为:(见左式),经体外实验和乙型肝炎病毒感染的鸭体内实验证明呋异丙苷毒性低,能有效地抑制乙型肝炎病毒活性,更有抑制停药反跳的特性。
文档编号A61P1/00GK1284333SQ00117329
公开日2001年2月21日 申请日期2000年8月16日 优先权日2000年8月16日
发明者左春旭, 黄漫翔, 陶佩珍, 邓莉萍, 郑国爱, 林象联, 刘吉开, 仲英 申请人:广东燕塘生物化学药业有限公司