专利名称：血液相容性表面及其制备方法
技术领域：
本发明涉及血液相容性表面，特征在于将血细胞和/或间皮细胞外层的组分应用于和/或结合于材料的表面上和/或表面之中。本发明还涉及制备血液相容性表面的方法以及它们在康复、医疗、牙科、外科手术、美容和/或与血液、组织和/或其它体液直接相关的领域的广泛应用。
脊椎动物中，血液凝固是一种复杂的过程，它在损伤情况下暂时避免血液严重流失。除了别的之外，在这种情况下，血液凝固系统通过与非生理性，即“外源性”物质接触被激活。主动抑制血液凝固系统的物质也称之为抗血栓形成剂。不激活血液凝固系统的物质被定义为非血栓形成剂。
特别是在侵入性手术情况下，对患者来说，血液凝固系统的激活是一个严重问题。因此，对依赖于移植物，例如冠脉内斯腾特固定模、心瓣膜、修复装置、人工血管系统、透析器或氧合器、导管、生物传感器等的患者尤甚。与手术缝合材料的接触也可能产生问题。
到目前为止，为防止脉管形成严重闭合(血栓)，已尝试使血液凝固系统失活或主动抑制血液凝固系统。这一般通过施用抗血栓形成药物(所谓抗凝剂)来进行，但这给患者带来许多副作用，例如血小板减少症、恶心、呕吐、脱发、出血性皮肤坏疽、高度的出血倾向等。但是，如果采用冠脉内斯腾特固定模或心瓣膜，即使用药物充分抑制血液凝固，也常常不足以防止血栓的形成，从而导致死亡。
在康复、医疗、牙科、手术、美容或者侵入性手术中与血液和/或其它体液相关的领域中，避免上述由于抗凝剂引起的严重副作用是非常重要的。
现有技术已知各种通过涂敷不同物质制备血液更相容(血容性)或组织更相容的非生理性“外表面”的方法。
例如，DE 2831360描述了用一种主动抑制凝血系统的物质(肝素)，即抗血栓形成剂涂敷医疗器具表面的方法。但是所述物质对患者具有如上例举的严重副作用。
在DE 4435653中，公开了一种其中可另外掺入药物的聚合物薄层涂膜涂敷的材料，其中所述涂膜在体内持久降解而释放。该方法的缺陷在于第一，由于涂膜的永久性降解，仅能获得暂时的有限的作用。第二，由于涂膜颗粒的永久性隔离，存在血栓形成的高危险性，可导致栓塞。
DE 19630879特别地使用了化学改性的多糖衍生物作为涂覆基质。这种方法存在多种缺陷，包括多步的合成步骤的昂贵制备成本、多种不希望的副反应和所述衍生物较差的各种性质及可开发性(与市售的抗血栓形成物质，例如肝素相比)。
Verhagen等人(British Journal of Heamatology，1996，95542-549)描述了完整的内皮或间皮活细胞用于移植植入物的用途。使用完整细胞的缺陷是特异性细胞表面蛋白引起免疫反应，该反应导致患者对包被植入物产生排斥反应。引发这类免疫反应的物质还称之为免疫原性物质。在该方法中，为防止由于免疫反应产生的排斥反应，需要使用患者自身的特殊细胞材料。另一个缺陷是，培养这些细胞需要相当的时间和成本。再一个问题是，使用完整细胞具有高剪切力，在这种力的作用下，这些细胞容易进入血流。这导致表面细胞的分解性增高，对包被植入物的耐久性具有负面影响。
WO 93/01843、WO 95/29712和DE 19505070描述了完整的活的内皮细胞用于包被非生理性材料的用途或者有益于活的内皮细胞生长的物质在人工材料上的用途。但在这些情况下，所有的方法都以活内皮细胞的培养为基础，因此存在上述与时间和成本有关的缺陷或者相当的局限性，即包被材料不能统一使用，对于每位患者必须单独制备。
由专利说明书DE 3639561可获知用特异性内皮细胞表面蛋白多糖HS-1包被底物的制备方法。该方法的缺陷是为分离这些成分需要使用相当数量的患者自身的内皮细胞。这需要每位患者将其内源性内皮细胞进行费时、高成本的培养，此外随后进行成本昂贵的蛋白多糖HS-1的制备。因此，无法实现HS-1的大量生产，不能经济地使用该方法包被植入物。
因此，本发明的目的是提供血液相容性(血容性)或组织相容性表面，该表面不存在上述的缺点，同时适于大量生产。
本发明的目的通过使用血容性表面得到了实现，所述表面的特征在于它们包含作为材料的人工和/或天然有机化合物和/或无机化合物和/或它们的混合物和/或在侵入性手术和/或动物器官和/或器官部分中与血液和/或其它体液接触的材料，以及将血细胞和/或间皮细胞外层的组分施加或结合到所述材料表面上和/或表面之中。
本发明的血液相容性表面基本上模拟了血细胞和/或间皮细胞的外表面，即模拟了非血栓形成细胞和/或组织的天然表面。因此血容性表面既不能激活也不能主动抑制血液凝固系统。因而，例如由二次损伤(割伤等)引起的血凝可以完全天然或非干扰的方式发生。本发明的另一个优点是细胞，例如凝血细胞不会粘附于本发明的血容性表面。令人满意地是，本发明由此大大降低了被治疗患者形成血栓的危险性，即血栓形成(栓塞)的危险性。本发明的血液相容性表面不会引起任何副作用。
依据本发明，血液相容性表面的特征还在于它们是长期非血栓形成性的。这意味着其优点不会随着时间消失，该优点是，例如药物活性系统的情况(如释放系统)。为此，本发明的表面还适于永久使用，因此使为更新植入物进行重复侵入性手术的患者的额外负担或危险性降到最低。
依据本发明，血容性表面包含作为材料的人工和/或天然有机化合物和/或无机化合物和/或它们的混合物和/或在侵入性手术和/或动物器官和/或器官部分中与血液和/或其它体液接触的材料，以及应用和/或结合到所述表面上和/或表面之中的血细胞和/或间皮细胞外层的组分。
本发明中，材料是指适于负荷细胞成分的任何材料。还包括在侵入性手术期间或者与相应的术后护理有关的与血液和/或体液接触的任何材料。
有机化合物是指，例如合成的或天然存在的高分子物质和它们的衍生物。实例有任何类型的塑料、弹性体、硅氧烷或纤维性物质。它们包括，例如聚乙烯(PE)、聚氯乙烯(PVC)、聚氨基甲酸酯(PUR)、聚酰胺(PA)、酚醛塑料(PF)、氨基塑料、聚苯乙烯、聚酯、树脂、硅氧烷、橡胶、人造纤维、纤维素纤维、纤维素膜、蛋白纤维、胶原以及它们的衍生物或其组合。本发明还包括这些聚合物的混合物，即所谓共混聚合物。
在本发明的具体实施方案中，本发明的血液相容性表面可包括动物器官、器官部分或血管系统作为材料。它们可以是，例如心瓣膜和/或血管系统，其中猪和牛是特别适合的来源。
本发明的血液相容性表面包括的无机化合物的实例是金属、金属氧化物、合金或陶瓷、玻璃和/或矿物质以及它们的衍生物或其任何可能的组合物和/或混合物。依据本发明，可以是任何可能的材料的组合。这些实例仅用于详细解释本发明，而不是旨在对其进行限制。
依据本发明，将血细胞和/或间皮细胞外层的组分结合和/或应用于所述材料的表面之中和/或表面上。
在本发明的一个实施方案中，血液相容性表面包括材料表面之中或表面上的糖蛋白，优选血型糖蛋白。所述糖蛋白的特征在于它是非血栓形成性的，因此特别适于制备本发明的血液相容性表面。
红细胞外层的血型糖蛋白决定人类具有的血型。与不同的血型A、B、AB和O类似，相应的红细胞也包含血型糖蛋白A、糖蛋白B或糖蛋白O或者它们分别的混合物。通过与所治疗患者的血型匹配，使血型糖蛋白应用和/或结合于需要使用的本发明血液相容性表面的材料的表面上或表面之中可简单地避免由于血型不合的交叉反应引起的可能的免疫反应，即血液凝固(凝血)，所述匹配实验在侵入性手术前进行。分别的血液试验是实验室普通操作，因此可常规地进行。前提是观察血型相容性，因此包括血型糖蛋白的血液相容性表面也可统一使用，即它们不仅限于某位患者。
本发明还涉及血液相容性表面，该表面的材料表面上和/或表面之中包括血细胞和/或间皮细胞的外层中的糖蛋白、糖脂和/或蛋白多糖的寡糖、多糖和/类脂部分。
在本发明的另一个实施方案中，血液相容性表面的材料表面上和/或表面之中包含鞘糖脂。
本发明的血液相容性表面还可包含蛋白多糖透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素或其混合物的寡糖或多糖部分。在本发明的一个优选实施方案中，血液相容性表面包含来源于动物和/或人的红细胞浆膜中的硫酸乙酰肝素。
本发明的血液相容性表面不存在任何，例如由化学或药学活性涂膜引起的副作用。
血细胞和/或间皮细胞的上述成分是非免疫源性细胞成分。因此，本发明的血液相容性表面的特征在于它们还是非免疫源性的。这意味着它们不引起患者的免疫反应，使血液相容性表面的排斥反应的危险降到最低。
依据本发明，血液相容性表面是非血栓形成性的和/或非免疫源性的。
另一个优点是由于血细胞和/或间皮细胞外层的非血栓形成性成分牢固地附着在本发明的材料上，血液相容性表面几乎不发生降解。因此使血栓形成栓塞的危险降到了最低。此外，细胞，例如凝血细胞不会聚集在本发明的血液相容性表面。因此，也使血栓形成的危险降到最低。
本发明的主题还包括一种制备本发明的血液相容性表面的方法，其中包括分离血细胞和/或间皮细胞的外层中的糖蛋白、糖脂和/或蛋白多糖的血型糖蛋白、寡糖、多糖和/或类脂部分，并将这些细胞组分应用或结合于材料的表面上和/或表面之中，所述材料是人工和/或天然的有机和/或无机化合物和/或它们的混合物和/或在侵入性手术中和/或动物器官和/或器官部分中通过物理或化学结合与血液和/或其它体液接触的材料。
依据本发明，从由人或动物得到的全血和/或细胞部分分离血细胞外层的组分。这意味着细胞组分是从红细胞、白细胞和/或凝血细胞或者它们的混合物分离的。优选的是红细胞和白细胞的混合物。特别优选的是红细胞。
依据本发明，间皮细胞外层的组分是从网膜、腹膜和/或内部器官分离的。
这些原料的简便易得的来源可以是，例如杀戮动物的废弃物。
血细胞、间皮细胞或富含间皮细胞的组织的外层组分的分离可以常规方式进行。可使用，例如下列方法或其组合方法粉碎、提取、过滤、沉淀、凝胶过滤、离子交换色谱、亲和色谱、电泳、酶促或化学降解、干燥、溶解、透析、超滤等。
依据本发明，可通过化学固定、光固定、粘附、干燥或组合使用这些方法使细胞组分应用和/或结合于材料的表面上或表面之中。在此，细胞外层组分与材料表面之间可形成共价键、离子价键、次价键或者静电键或粘附键或其结合形式的作用。优选通过共价键使细胞外层的组分应用或整合到材料的表面上或表面之中。
与目前已知的方法相比，本发明的一个特殊优点是本发明的制备方法结合了多方面的经济成本优势，因此本发明的血液相容性表面适于大量生产。其原因是，例如本发明使用细胞组分而不是活的细胞，因此不必使用患者的内源性(内皮)细胞，并且分离所述细胞组分的原料可简便易得地大量获得(杀戮动物的废弃物)，而无需进行耗时和高成本的细胞培养。本发明的血液相容性表面的另一个优点是它们可统一使用，而不限于仅用于某位患者。总之，在急诊手术的情况下，该优点对于患者的生命是非常重要的。
本发明可应用于非常广泛的领域。本发明涉及血液相容性表面在康复、医疗、牙科、外科手术、美容和/或在侵入性手术期间与血液、组织和/或其它体液相接触领域的广泛应用。
下面用实施例详细地说明本发明，而不是旨在限制本发明1)红细胞浆膜硫酸乙酰肝素的分离将一升洗净血清的红细胞悬浮在1升0.154摩尔磷酸盐缓冲液(pH7)中，加入1U/ml木瓜蛋白酶。在56℃保温2小时后，于3000g离心20分钟，随后滗析上清液。将100ml DEAE Sepharose CL-6B离子交换凝胶(Pharmacia Biotech公司)悬浮在该上清液中。如此负载的凝胶用0.1摩尔盐水溶液洗涤三次后，填充到色谱柱中。以0.1-0.8摩尔/升线性梯度的氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液总体积为2升。收集200份馏分，每份10ml。根据Chandrasekhar等人(AnalyticalBiochemistry，161(1987)130-108)描述的方法，合并对二甲基亚甲蓝(DMMB)显示出阳性呈色反应的馏分。在26.7hPa(20托)和40℃下浓缩收集馏分的溶液并在水中进行透析。将透析液的体积调整至100ml，乙酸钠为0.03摩尔/升，加入0.073摩尔/升的三(三(羟甲基)氨基甲烷(Fluka公司)和pH8.0的1U软骨素酶ABC并在37℃保温15小时。再次在水中进行透析并用真空水泵浓缩，将所得溶液再次应用于100ml DEAE Sepharose CL-6B柱(Pharmacia Biotech。公司)，并如上所述进行洗脱。将DMMB阳性梯度馏分进行透析，在水泵真空下浓缩为1ml体积并用Sephacryl S-300凝胶(Pharmacia Biotech.)经制备性凝胶过滤柱(60cm×2cm)进行色谱。收集60份馏分，每份体积为2ml，用DMMB进行检测，合并阳性馏分。重复透析和冻干，得到纯净的红细胞浆膜硫酸乙酰肝素。2)白细胞表面蛋白-硫酸软骨素的分离在外旋转子离心机(centrifuge with swing-out rotor)中将一升柠檬酸血以3000g速度离心10分钟，弃去上清血浆。将细胞沉淀与冷却到4℃的2升1％草酸铵溶液混合，然后在相同温度下保温30分钟。在500g转速下离心5分钟后，弃去红色的上清液，将沉淀悬浮到冷却到4℃的2升1％草酸铵溶液中，以500g速度离心5分钟，按如上所述的洗涤方法重复洗涤两次以上。弃去现在呈无色的上清液，在25℃和持续搅拌下，将洗涤后的细胞(在2升triton X-100缓冲液(0.5％ triton X-100，10mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8)中得到12×107～10×109个细胞)沉淀溶解2小时。将洗涤剂萃取液在10000g下离心60分钟，弃去，在上清液中，使10ml DEAE Sephadex A50离子交换凝胶(Pharmacia Biotech.公司)悬浮并沉淀。将如此负载的凝胶用0.1摩尔盐水溶液洗涤三次后，填充到色谱柱中。以0.1-0.8摩尔/升线性梯度的氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液总体积为2升。收集100份馏分，每份2ml。合并对二甲基亚甲蓝(DMMB)显示出阳性呈色反应的馏分。在26.7hPa(20托)和40℃下浓缩收集馏分的溶液并在水中进行透析。将透析液的体积调整至100ml，乙酸钙浓度为0.1摩尔/升，乙酸钠浓度为0.1摩尔/升，用乙酸滴定至pH7，分别加入1U肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III，并在37℃保温15小时。再次在水中进行透析并在水泵真空下浓缩，将所得溶液再次应用于10mlDEAE Sepharose A50柱(Pharmacia Biotech.公司)，并如上进行洗脱。将DMMB阳性梯度馏分进行透析，在水泵真空下浓缩为1ml体积并用Sepharose CI-4B凝胶(Pharmacia Biotech.)经制备性凝胶过滤柱(60cm×2cm)进行色谱。收集60份馏分，每份体积为2ml，用DMMB进行检测，合并阳性馏分。重复透析和冻干，得到纯净的白细胞表面蛋白-硫酸软骨素。3)从网膜分离硫酸乙酰肝素/硫酸软骨素混合物将1公斤新鲜的牛网膜用0.9％氯化钠溶液洗涤，冻干，粉碎并用1升丙酮通过在室温下搅拌过夜进行脱脂。过滤并干燥后，将所得粉末悬浮于6摩尔尿素溶液中并在室温下搅拌过夜。在3000g下离心1小时后，滗析粘性上清液，冷却到4℃，与相同体积的4℃的1摩尔氢氧化钠混合并在4℃保温15小时。随后，用稀盐酸中和，用水透析并在3000g下离心1小时，滗析上清液。在该上清液中悬浮100ml DEAESepharose CL-6B离子交换凝胶(Pharmacia Biotech公司)并沉淀。如此负载的凝胶用0.1摩尔氯化钠溶液洗涤三次后，填充到色谱柱中。以0.1-0.8摩尔/升线性梯度的氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液总体积为2升。收集200份馏分，每份10ml。合并对二甲基亚甲蓝(DMMB)显示出阳性呈色反应的馏分。在26.7hPa(20托)和40℃下浓缩收集馏分的溶液并在水中进行透析。在水泵真空下再次浓缩至5ml体积，并用Sephacryl S-300凝胶(Pharmacia Biotech.)经制备性凝胶过滤柱(60cm×2cm)进行色谱。收集60份馏分，每份体积为10ml，用DMMB进行检测，合并阳性馏分。重复透析和冻干，得到纯净的间皮细胞表面糖胺聚糖混合物。4)从富含间皮细胞的组织分离间皮细胞表面硫酸软骨素将1公斤新鲜的牛肾用0.9％氯化钠溶液洗涤，冻干，粉碎并用1升丙酮通过在室温下搅拌过夜进行脱脂。过滤并干燥后，将所得粉末悬浮于4摩尔盐酸胍溶液中并在室温下搅拌过夜。在3000g下离心1小时后，滗析粘性上清液，冷却到4℃，与相同体积的4℃的1摩尔氢氧化钠混合并在4℃保温15小时。随后，用稀盐酸中和，用水透析并在3000g下离心1小时，滗析上清液。在该上清液中悬浮100mlDEAE Sepharose CL-6B离子交换凝胶(Pharmacia Biotech公司)并沉淀。如此负载的凝胶用0.1摩尔氯化钠溶液洗涤三次后，填充到色谱柱中。以0.1-0.8摩尔/升线性梯度的氯化钠溶液进行洗脱，洗脱液总体积为2升。收集200份馏分，每份10ml。合并对二甲基亚甲蓝(DMMB)显示出阳性呈色反应的馏分。在26.7hPa(20托)和40℃下浓缩收集馏分的溶液并在水中进行透析。将透析液的体积调整至100ml，乙酸钙浓度为0.1摩尔/升，乙酸钠浓度为0.1摩尔/升，用乙酸滴定至pH7，分别加入1U肝素酶I、肝素酶II和肝素酶III，并在37℃保温15小时。再次在水中进行透析并在水泵真空下浓缩，将所得溶液再次应用于10ml DEAE Sephacel柱并如上进行洗脱。分析DMMB阳性梯度馏分，在水泵真空下浓缩为1ml体积并用Sephacryl S-300凝胶经制备性凝胶过滤柱(60cm×2cm)进行色谱。收集60份馏分，每份体积为10ml，用DMMB进行检测，合并阳性馏分。重复透析和冻干，得到纯净的间皮细胞表面硫酸软骨素。5)用(N-环己基-N’-2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基甲苯磺酸酯(CME-CDI)将间皮细胞表面硫酸软骨素固定于功能纤维素表面100mg纤维素膜加到2％ 3-氨基丙基三乙氧基硅烷在乙醇/水(50∶50)中的溶液中并在45℃下搅拌24小时。随后，该膜用大量水洗涤并干燥。将如此处理的膜浸渍于1mg间皮细胞表面硫酸软骨素在80ml 0.1摩尔2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(pH4.75)中的溶液中。在4℃经过6小时后，加入200mg(N-环己基-N’-2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基甲苯磺酸酯(CME-CDI)(Sigma公司)，每次10mg并进一步在4℃搅拌过夜。随后，在4摩尔氯化钠溶液中搅拌2小时，用大量水洗涤并通风干燥。6)用CNCI将鞘糖脂固定于玻璃上将一块玻璃，例如显微镜的盖玻片在5ml铬硫酸中搅拌6小时。随后，用大量水洗涤，空气干燥后，在15ml二噁烷中加热到50℃。然后，加入2.5ml 2摩尔N，N’-二异丙基乙基胺的二噁烷溶液并搅拌30分钟。之后，加入2.5ml 1摩尔CNCI的二噁烷溶液并再搅拌2小时。而后，先用二噁烷洗涤，再后用二噁烷/水洗涤，最后用纯水洗涤。将如此修饰的玻璃插入20ml 1mol/l乙二胺和0.1mol/l碳酸氢钠的溶液中，然后加热至50℃，并在该温度下搅拌72小时。将0.1mg人红细胞鞘糖脂溶于20ml 0.1摩尔碳酸氢钠溶液中并在60℃下与取代的玻璃搅拌110小时。随后，加入2.5ml乙醇胺并再搅拌30分钟。将包被的玻璃用4摩尔氯化钠溶液洗涤，之后再用大量水洗涤并空气干燥。7)将红细胞浆膜硫酸乙酰肝素固定于镍、钛、铝或类似金属的氧化层上在超声浴中，将金属工件用热水清洗、丙酮清洗4小时，然后在Soxhlet萃取器中用氯仿脱脂1小时。使洗净的工件干燥并在0.01-0.1摩尔ω-十六碳烯基三氯硅烷的二环己烷溶液中搅拌下浸渍2-15分钟，用氯仿和水洗涤两次，在Soxhlet萃取器中用氯仿萃取15分钟。在0℃下，使工件在2ml丙酮和100mg KMnO4在18ml水中的溶液中浸渍45分钟，并往其中充分通入CO2气流。随后，在20％亚硫酸氢钠水溶液中浸渍15秒，用水洗涤并干燥。
在40℃下，使工件在29.25g对甲苯磺酰氯在900ml丙酮和180ml吡啶中的溶液中搅拌过夜。随后，工件用水和甲醇洗涤并于60℃下在1mmol/l二氨基十二烷在1升二甲基甲酰胺中的溶液中搅拌40小时。之后，工件顺序用水、1mol/l苏打溶液、1mmol/l盐酸和水洗涤。使如此制备的工件在硼酸盐缓冲液(四硼酸钠0.065mol/l，pH9.5中搅拌90分钟。最后，于37℃下在0.3g 4-叠氮基-1-氟-2-硝基苯在1升乙醇中的溶液中搅拌过夜。将0.5g红细胞浆膜硫酸乙酰肝素溶于1升0.1摩尔2-(N-吗啉代)乙磺酸-(MES)-缓冲液(pH4.75)中并使该工件在4℃搅拌48小时。使用高压汞灯照射10分钟使该红细胞浆膜硫酸乙酰肝素共价固定。用4摩尔盐水溶液洗涤40分钟后，将该工件用水洗涤并干燥。8)白细胞浆膜硫酸软骨素通过光化学固定于纤维素上使3g纤维素膜在4摩尔氢氧化钠溶液中溶胀2小时，用水洗涤三次，用水/丙酮洗涤一次并用丙酮洗涤一次。在40℃下，将如此活化的纤维素在29.25g对甲苯磺酰氯在900ml丙酮和180ml吡啶中的溶液中搅拌过夜。随后，纤维素膜用水和甲醇洗涤。将所得的酯化纤维素膜于60℃下在1mmol/l二氨基十二烷在1升二甲基甲酰胺中的溶液中搅拌40小时。之后，该膜顺序用水、1mol/l苏打溶液、1mmol/l盐酸和水洗涤。使如此获得的氨基纤维素在硼酸盐缓冲液(四硼酸钠0.065mol，pH9.5)中搅拌90分钟。最后，使该膜于37℃下在0.3g 4-叠氮基-1-氟-2-硝基苯在1升乙醇中的溶液中搅拌过夜。将0.5g白细胞表面硫酸软骨素溶于1升0.1摩尔2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(pH4.75)中并与2.5g如上所述制备的叠氮基纤维素在4℃搅拌48小时。使用高压汞灯照射10分钟使该白细胞表面硫酸软骨素共价固定。用4摩尔盐水溶液洗涤40分钟后，水洗涤并干燥纤维素膜。9)用戊二醛将血型糖蛋白A固定于硅氧烷上往1g硅氧烷膜中，加入20ml水和2ml 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，pH定为3.5。随后，在75℃加热2小时，用水洗涤并干燥。向所得含氨基的硅氧烷中，加入2.5％戊二醛在0.05摩尔磷酸钠缓冲液中的溶液(pH7)。在室温下搅拌60分钟后，在搅拌下使如此制备的活化硅氧烷与0.1％血型糖蛋白A(Sigma)反应2-4小时，然后用水洗涤。10)红细胞浆膜硫酸乙酰肝素固定于聚氯乙烯(PVC)上将0.5g硫酸铁(II)、100μl浓硫酸和2ml甲基丙烯酸溶于250ml水中。往该溶液中加入125mg亚硫酸氢钠和125mg过硫酸钾。随后，在室温下将该溶液泵入长度为1m、内径为3mm的环状PVC管2小时。通过加入100mg氢醌使如此发生的接枝聚合反应停止。随后，该管用水充分洗涤。在4℃下，将冷却到4℃的250mg CME-CDI(N-环己基-N’-2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基甲苯磺酸酯)在250ml 0.1摩尔2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(pH4.75)中的溶液以30分钟一次循环的速率泵入管中。如此活化的管用0.1摩尔2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(pH4.75)洗涤。随后，将1mg红细胞浆膜硫酸乙酰肝素在0.1摩尔2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(pH4.75)中的溶液以15小时一次循环的速率泵入管中。最后，该管用4摩尔盐水溶液洗涤，之后用水洗涤。
权利要求
1.血液相容性表面，特征在于它们包含作为材料的人工和/或天然有机化合物和/或无机化合物和/或它们的混合物和/或在侵入性手术和/或动物器官和/或器官部分中与血液和/或其它体液接触的材料，以及应用和/或结合到所述材料表面上和/或表面之中的血细胞和/或间皮细胞的外层组分。
2.权利要求1的血液相容性表面，特征在于它们是非血栓形成性的和/或非免疫源性的。
3.权利要求1或2的血液相容性表面，在材料的表面上和/或表面之中包含血型糖蛋白。
4.权利要求1-3任一项的血液相容性表面，在材料的表面上和/或表面之中包含血细胞和/或间皮细胞外层的糖蛋白、糖脂和/或蛋白多糖的寡糖、多糖和/或类脂部分。
5.权利要求1-4任一项的血液相容性表面，在材料的表面上和/或表面之中包含鞘糖指。
6.权利要求1-5任一项的血液相容性表面，在材料的表面上和/或表面之中包含蛋白多糖透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素或其混合物的寡糖或多糖部分。
7.权利要求1-6任一项的血液相容性表面，在材料的表面上和/或表面之中包含来源于动物和/或人的红细胞浆膜的硫酸乙酰肝素。
8.权利要求1-7任一项的血液相容性表面，包含作为材料的高分子有机化合物和/或金属、金属氧化物、合金、陶瓷、玻璃、矿物质和/或上述材料的混合物。
9.一种制备血液相容性表面的方法，特征在于a)从血细胞和/或间皮细胞的外层分离糖蛋白、糖脂和/或蛋白多糖的血型糖蛋白、寡糖、多糖和/或类脂部分，和b)将所述细胞组分应用或结合于材料的表面上和/或表面之中，所述材料是人工和/或天然的有机和/或无机化合物和/或它们的混合物和/或在侵入性手术中和/或动物器官和/或器官部分中通过物理或化学结合与血液和/或其它体液接触的材料。
10.权利要求9的方法，特征在于血细胞外层的组分是从由人或动物得到的全血细胞和/或细胞部分分离的。
11.权利要求9或10的方法，特征在于所述细胞组分是从红细胞、白细胞和/或凝血细胞和/或这些细胞的混合物分离的。
12.权利要求9-11的方法，特征在于间皮细胞的外层组分分离于网膜、腹膜和/或内部器官。
13.权利要求9-12的方法，特征在于可通过化学固定、光固定、粘附、干燥或组合使用这些方法使细胞组分应用和/或结合于材料的表面上或表面之中。
14.权利要求1-8任一项的血液相容性表面在康复、医疗、牙科、外科手术、美容和/或在侵入性手术中与血液、组织和/或其它体液相接触的领域中的广泛应用。
全文摘要
本发明涉及血液相容性表面,特征在于将血细胞和/或间皮细胞外层的组分应用于和/或结合于材料的表面上和/或表面之中。本发明还涉及制备血液相容性表面的方法以及它们在康复、医疗、牙科、外科手术、美容和/或与血液、组织和/或其它体液直接相关的领域的广泛应用。
文档编号A61L33/00GK1341033SQ00804233
公开日2002年3月20日 申请日期2000年2月24日 优先权日1999年2月26日
发明者迈克尔·赫夫曼, 罗兰·霍里斯 申请人:迈克尔·赫夫曼, 罗兰·霍里斯