专利名称：共价桥接的胰岛素二聚物的制作方法
描述本发明涉及新颖的胰岛素类似物和含有该胰岛素类似物的药物，制备治疗糖尿病药物的方法和制备胰岛素类似物的方法。
蛋白激素胰岛素产生于胰岛β细胞。其重要的生理效应包括降低血液中葡萄糖水平。胰岛素缺乏可导致复杂的不正常葡萄糖代谢型糖尿病(I型)。
可采用药用制剂中的胰岛素和胰岛素类似物治疗糖尿病。在应用最广的替代疗法中，胰岛素采用皮下给药。该法最常见的的副作用是可组成低血糖症(低血糖水平)。尽管已持续开发了治疗糖尿病的胰岛素药用制剂，但是依然在研究有望保持其效能的同时又可减少副作用的新的胰岛素类似物。例如，通过转座氨基酸脯氨酸B28和赖氨酸B29，开发出了一种速效“胰岛素lispro”(EP0383472 B1)。另外，通过对赖氨酸B29的ε一氨基进行脂肪酸酰化开发出了一种长效胰岛素衍生物(J.Markussem，S.Havelund，P.Kurtzhals，.A.Andersen，J.Halstrom，E.Hasselager，U.D.Larsen，U.Ribel.L.Schaffer，K.Vad，I.Jonassen，Diabetologia，1996年，39281-288页)。尽管对人胰岛素天然结构进行这样的修饰可影响到胰岛素的作用时程，但是许多问题仍不能解决因为还没有一种用于治疗的胰岛素类似物，可保证仅通过对部分组织的特异性特别是肝选择性来达到对生理状态更有目的性的治疗。也没有报道表明采用比天然结构的人胰岛素或动物胰岛素更少量的胰岛素类似物可产生更强的效力。
用于治疗糖尿病的所有胰岛素通常是分子量为6000的单体胰岛素分子。已证实所有的单体胰岛素类似物和衍生物是部分或完全的胰岛素激动剂(S.Gammeltoft，Physiol.Rev.1984年，641321页)，并且受体结合与生物信号的触发之间显示有密切的相关性。仅在一些情况下，例如共价桥键合的胰岛素二聚物可观察到受体结合与生物活性之间存在矛盾之处(A Schuttler，D.Brandenburg，Hoppe Seyler′s Z.Physiol.Chem.1982年，363317-330页；M.Weiland，C.Brandenburg，D.Brandenburg，H.G.Joost，Proc.Natl.Sci.USA 1990年，871154-1158页)。另外已证实胰岛素二聚物可辨别不同组织中的胰岛素受体(M.Breiner，M.Weiland，W.Becker，D.Muller-Weiland，R.Streicher，M.Fabry，H.G.Joost，Molecular Pharmacology，1993年，44271-276页)。因此它们在病理状态的诊断方面非常重要。
目前的所有二聚物包括由两种天然长度的胰岛素通过共价桥键合而成。人们对胰岛素二聚物用于治疗有很大兴趣，因为它们在动物试验中显示有相对的肝选择性(已经具有天然胰岛素结构的B1，B1′-辛二酰-胰岛素二聚物证实，F.Shojaee-Moradie，N.C.Jackson，M.Boroujerdi，D.Brandenburg，P.H.Sonksen，R.H.Jones，Diabetologia，1995年，381007-1013页)，这样与目前糖尿病疗法采用的所有胰岛素相比，就可能产生更大的血糖水平的生理下降。然而，这里所采用的B1，B1′-辛二酰-胰岛素二聚物的体外生物活性要明显地比受体结合低(28.8％157-199％，M.A.Tatnell，R.H.Jones，K.P.Willey，A.Schuttler，D.Brandenburg，Biochem.J.1983年，216687-694页)。生物活性与受体结合的比率非常低，约0.15-0.18。因此，将这些发现无法应用或进一步开发用于糖尿病疗法。
现在，我们设计并合成了新颖的胰岛素二聚物即下文的胰岛素类似物，基于它们的特性，有望解决上述提及的问题并改进糖尿病疗法。与目前疗法所采用的单体胰岛素相比，我们方法的独特特点是该胰岛素类似物及其生理可接受的盐由两种相同或不同胰岛素单体通过共价桥键连接而成，其中胰岛素单体选自人胰岛素、动物胰岛素及它们的衍生物，并且胰岛素类似物的两种胰岛素单体中至少有一种为衍生物。具体地说，所有的胰岛素类似物是其B链的C-端被截去而且对部位B26进行了修饰。用可链接蛋白质的物质桥接胰岛素单体。这种物质和方法是已知的。具体地说，该新颖的胰岛素类似物优选在两种胰岛素单体的B链上N-端氨基酸之间桥接，特别优选形成于式(CR，R′)n(CO-)2的直链或支链的双功能羧酸残基，其中n，R，R′如下面式I定义。动物胰岛素的实施例是猪、猴子、牛和鸡胰岛素。胰岛素衍生物，是通过对相应的或相同的胰岛素进行取代和/或去掉至少一种天然氨基残基和/或加上至少一种氨基残基和/或有机残基而获得的衍生物。胰岛素衍生物单体的一个实施例是Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)人胰岛素，本发明二聚胰岛素类似物的一个实施例是B1，B1-Sub-[D-AlaB26]-脱-[B27-B30]-胰岛素-B26-酰胺胰岛素二聚物。胰岛素类似物可如式I的具体描述。 其中X 独立地为支链或非支链C1-C10-烷基，单或多取代的芳香基，C1-C10-烷基，单或多取代或未取代的O-芳香基，氨基酸或其衍生物，或式NRR′基团；R，R′ 为H，NH2，支链或非支链C1-C10-烷基或单或多取代或未取代的芳香基；n 为1，2……16本发明进一步涉及如上述式I所描述的胰岛素类似物，其中X为羧酸经酰胺化的氨基酸衍生物。
本发明进一步涉及如上述式I所描述的胰岛素类似物，其中X为羧酸经酰胺化的氨基酸肌氨酸。
本发明进一步涉及如上述式I所描述的胰岛素类似物，其中两个B链中的X残基彼此不同。
本发明进一步涉及如上述式I所描述的胰岛素类似物，其中X为氨基。
本发明还涉及含有该胰岛素类似物的药物，制备治疗糖尿病药物的方法和制备胰岛素类似物的方法。
采用已知方法，用预活化的二羧酸将两个任选部分保护的单体分子桥接，即可制得胰岛素类似物(A Schuttler，D.Brabdenburg，HoppeSeyler′s Z.Physiol.Chem.1982年，363317-330页)。通过酶催化的半合成或基因操作方法制得单体类似物(参见本发明实施例)。
本发明还进一步涉及制备上述胰岛素类似物的方法，其中(a)通过酶催化的半合成或基因操作方法制得单体胰岛素类似物，(b)用保护基团对步骤(a)获得的单体胰岛素类似物提供任选部分保护，(c)用预先活化的二羧酸与步骤(b)获得的保护的单体胰岛素类似物和/或步骤(a)获得的单体胰岛素类似物反应，和(d)将步骤(c)获得的胰岛素类似物从反应混合物中分离出来。
与人胰岛素和单聚胰岛素相比，本发明二聚物在体外对胰岛素受体有特别高的亲和力和高效力，其比胰岛素效应可高达20倍。
与先前公开的共价胰岛素二聚物相比，该新颖的二聚物显示有非常高的生物活性。生物活性与受体结合的比率至少为2，并且在某些情况下可高达4-5。这样，它们具有非常高的生物效力。将这些比例系数与文献中描述的B1，B1′-辛二酰二聚物的比较，表明至少11倍(0.182)，最高达28倍。
具体地说，本发明胰岛素二聚物的优点在于1.与目前治疗中采用的胰岛素和所有类似物比较，可望具有相对肝选择性，这样其作用就更符合生理模式(其主要的作用位点是肝而不是边缘)。
2.与先前公开的胰岛素二聚物比较，第一次明显地提高了生物效能。
3.与胰岛素和单体类似物比较，其生物活性显著升高，这非常有利，因为使用非常小量的该活性物质即可达到相同的效应。
实施例缩略语AA 氨基酸Ac 醋酸根(CH3COO-)Alox 氧化铝(Al2O3)CZE毛细管区带电泳DIPEA N，N-二异丁乙胺DMF二甲基甲酰胺DMSO 二甲基亚砜DOI脱八肽(Desoctapeptide)胰岛素Eq 当量Fmoc 9-芴基甲氧羰基HOBt 1-羟基苯并三唑HPCL 高效液相色谱MALDI 基质assisted激光解吸附/电离
MPLC 中压液相色谱Msc甲磺酰乙氧基羰基MW 分子量NaOH 氢氧化钠NMWN-甲基吗啉RP 反相ONSu N-氧琥珀酰亚胺酯Sar肌氨酸Sub辛二酰TBTU 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸TEA三乙胺TFA三氟醋酸TOFflight时间TPCK 甲苯磺酰基-L-苯丙氨酰基氯甲基酮Tris 三-(羟甲基)氨基甲烷实施例1合成B1，B1′-Sub-[SarB26]-脱-(B27-B30)-胰岛素-B26-酰胺胰岛素二聚物合成四肽Gly-Phe-Phe-Sar-NH2在4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)酚氧树脂上用Fmoc保护基团手段合成肽。用于偶合的Fmoc-氨基酸残基采用TBTU/HOBt法形成，并且过量于树脂标示负载量3-摩尔。按下述合成方案合成肽
*)如果呈阳性则继续**)如果呈阴性则继续；如果呈阳性则重复步骤6-9加入含95％TFA、4％水和1％三乙基硅烷为阳离子捕集器的10ml消除溶液，将肽从树脂上经酸解脱掉。室温下搅拌2小时后，过滤树脂并用二氯甲烷洗涤。滤液蒸发至干燥。
用RP-MPLC柱色谱进一步纯化肽，梯度为线性2-丙醇梯度(每400ml的0.07％TFA初缓冲液和补充缓冲液中含0-40％的2-丙醇)。以Nucleosil20-C18为固定相。流速为180-200ml/小时(产率82.6％)。半合成[SarB26]-脱-(B27-B30)-胰岛素-B26-酰胺将四肽与NαAl-Msc-脱-(B23-B30)-胰岛素进行酶偶合，合成B链C-端被截去的胰岛素。开始时有必要将天然胰岛素酶解为DOI，这样就可部分地提供保护基团。合成脱-(B23-B30)-胰岛素将300mg(51.66微摩尔)胰岛素加到60ml反应缓冲液(0.05MTris，1毫摩尔CaCl2)中。用固体Tris将pH值调节为9.5后，加入16mg经TPCK处理的胰蛋白酶开始蛋白水解降解。37℃水浴中孵育约6小时，用RP-HPLC检测反应进度。加入4ml冰醋酸中止反应，用旋转蒸发器浓缩反应混合物。先用Sephadex G25f接着用Sephadex G50f凝胶过滤处理。冻干产物(产率73.3％)。MW4865合成NαAl-Msc-脱-(B23-B30)-胰岛素将300mg(61.66微摩尔)脱-(B23-B30)-胰岛素溶解于含225μlTEA的22.5ml DMSO中。轻轻搅拌的同时加入含18mg(67.86微摩尔)Msc-ONSu的5mlDMSO溶液。反应20分钟后，加入750μl冰醋酸中止反应，反应液用软化水于4℃下透析16小时。冷冻干燥渗余物。在SP-Sepharose(pH值3；350ml初缓冲液和补充缓冲液350ml 0.09M的NaCl)进行离子交换色谱，并在Sephadex G25f上脱盐以进一步纯化。冻干产物(产率30.8％)。MW5015.16将Gly-Phe-Phe-Sar-NH2经胰蛋白酶偶合到NαAl-Msc-脱-(B23-B30)-胰岛素上将132.75mg(300微摩尔)Gly-Phe-Phe-Sar-NH2和150.45mg(30微摩尔)NαAl-Msc-脱-(B23-B30)-胰岛素溶解或混悬于含2ml的DMF(搅拌Alox)、2ml的1，4-丁二醇和400μl的0.05MCa(CH3COO)2溶液中。用NMM将表观pH值调节为6.7-7.0后，将溶解于100μl 0.05M Ca(CH3COO)2溶液中的23mg经TPCK处理的胰蛋白酶加到反应混合物中。在反应期间，用RP-HPLC检测反应进度，并监测和用NMM调节pH值。经4.5小时转化率可达90％。加入4.5ml 30％强度乙酸中止反应。用Sephadex G 50 f凝胶色谱除去酶、肽和其它低分子物质。用RP-HPLC纯化并回收未反应的肽。进一步纯化胰岛素衍生物可采用Nucleosil 20-C18(直径2.0cm、长25.0cm，带有5.0cm预柱)制备RP-HPLC(产率48.6％)。MW5290.2合成B1.B1′-Sub-[SarB26]-脱-(B27-B30)-胰岛素-B26-酰胺胰岛素二聚物将100mg(18.9微摩尔)NαAl-Msc-[SarB26]-脱-(B27-B30)-胰岛素-B26-酰胺溶解于含400μlDMSO、8.7μlDMF和9.5μl NMM溶液中，加入5.5当量HOBt。30分钟后，加入0.6当量固态辛二酸双-ONSu并搅拌8-30小时。在含300μl冰醋酸的1.5ml10％强度乙酸中处理整个反应混合物，并用Sephadex G50f凝胶色谱处理。冻干二聚物流分。为了除掉Msc基团，将100mg Msc-保护的蛋白质溶解于含5ml二恶烷/水(2/1，v/v)并冷却至0℃。加入514μl 2N的NaOH，0℃下搅拌混合物120秒。加入2.2ml冰醋酸中止反应。反应混合物过Sephadex G25f凝胶色谱并冻干(产率11.9％)。
中间体和终产物的定性可采用RP-HPLC、酸性CZE和MADLDI-TOF质谱(表1)
表1RP-HPLC、CZE测定的合成B1，B1′-Sub-[SarB26]-脱-(B27-B30)-胰岛素-B26-酰胺胰岛素二聚物的产率、纯度和质量
*钠加合物(M＝23)实施例2合成B1，B1′-Sub-[D-AlaB26]-脱-(B27-B30)-胰岛素-B26-酰胺胰岛素二聚物除了采用合成四肽Gly-Phe-Phe-D-Ala-NH2以外，这种截短的胰岛素二聚物的合成类似于上述实施例1。其产率、纯度和质量见表2。
表2RP-HPLC、CZE测定的合成B1，B1′-Sub-[D-AlaB26]-脱-(B27-B30)-胰岛素-B26-酰胺胰岛素二聚物的产率、纯度和质量
*钠加合物实施例3合成B1，B1′-Sub-[GluB26]-脱-(B27-B30)-胰岛素-B26-酰胺胰岛素二聚物除了采用合成四肽Gly-Phe-Phe-Glu-NH2以外，这种截短的胰岛素二聚物的合成类似于上述实施例1。其产率、纯度和质量见表3。
表3RP-HPLC、CZE测定的合成B1，B1′-Sub-[GluB26］－脱-(B27-B30)-胰岛素-B26-酰胺胰岛素二聚物的产率和纯度及质量
实施例4实施例1-3的生物学性质一方面根据受体结合、另一方面根据体外生物活性，测定实施例1-3所描述的B1，B1′-Sub-[Sar、D-Ala或GluB26]-脱-(B27-B30)-胰岛素-B26-酰胺胰岛素二聚物的生物性质。
通过对IM-9淋巴细胞的置换研究测定受体结合。通过葡萄糖转运形式在培养的3T3-L1脂肪细胞上测定相对生物活性。表4表示合成胰岛素二聚物的结合亲和力和相对生物活性。
表4所有胰岛素二聚物与天然胰岛素的相对受体结合(测定IM-9淋巴细胞)和相对生物活性(测定培养的3T3-L1脂肪细胞)比较
参考文献1. J.Markussen，S.Havelund，P.Kurtzhals，A.A.Andersen，J.Halstrm，E.Hasselager，U.D.Larsen.U.Ribel，L.Schffer，K.Vad，l.Jonassen，Diabetologia 1996年39，页281-288。2. EP0383472B13. S.Gammeltoft，Physiol Rev.1984，64，p.1321。4. A Schüttler，D.Brandenburg，Hoppe Seyler’s Z.Physiol.Chem.1982，363，pp.317-330。5. M.Weiland，C.Brandenburg，D.Brandenburg，H.G.Joost，Proc.NatlAcad.Sci USA 1990 87，pp.1154-1158。6. M.Breiner，M.Weiland，W.Becker，D.Müller-Wieland，R.Streicher，M.Fabry，H.G.Joost，Molecular PharmaGology 1993，44，pp.271-276.7. F.Shojaee-Moradie，N.C.Jackson，M.Boroujerdi，D.Brandenburg，P.H.Snksen，R.H.Jones，Diabetologia 1995，38，pp.1007-1013。8. M.A.Tatnell，R.H.Jones，K.P.Willey，A.Schüttler，D.Brandenburg，Biochem.J.1983，216，pp.687-694。
权利要求
1.由两种相同或不同胰岛素单体通过桥键共价连接而成的胰岛素类似物及其生理可接受的盐，其中胰岛素单体选自人胰岛素、动物胰岛素及它们的衍生物，且其中胰岛素类似物中至少存在一种人胰岛素或动物胰岛素衍生物。
2.如权利要求1的胰岛素类似物，其特征在于式I 其中X 独立地为支链或非支链C1-C10-烷基，单或多取代的芳香基，C1-C10-烷基，单或多取代或未取代的O-芳香基，氨基酸或其衍生物，或式NRR′基团；R，R′为H，NH2，支链或非支链C1-C10-烷基或单或多取代或未取代的芳香基；n 为1，2……16
3.如权利要求2的胰岛素类似物，其中X为羧酸经酰胺化的氨基酸。
4.如权利要求3的胰岛素类似物，其中X为氨基酸肌氨酸。
5.如权利要求2或3之一或更多的胰岛素类似物，其中两个B链中的X残基彼此不同。
6.如权利要求2或3之一或更多的胰岛素类似物，其中X为氨基。
7.B1，B1-Sub-[SarB26]-脱-(B27-B30)-胰岛素-B26-酰胺胰岛素二聚物。
8.B1，B1-Sub-[D-AlaB26]-胰岛素-B26-酰胺胰岛素二聚物。
9.B1，B1-Sub-[GluB26]-脱-(B27-B30)-胰岛素-B26-酰胺胰岛素二聚物。
10.一种药用制剂，包括如权利要求1-9之一或更多的胰岛素类似物和选自锌盐、苯酚、间-甲酚、甘油和缓冲物质的附加剂。
11.一种制备治疗糖尿病的包括如权利要求1-9之一或更多的胰岛素类似物的药物的方法。
12.如权利要求1-9之一或更多的胰岛素类似物用作药物。
13.一种诊断试剂盒，其中包括权利要求1-9之一或更多的一种或多种胰岛素类似物。
14.一种制备如权利要求1-9之一或更多的胰岛素类似物的方法，其中(a)通过酶催化的半合成或基因操作方法制得单体胰岛素类似物，(b)用保护基团对步骤(a)获得的单体胰岛素类似物提供任选部分保护，(c)用预先活化的二羧酸与步骤(b)获得的保护的单体胰岛素类似物和/或步骤(a)获得的单体胰岛素类似物反应，和(d)将步骤(c)获得的胰岛素类似物从反应混合物中分离出来。
全文摘要
本发明涉及式(I)的胰岛素类似物,其中X独立地为支链或非支链C
文档编号A61P5/48GK1341122SQ00804198
公开日2002年3月20日 申请日期2000年2月24日 优先权日1999年2月24日
发明者H·霍克, C·哈温尼斯, D·布兰登博格 申请人:阿文蒂斯药物德国有限公司