专利名称：嘌呤l－核苷、其类似物及其用途的制作方法
技术领域：
本申请涉及L-核苷领域。
背景技术：
近几十年中，人们在开发D-核苷类似物作为抗病毒剂的可能用途方面已付出了很大努力。其中一些工作已硕果累累，而一些核苷类似物成为当前市场上的抗病毒剂，其中包括HIV逆转录酶抑制剂(AZT、ddI、d4T和3TC)。
在研究免疫调节剂过程中，开发了多种嘌呤D-核苷类似物。例如，7位和/或8位有取代基的乌苷表现出对免疫系统的刺激性(综述见Weigle，W.O.CRC Crit.Rev.Immunol.1987，7，285；Lin等，J.Med.Chem.1933，36，3431-3436)。某些3-β-D-呋喃核糖基噻唑并[4，5-d]嘧啶也具有显著的免疫活性，包括鼠脾细胞增殖和对西门利克森林病毒(Nagahara等，J.med.Chem 1990，33，407-415；Robins等，美国专利5041426)。在另一研究中，7-脱氮鸟苷及类似物在小鼠体内表现出对多种RNA病毒的抗病毒活性，即使该化合物在细胞培养中缺乏抗病毒性质。3-脱氮鸟嘌呤核苷和核苷酸也对某些DNA和RNA病毒显示出显著的广谱抗病毒活性(Revankar等，J Med.Chem.1984，27，1389-1396)。某些7-和9-脱氮鸟嘌呤C-核苷能保护小鼠不被西门利克森林病毒致死(Girgis等，J.Med.Chem.1990，33，2750-2755)。某些6-次磺酰胺和6-亚磺酰胺嘌呤核苷显示出显著的抗肿瘤活性(Robins等，美国专利4328336)。某些嘧啶并[5，4-D]嘧啶核苷对BDF1小鼠中的L1210有治疗作用(Robins等，美国专利5041542)，于是，暗示上述核苷的抗病毒和抗肿瘤活性是它们作为免疫调节剂的结果(Bonnet等，J.Med.Chem.1993，36，635-653)。
免疫调节的一种可能的目标是刺激或抑制Th1和Th2淋巴因子。I型(Th1)细胞产生白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNFα)和γ干扰素(IFNγ)，并且它们主要负责细胞介导的免疫如延迟型过敏症和抗病毒免疫性。2型(Th2)细胞产生白介素IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13，并且主要参与辅助体液免疫反应如对过敏原的反应中所见，例如，IgE和IgG4抗体同种型转换(Mosmann，1989，Annu Rev Immunol，7∶145-173)。D-鸟苷类似物在体外(Goodmain，1988，Int J Immunopharmacol，10，579-88)和体内(Smee等，1991，Antiviral Res 15∶229)引起淋巴因子IL-1、IL-6，IFNα和TNFα(间接)多种作用。但是，如7-硫代-8-氧代鸟苷等D-鸟苷类似物调节直接在T细胞内的I型或2型细胞因子的能力无效或尚未被证实。
因此，还需要新的L-核苷类似物，包括新的嘌呤L-核苷类似物。特别需要新的、具有免疫活性的嘌呤L-核苷类似物，更具体地说需要新的、调节Th1和Th2活性的嘌呤L-核苷类似物。
发明概述本发明涉及新的嘌呤L-核苷化合物、其治疗用途和合成。
本发明的一方面提供了式1-4的嘌呤L-核苷类似物
本发明的另一方面提供了一种药物组合物，其中含有治疗有效量的式1、2、3或4化合物或其药用酯或其药用盐，它们与至少一种药用载体混和。
本发明的又一方面，式1-4的化合物用于治疗任何对使用该化合物有有利反应的疾病，并用于得到有利反应的任何制剂和方案。此外，可考虑式1-4的化合物可用于治疗感染、侵染、癌症、治疗或其它赘生物，或者自身免疫性疾病。
附图简述
图1和2(方案1和2)描述了可用于合成本发明化合物的化学合成步骤。涉及合成特别组成的合成方案请参考本文中的实施例。
图3是针对Th1和Th2的L-鸟苷类似物实例的图示。
发明详述本说明书中使用的下列术语定义如下。
术语“核苷”指由连接在杂环的特定位置，或嘌呤(9位)或嘧啶(1位)的天然位置，或某种类似物的相当位置的任何戊糖或改性戊糖组成的化合物。
术语“核苷酸”指核苷的5＇位被取代的磷酸酯。
术语“嘌呤”指含氮的双环杂环。
术语“嘧啶”指含氮的单环杂环。
本发明使用的术语“D-核苷”描述的是含D-核糖部分(如腺苷)的核苷化合物。
本发明使用的术语“L-核苷”描述的是含L-核糖部分的核苷化合物。
本发明中的术语“L-构型”描述的是连接在核碱基(nucleobase)上的化合物的呋喃核糖基部分的化学构型。本发明化合物的糖部分的L-构型与天然核苷如胞苷、腺苷、胸苷、鸟苷和鸟苷的核糖部分的D构型形成对比。
术语“免疫调节剂”指天然或合成产物，该产物能通过刺激或抑制来改变正常或异常的免疫系统。
术语“有效量”指年将免疫功能恢复正常或使免疫功能高于正常水平以消除感染的式(Ⅰ)化合物的量。
式1-4化合物可含有多个不对称中心。因此，可制备它们的光学活性形式或外消旋混和物。本发明描述的和要求保护的范围包括了各光学异构体和其非外消旋的混和物以及式1-4化合物的外消旋形式。
术语“α”和“β”指如图所示的化学结构中不对称碳原子上取代基的特定立体化学构型。本文中所述化合物都是L-呋喃糖基构型。
术语“对映异构体”指一对立体异构体，它们互相为非叠加镜像。一对对映异构体的化合物比例为1∶1时为“外消旋”混和物。
术语“异构体”至具有同样分子式的不同化合物。“立体异构体”为只是原子空间排列不同的异构体。
“药用盐”可指由无机酸和有机酸或碱衍生的任何盐。
化合物本发明化舍物总的来说由式1-4描述，其结构如下 用途预计本发明式1～4化合物可用于治疗多种疾病，事实上可治疗对使用一种或多种该化合物有有利反应的任何情况。另外，具体地说，本发明化合物可用于治疗感染、侵染、癌症或肿瘤、或自身免疫性疾病。
用本发明化合物治疗的感染包括呼吸合胞体病毒(RSV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、1型和2型单纯疱疹、生殖器疱疹、角膜炎疱疹、脑炎疱疹、带状疱疹、人免疫缺陷病毒(HIV)、甲型流感病毒、hantann病毒(出血热)、人乳头瘤病毒(HPV)、麻疹和真菌。
本发明化合物治疗的侵染包括原虫侵染、蠕虫侵染及其它寄生虫侵染。
所治疗的癌症或肿瘤包括病毒引起的，并且该作用可能与抑制病毒感染细胞转变为赘生状态有关，与抑制转化细胞向其它正常细胞的扩散和/或阻止病毒转化细胞的生长。
所治疗的自身免疫性及其它疾病包括关节炎、牛皮癣、肠疾病、青少年糖尿病、狼疮、多发性硬化、痛风和痛风性关节炎、类风湿性关节炎、移植排斥、过敏和哮喘。
本发明化合物还有其它用途，包括在化学合成其它核苷或核苷酸类似物中用作中间体，这些核苷或核苷酸随后用作治疗剂或其它目的。
本发明的另一方面是治疗哺乳动物的方法，包括使用治疗和/或预防有效量的、含本发明化舍物的药物。在此方面，此作用可涉及哺乳动物免疫系统中一些部分的调节，特别是调节Th1和Th2的淋巴因子特性。当对Th1和Th2淋巴因子的调节发生时，此调节可包括同时刺激Th1和Th2，同时抑制Th1和Th2，刺激Th1和Th2之一而抑制另一个，或双峰调节，即其对Th1/Th2水平的作用(如总体抑制)发生于低浓度，同时另一种作用(如刺激Th1或Th2之一而抑制另一个)发生在较高浓度。
总之，本发明最优选的用途为活性化舍物对非靶向宿主细胞的细胞毒性相对较小，而对靶向细胞相对更具活性。就此而言，L-核苷比D-核苷稳定性加大，这可带来较好的药物动力学，因而也是有利的。因L-核苷不会被酶识别，并因此有较长的半衰期，故可得到此结果。
本发明化合物可以任何适宜的药物制剂并以任何适宜的给药方案给药。因此，可通过口服、非肠道(包括皮下注射、静脉内、肌肉内、通过胸骨注射或输液技术)、通过吸入喷雾、或直肠、局部等方式给药，在其单位剂量制剂中含常规无毒药用载体、辅剂或赋形剂。
例如，本发明化合物可与药用载体混和进行配制。例如，本发明化舍物可以药用盐的形式口服给药。因为本发明化合物多数是水溶性的，所以它们可在生理盐水(例如，将pH缓冲至约7.2至7.5)中静脉给药。常规缓冲剂如磷酸盐、碳酸氢盐或枸橼酸盐可用于此目的。当然，本领域的普通技术人员可根据本说明书的提示对制剂进行改进，以得到特别给药途径的一些制剂，而不会使本发明的组合物失效或危害其治疗活性。具体地讲，为使本发明化合物在水或其它载体中更稳定而对它们进行的修饰，例如，可通过小改进(形成盐、酯化等)容易地完成，这是本领域技术人员熟知的。本领域技术人员还会知道修饰特定化合物的给药途径或剂量方案来控制这些化合物的药物动力学以给患者带来最大有利作用。
在某种药物剂型中，此化合物的前体药物，特别包括本发明化合物的酰化(乙酰化或其它)衍生物、吡啶酯和多种盐是优选的。本领域技术人员会认识到如何将本发明化合物修饰为前体药物形式以便于活性化合物向生物体宿主或患者体内靶位点转运。本领域技术人员还会利用所用此前体药物形式的有利药物动力学参数将本发明化合物转运到生物体宿主和患者体内的靶位点，以得到该化合物的最大预期作用。
此外，本发明化合物可单独或与治疗上述感染或疾病的其它制剂联合给药。本发明的联合治疗包括使用至少一种本发明化合物或其官能团衍生物和至少一种其它药物活性成分。该活性成分(一种或多种)及药物活性试剂可分别或一起给药，当分别给药时可同时或以任何顺序分别给药。选择该活性成分(一种或多种)和药物活性试剂(一种或多种)的量及给药的相关时间以得到所需的联合治疗作用。优选该联合治疗包括使用本发明的一种化合物或其生理可接受的官能团衍生物和下文提到的试剂之一。
这些其它治疗剂的实例包括能有效调节免疫系统或相关疾病的试剂，例如AZT、3TC、8-取代的鸟苷类似物、2＇，3＇-二脱氧核苷、白介素Ⅱ、干扰素如α-干扰素、妥卡雷琐、左旋咪唑、异丙肌苷和环木脂体。本发明的某些化合物通过降低其它化合物的代谢或灭活可有效提高本发明某些试剂的生物活性，并于是为此效果共同给药。
至于剂量，本领域技术人员会意识到治疗有效量将随所治疗的感染或疾病、其严重程度、所用治疗方案、所用试剂的药物动力学以及所治疗患者(动物或人)变化。有效量为1mg/kg患者体重或更低至25mg/kg患者体重或更高，这取决于所用化合物、所治疗的疾病或感染及给药途径。此剂量一般在患者中使活性化合物的有效血药浓度为约0.04至约100微克/毫升血。但是，适当的治疗方案为先使用小量，然后通过用药量直至产生不利副作用或已达到预期效果。
该活性化合物给药方式可在连续(静脉点滴)至每天几次口服给药(如Q.I.D)之间变化并可在其它给药途径中包括口服、局部、非肠道、肌肉内、静脉内、皮下、透皮(可包括渗透促进剂)、舌下及栓剂给药。
为了治疗本发明的药物组合物，优选本发明的治疗有效量的一种或多种化合物紧密地与常规药物配合技术的药用载体混合来制备一种剂型。根据给药如口服或非肠道给药所需剂型选择多种形式的载体。在制备口服剂型的药物组合物中，可使用任何常用药物介质。因此，对于液体口服制剂如混悬剂、酏剂和溶液剂，可使用适宜的载体和添加剂包括水、二醇、油、醇、矫味剂、防腐剂、着色剂等。对于固体口服制剂如散剂、片剂、胶囊，以及固体剂型如栓剂，可使用适宜的载体和添加剂包括淀粉、糖载体如葡萄糖、甘露醇、乳糖和相关载体、稀释剂、成颗粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。如果需要，此片剂或胶囊可通过标准技术进行肠溶包衣或缓释处理。
对于非肠道给药制剂，载体一般包括灭菌水或氯化钠水溶液，还可包括其它组份如分散助剂。当然，当使用灭菌水并要保持无菌状态时，该组合物和载体也必须灭菌。还可制备注射混悬液，其中可使用适当的液体载体、助悬剂等。
实验结果对式1化合物(5-氨基-3-β-L-呋喃核糖噻唑基[4，5-d]嘧啶-2，7(6H)-二酮)进行体外实验，结果如下将采自健康供者的60ml血用Ficoll-Hupaque密度梯度离心从血沉棕黄层分离外周血单核细胞(PBMCs)。然后用特别针对T细胞的Lymphokwik淋巴细胞分离试剂(LK-25T，One Lambda，Canoga Park CA)从PBMCs中纯化T细胞。再将平均收率为40-60×106的T细胞在37℃在20-30ml RPMI-AP5(RPMI-1640培养基(ICN，Costa Mesa，CA)，其中含20mM HEPES缓冲液，pH74、5％自体血浆、1％L-谷酰胺、1％青霉素/链霉素和0.05％2-巯基乙醇)中培养过夜，以除去任何污染粘附细胞。在所有实验中，用RPMI-AP5洗涤T细胞，然后以细胞浓度为1×106细胞/ml加入96孔微量板中。
通过加入500ng伊屋诺霉素和10ng佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)(Calbiochem，La Jolla，CA)将T细胞活化并在37℃孵育48-72小时。活化后立即用0.5至50μM的待测化合物或用250-10000U/ml对照抗病毒剂α-干扰素(Accurate，Westbury，NY)处理PMA/伊屋诺霉素活化的T细胞，并在24小时后再处理。将每个板中的T细胞用于免疫荧光分析并将上清液用于细胞内细胞因子检测。活化后，将每个微量板中的900μl细胞上清液转移至另一微量板中进行细胞衍生细胞因子产生的分析。然后将这些细胞用于免疫荧光分析来检测细胞内细胞因子水平和细胞因子受体表达。
检测每个微量板中细胞上清液的细胞衍生人细胞因子浓度。使用商购的ELISA试剂盒(R & D系统Quantikine试剂盒，Minneapolis，MN)或使用IL-2-依赖性细胞系CTLL-2(ATTC，Rockville，MD)通过生物检测检测活化引起的白介素-2(IL-2)浓度的变化。用ELISA试剂盒检测活化引起的白介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子(TNFα)、白介素-8(IL-8)(R & D系统Quantikine试剂盒，Minneapolis，MN)和γ-干扰素(IFN-γ)(EndogenCambridge，MA)浓度。所有ELISA结果以pg/ml表示而CTLL-2生物检测以每分钟计数表示通过CTLL-2细胞3H-胸苷的IL-2依赖性细胞掺入(ICN，Costa Mesa，CA)。
式1化合物对IL-2、TNFα、IFN-γ、IL-4和IL-5浓度的结果见图3，柱形+17323。
合成本发明化合物可按照对每个本领域技术人员熟知的合成方法制备。总之，本发明化合物通过适宜的核苷碱基与需要的糖合成子缩合生成保护的L-核苷，将其糖的羟基保护基进一步处理或脱保护最终得到核苷类似物，该核苷类似物具有所需的L-构型的呋喃核糖基部分。
方案1显示了N2-乙酰基-3-脱氮-L-鸟苷的合成。3-脱氮鸟苷11(Cook等，J.Med.Chem.1976，27，1389)用乙酸酐在吡啶中处理得到N2-乙酰基-3-脱氮鸟嘌呤12，将其甲硅烷基化并与1-乙酰基-2，3，5-O-三苯甲酰基-L-核糖偶联得到化合物13。用氨气-甲醇除去苯甲酰基得到N2-乙酰基-3-脱氮-L-鸟苷14。
方案2显示了5-氨基-3-β-L-呋喃核糖基噻唑并[4，5-d]嘧啶-2，7(6H)-二酮及类似物的合成。将5-氨基噻唑并[4，5-d]嘧啶2，7(3H，6H)-二酮32(Baker等，J.Chem.Soc.C1970，2478)与脱保护的核糖偶联得到核苷33，将其脱保护得到5-氨基-3-β-L-呋喃核糖基噻唑并[4，5-d]嘧啶-2，7(6H)-二酮34。化合物33可用硝基苯乙基保护，然后用亚硝酸丁酯和氟化氢在吡啶中处理得到氟化物衍生物35。用亚硝酸叔丁酯在THF中处理33(Nagahara等，J.Med.Chem.1990，33，407)可把氨基替换为氢得到36。
方案中描述的化合物为β-L-乌苷类似物。可用相似的方法制备相应的α-L-类似物，但是其中L-核糖的保护基不同。将1-乙酰基-2，3，5-O-三苯甲酰基-L-呋喃核糖替换为1-溴-β-L-核糖衍生物作为试剂，这样将产生主要产物α-L-核苷。
实施例下面给出了在申请人实验室进行的实验样本。这些实施例广泛但并不全面。进行的这些工作包括以下所有样本，但是并不受这些实施例的限制。
实施例1N2-乙酰基-3-脱氮鸟苷12向存在于无水吡啶(30ml)的3-脱氮鸟苷11(2.0g)的悬浮液中加入乙酸酐(5ml)并将所得反应混合物加热至90℃。固体逐渐溶解并形成棕色溶液。10分钟后再次发生沉淀。再将此混合物在90℃搅拌90分钟并冷却至50℃。滤出沉淀并用乙腈、水和乙腈洗涤得到1.79g N2-乙酰基-3-脱氮鸟苷12，为浅棕色固体。
实施例2N2-乙酰基-3-脱氮-β-L-鸟苷14将N2-乙酰基-3-脱氮鸟苷12(576mg，3.0mmol)、六甲基二硅烷(HMDS，15ml)、吡啶(2ml)和硫酸铵(10mg)的悬浮液回流搅拌并排除潮气2.5小时。蒸发溶剂并将此残余物真空干燥2小时得到泡沫状浆液。将此残余物溶解于二氯甲烷(无水，30ml)中并加入1-乙酰基-2，3，5-三苯甲酰基-L-核糖(1.51g，3.0mmol)，随后慢慢加入三氟甲磺酸三甲硅烷(4.5mmol，0.81ml)。将所得溶液回流20小时。蒸发溶剂并将此残余物溶解于乙酸乙酯中，用5％碳酸氢钠洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩。在硅胶上用存在于二氯甲烷中的5％三乙胺和2-10％乙醇洗脱进行色谱纯化得到三个主要产物340mg高Rf产物、368mg中Rf产物和335mg低Rf产物，它们都是微黄色固体。
将中Rf产物13(350mg)在饱和氨-甲醇中的溶液室温放置2天。蒸发掉氨和甲醇并将此残余物在硅胶上用存在于二氯甲烷中的5％三乙胺和20％乙醇洗脱进行色谱纯化得到114mg N2-乙酰基-3-脱氮-β-L-鸟苷14，为白色固体。
实施例35-氨基-3-β-L-呋喃核糖基噻唑并[4，5-d]嘧啶-2，7(6H)-二酮34将5-氨基噻唑并[4，5-d]嘧啶-2，7(6H)-二酮32(400mg，2.71mmol)悬浮于乙腈(16ml)中并加入六甲基二硅烷(0.96ml)、三甲基氯硅烷(0.55ml)和三氟甲磺酸三甲硅烷(0.9ml)。将此混合物搅拌回流3.5小时。滴加三甲基硅烷基三氟甲磺酸盐(0.45ml)的乙腈(1.0ml)溶液，搅拌并继续再加热30分钟。加入1-O-乙酰基-2，3，5-O-三苯甲酰基-L-呋喃核糖(1.22g，2.28mmol)在乙腈(4.1ml)中的浆并将此混合物搅拌回流30分钟。将此反应混合物冷却并慢慢倒入碳酸氢钠(2.81g)和水(96ml)剧烈搅拌的混合物中，这样产生粘稠固体。加入乙酸乙酯，搅拌此混合物至固体溶解。用乙酸乙酯将此水层萃取两次并用碳酸氢钠洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥并浓缩。将此粗品通过色谱在硅胶上用存在于二氯甲烷中的5％三乙胺和5％乙醇洗脱纯化得到1.10g 5-氨基-3-(2＇，3＇，5＇-O-三苯甲酰基-β-L-呋喃核糖基)噻唑并[4，5-d]嘧啶-2，7(6H)-二酮33，为白色固体。
将5-氨基-3-(2＇，3＇，5＇-O-三苯甲酰基-β-L-呋喃核糖基)噻唑并[4，5-d]嘧啶-2，7(6H)-二酮33(1.09g，1.717mmol)溶解于甲醇(25ml)中并加入甲醇钠(5.4M甲醇溶液，0.64ml)。将此溶液室温放置64小时。将大部分甲醇蒸发并加入水(20ml)和Amberite H-Form(1.0g)。将此悬浮液温柔搅拌20分钟并抽滤需树脂，用水(2×10ml)洗涤。浓缩此滤液并将此粗品用甲醇结晶纯化得到368mg 5-氨基-3-β-L-呋喃核糖基噻唑并[4，5-d]嘧啶-2，7(6H)-二酮34，为无水固体。
权利要求
1．结构为式1的化合物
2．结构为式2的化合物
3．结构为式3的化合物
4．结构为式4的化合物
5．含有权利要求1-4任一项所述化合物，或其药用酯或盐，和与其混合的至少一种药用载体的药物组合物。
6．患有对使用权利要求1-4任一项所述化合物有有利反应的疾病的病人的治疗方法，包括提供此化合物；给该患者使用一定剂量的该化合物；并控制对患者的有效性和副作用。
7．权利要求6所述的方法，其中疾病包括感染。
8．权利要求6所述的方法，其中疾病包括侵染。
9．权利要求6所述的方法，其中疾病包括赘生物。
10．权利要求6所述的方法，其中疾病包括自身免疫性疾病。
11．权利要求6所述的方法，其中给患者使用该化合物的步骤包括使用治疗有效量的该化合物。
12．调节患者的TH1和Th2活性的方法，包括提供权利要求1-4任一项所述的化合物；并给患者使用一定剂量的该化合物。
全文摘要
公开了新的嘌呤L－核苷化合物,其中嘌呤环和糖都被修饰或官能团化,或二者兼而有之。此新化合物或其药用酯或盐可用于药物组合物中,且这些组合物可用于治疗感染、侵染、新生物或自身免疫性疾病。此新化合物还可用于从多方面调节免疫系统,包括调节Th1和Th2。
文档编号A61K31/519GK1286258SQ00122458
公开日2001年3月7日 申请日期2000年7月26日 优先权日1996年10月16日
发明者王广义, R·丹, D·阿维尔特 申请人:Icn药品公司