专利名称：通过多位点结合的寻靶多体造影剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于诊断成像的造影剂。具体说，本发明涉及新型多体化合物，其在结合时表现出改善的与生理相关的靶标如蛋白质的亲和力和惊人地改善的的弛豫率(relaxivity)特性。这种化合物包括a)两个或多个影像增强的部分(“IEMs”)；b)两个或多个靶标结合的部分(“TBMs”)，提供体内定位和多体刚性化；c)用于上述部分连接的构架(“骨架”)；d)将IEMs连接于构架的任选的连接基(“连接基”)。
本发明还涉及包含这些化合物的药物组合物，和在成像过程中用这些化合物和组合物于反差增强的用途。
背景技术：
诊断成像方法如磁共振成像(MRI)、X-射线、核放射性药物成像、紫外线-可见光-红外线光成像和超声，已多年用于医学诊断。人们用添加的造影剂来改善或增加成像的分辨率或提供特定的诊断信息。在一些情况中如用超声波进行成像，造影剂的引入还是最近的事。
为了有效，造影剂必须与成像方法中所用的电磁辐射的波长相干涉，改变组织的物理特性来得到改变的信号，或在放射性药物的情况中自身提供放射源。MRI和光学成像方法是独特的成像技术，因为它们产生对化学环境敏感的复杂信号。虽然无论这些试剂在血浆中是游离的、或是结合于蛋白质或其它靶标、或被捕获于骨骼中，从X-射线或放射性核素试剂得到的信号都是保持相同的，但一些MRI和光学成像的造影剂在不同的生理环境中有不同的信号特性。一种光学染料在结合时可表现出其吸光度、反射率、荧光、磷光、化学发光、散射或其它光学特性的变化。重要的是，造影剂必须充分灵敏且存在的浓度足够高，从而能够观察到信号的变化。
通过增加IEM的数量来改善对比度的尝试寻靶试剂应送递有意义的浓度的成像部分到靶标，从而在成像过程中能观察到信号的充分改善。获得充足的灵敏度是一重要的问题，尤其对MRI而言，其需要浓度范围为10-1000微摩尔(μM)的影像增强的部分来产生足够的信号。如果要寻找的靶标以低浓度存在时，对寻靶试剂而言这一问题又进一步复杂化。例如，为了将以低于μM浓度存在的生物受体靶标成像，在靶标部位需要更大地提高信号来提供充足的成像对比度。业已通过用(1)药物送递载体，提供高局部浓度的造影剂，(2)单个造影剂中含有多个IEM[参见，Martin V.V.，等人Bioconjug.Chem.，6第616-23页(1995)；Shukla，R.等人.，Mag.Reson.Med.，35第928-931(1996)；Ranganathan，R.S.，等人，Invest.Radiol.，33第779-797页(1998)]，或(3)具有改善的信号增强特性的特定结构的IEM，来达到增加对比度的目的。理想的寻靶造影剂应有效地将IEM和改善的信号增强特性结合在一起。
为了将大量影像增强的部分结合到造影剂中，已将高浓度低分子量的造影剂装在合适的药物送递载体中，如聚合载体或脂质体[Bulte J.W.，等人，J.Magn.Reson.Imaging，9第329-335页(1999)]。不幸的是，这些材料很难指向靶标。
为了增加影像增强部分的数量，研究者已经创造了例如与多个IEM相缔合的聚合物、树枝状聚合物(dendrimer)、和有机化合物。大量IEM如用于MRI的Gd(III)螯合物可以共价连接于聚合物上[Schunmann-Giapieri，G.等人，J.Invest.Rad.，26第969-974页(1991)；Corot，C.等人Acta Rad.，38S412第91-99页(1997)]和树枝状聚合物上[Jacques，V.，等人，J.Alloys Cmpd.，249第173-177页(1997)；Margerum，L.D.，等人，J.Alloys Compd.，249第185-190(1997)；Toth，E.，等人Chem.Eur.J.2第1607-1615页(1996)]。聚合试剂通常包括分子量分布很宽并很复杂的品种的混合物。这些异质的特性对该试剂的性能有不良影响，且使表征变得困难。另外，在合成上很难选择性地将TBM和多种IEM一起引入。因此，需要一种良好确定的同质分子用作能对靶标提供充足成像增强作用的造影剂。
理论上树枝状聚合物(如“星芒树枝状聚合物”或“瀑布状树枝状聚合物)提供了一种单高分子量的能让许多IEM共价连接的品种[Fischer，M.等人，Angew，Chem.，Int.Ed.Eng.，38/7第884-905页(1999)；Weiner，E.C.等人，Mag.Reson.Med.，31第1-8页(1994)]。然而，与聚合物试剂一样，树枝状聚合物存在明显的合成上的问题，尤其当选择性地引入组织特异性寻靶基团时。
已合成了带有多个影像增强部分的有机分子。本文将这种类型的MRI造影剂称为“多体螯合物”或“多体”，通常含有2-12个IEM[Shukla，R.等人，Mag.Reson.MEd.，35第928-931页(1996)；Shukla，R.B.，等人，Acta Radiol.412第121-123页(1997)；Ranganathan，R.S.，等人，Invest.Radiol.，33第779-797页(1998)]。多体螯合物的优点包括(1)它们是均质的分子，因此与聚合物和树枝状聚合物不同，它们具有单一的大小和结构，(2)它们易合成和纯化，和(3)容易结合入寻靶基团。不幸的是，多体螯合物改善MRI信号强度的能力令人失望地低。这是因为由于IEM数量的增加，与增强信号相关的质子弛豫速率的增强降低了。因此，需要一种增加IEM数量时弛豫率不减少的造影剂来完成对靶的更高的信号增强。
通过减少造影剂的转动来改善对比度的尝试已尝试了通过限制转动运动来增加非-寻靶多体MRI造影剂的弛豫。限制转动运动的尝试着重于(1)减少分子的柔韧性或(2)通过与靶标结合限制转动运动。
例如，已合成了带有连接多个Gd(III)螯合物的刚性构架的非-寻靶试剂[Shukla，R.等人，Mag.Reson.Med.35第928-931页(1996)；Shukla，R.B.，等人ActaRadiol.412第121-123页(1997)；Ranganathan，R.S.，等人，Invest.Radiol.，33第779-797页(1998)；Jacques，V.等人，J.Allovs Cmpd.，249第173-177页(1997)]。然而，这些结构存在一些缺陷。首先，对于含有两个以上螯合物的试剂，每个Gd(III)离子所达到的弛豫性比在单个螯合物(如MS-325)中所观察到的要小。因此，局部螯合物的运动还可进一步减少。第二，这些试剂不是定向的。更重要的是，即使它们是定向的，刚性多体构架也将大大增加不需要的背景信号，因为无论造影剂是否结合于靶标上，都将明显增加信号。因此，需要一种仅在结合于靶标时才增强信号的造影剂。
在非共价靶标信号时，信号IEM的转动运动可以有效地被限制，从而将靶标-结合形态的弛豫率增加5-10倍之多[美国专利No.4,880,008]。这种弛豫率的增加与在共价连接于靶标的IEM中所观察到的一样良好或更好[Schmiedl，U.，Ogan，M.，Paajanen，H.，Martti，M.，Crooke，L.E.，Brito，A.C.和Brash，R.C.Invest.Radio.(1987)22第665-71页]。利用这种作用的试剂的例子是肝蛋白-靶向造影剂Gd-EOB DTPA(Runge V.M.Crit.Rev.Diagn.Imaging 38第207-30页(1997)]和Gd-BOPTA[Kirchin M.A.，等人，Invest.Radiol.，33第798-809页(1998)]或白蛋白-靶向试剂MS-325[Lauffer，R.B.，等人，Radiology，207第529-538页(1998)]和MP2269[Hofman Mark B.M.等人，Acadademic Radiology，5(suppll)S206-S209(1998)]。据报道，作为与血清白蛋白的非共价结合的结果，对于MS325(47mM-1s-1)弛豫率增加了约7倍[Lauffer，R.B.等人，Radiology，207第529-538(1998)]。
图1MRI造影剂MS-325的化学结构与白蛋白结合时，具有图1化学结构的单体造影剂MS-325表现出信号增强的增加。当结合时，复合物以比未结合时慢的速率翻滚。然而奇怪的是，将多个IEM加到靶向造影剂(如MS-325)不能进一步提高对比度，因为在多体结构中单个钆中心的弛豫率降低了。例如，带有4个Gd(III)离子的白蛋白靶向多体与含有一个Gd(III)的MS-325(47mM-1s-1)相比，每Gd(III)的分子弛豫率仅为9-13(mM-1s-1)[Martin V.V.，等人，Bioconjug.Chem.，6第616-23页(1995)]。因此，靶向多体螯合物的每个Gd(III)的弛豫率通常比类似的靶向单个螯合物中所观察到的要小得多。
原理表1表明，仅仅增加IEM的数量不足以改善总弛豫率，因为尽管存在含两个苯环的靶向结合基团，随着IEM数量的增加每个IEM的弛豫率减少了。为了理解表1，重要的是确定寻靶-结合MRI造影剂能达到其可能最大弛豫率的程度。特定造影剂的这种最大弛豫率约等于结合于靶标(如人血清白蛋白(HSA))时的分子弛豫率(R1结合)。RI结合的平均值是在标准条件组(如特定靶标或蛋白质的浓度、药物浓度、温度等)下所有结合分子的平均弛豫率的归一化的量度，它是由各分子的结合群量的加权。因此，由于RI结合是归一化的量，通过比较RI结合值可进行不同分子在结合状态时弛豫率的比较。计算的RI结合值的比较能提供一种方便的方法来比较化合物而不考虑它们对靶标的亲和力。
平均(RI结合)的计算需要测定游离螯合物的弛豫率(R1游离)和弛豫率的观察值(Rlobs)和试剂与通常含有4.5％靶标(如HSA)的靶标溶液的结合百分比。Rlobs是R1游离和R1结合的摩尔分数(x)的加权平均值 其中 和 因此 表1示出一系列白蛋白-定靶造影剂的化学结构和结合弛豫率。在该系列的化合物中，将带单个IEM的化合物(即MS-325)与一系列含有多个IEM的多体比较，但在所有化合物中存在相同的二苯基环己基白蛋白TBM和亚甲基磷酸基团。
表1一系列白蛋白靶向造影剂的化学结构和结合弛豫率。二苯基环己基靶向结合部分(TBM)保持恒定。
图2是表1所示的相同数据的图解。每个IEM的平均RI结合对IEM的数量(在此为Gd(III)螯便物)在20MHz作图。
图2含有单个二苯基环己基蛋白质结合基团的一系列多体造影剂的结合弛豫率性(每个钆)图。 每个造影剂的螯合物数量在表1和图2的分子中，钆螯合物(IEM)、亚甲基磷酸基团和二苯基环己基基团(TBM)的结构保持不变。表1和图2中的数据显示随着螯合的顺磁金属离子数量的增加，每个金属离子的弛豫率就降低。虽然Gd(IIII)螯合物的数量从1(MS-325)到4变化，IEM的数量增加了4倍，但总弛豫率仅增加了50％左右。这种总弛豫率的有限增加是每个Gd(III)离子弛豫率降低的结果。请注意，尽管造影剂是结合的，但每个Gd(III)的平均RI结合从47mM-1s-1下降至14.9mM-1s-1。这种降低是由于螯合物的局部运动，其随着IEM数量的增加也惊人地增加(尽管在单个TBM中有多个芳环)。
显然，螯合部分数量的增加也增加分子的转动自由度，至少在钆螯合物的位点附近。由于大小的增加超过了每个多体分子两个螯合的钆离子，弛豫率的降低特别明显。例如，对M8-03而言，每个钆的总弛豫率仅约为15mM-1s-1，将近是MS-325中所观察到的三分之一。因此化合物M8-03的总弛豫率仅为60mM-1s-1，是MS-325的1.3倍(虽然存在4倍数量的IEM)。显然，弛豫率的这种有限增加与开发体内MR成像试剂的所增加的合成复杂性和成本不一致。因此，简单地将多个成像增强部分与单靶向结合部分的组合不能产生弛豫率相当的增加。所以，存在对合成多体MRI造影剂的需求，其中虽然增加了IEM的数量但却能保持各个螯合物的弛豫率。
总而言之，虽然靶标-结合的造影剂的固定化在增加单个螯合物(如MS-325)的弛豫率上是明显有效的，但对多体螯合物而言是无效的。因此，为了增加各螯合物位点的弛豫率，需要降低分子总转动相关时间从而降低各螯合物位点的局部螯合物运动。还需要一种机制来有效地固定靶标-结合的多体造影剂，从而能在成像时更有效地强化信号。
需要一种方法来改善特定靶标的信号对比度。这个问题已通过一些方法来处理(a)增加IEM的数量或(2)减少分子的柔性。增加IEM的数量已证明是不成功的，因为造影剂的大小和结构不均匀，造成合成困难、难以靶向或不能随着IEM数量的增加而成比例地增加对比度。降低柔性也是不成功的，因为当未结合时刚性造影剂造成很大的背景。通过单TBM将多体与靶标结合不足以显著降低柔性和增加弛豫率。因此，需要通过增加IEM的数量而不同时降低分子的弛豫率(仅当结合于靶时)来改善在特定靶标的对比度。
发明概述本发明提供极大改善体内造影剂效力的机制。如果多体造影剂在未结合状态是柔性的(导致低弛豫率和弱信号)和在结合状态柔软较低(导致高弛豫率和强信号)，则就可能极大改善靶标上对噪声(信号)的对比度。即，重要的是使结合状态的多体造影剂比未结合状态的更刚性化，因为这使未结合状态的背景最小化，而在结合状态保持高弛豫率。这些试剂通过在两个或多个分开位点的非共价相互作用，结合于蛋白质或其它特异性靶标。通过将两个或多个TBM(各对靶标的一个或多个位点有亲和力)掺入到试剂中实现多位点结合。
具体说，本发明涉及用造影剂与多个IEM(“多体”)和靶标的“多位点”、非共价相互作用，来同时发生1)引发与靶标的结合(从而产生特异性)，2)将若干IEM锚定于靶标和3)从而使此多IEM结构刚性化。本发明的关键是造影剂在结合状态比未结合状态的柔性小。造影剂与靶标的结合通过增加金属离子-成像原子载体的总转动相关时间，即通过限制转动运动。增加了金属螯合物IEM的弛豫率和信号强度。多位点结合减少了在总体上和发生螯合物运动的局部位点的结合状态的多螯合物结构的柔性，使弛豫率进一步提高，未结合状态分子的柔性提供了优于上述带有连接螯合物刚性结构的多体MRI试剂(结合和未结合状态的刚度没有差异)的优点。[Ranganathan，R.S.，等人，Invest.Radiol.，33第779-797(1998)]。图3示意地显示了多体螯合物的多位点结合理论。
图3显示通过多位点相互作用结合于靶的多体造影剂例子的关键成分的图 1)多个分开的TBM促进与靶标的结合(从而提供特异性和改善的亲和力)。TBM可以是相同的或不同的。
2)当结合到靶标时，TBM在构架的几个位置上锚定多体结构，从而使多体螯合物结构刚性化。
3)当结合时弛豫率提高到比在溶液中游离时更大的程度，从而改善在特异性靶标上的成像对比度。
除了对成像对比度的改善外，本发明还提供合成优势。由于通过多位点连接于靶标的结合时发生固定化和刚性化，由合成产生的刚性化的化学构架(如稠合环或复杂大环)不是必须的。因此，对化学构架结构的限制较少。其它优点包括a)与单一相互作用相比，多位点结合增加了蛋白质的亲和力并提供更高的靶标特异性[Kramer，R.H.和Karpen，J.W.，Nature，395第710-713(1998)；Clackson，T.等人，Proc，Natl.Acad.Sci.，95第10437-10442(1998)；Rao，J.等人，Science，280第708-711页(1998)；Mann，D.A.，等人，J.Am.Chem.Soc.，120；第10，575-10，582页(1998)；Spevak，W.等人，J.Med.Chem.，39第1018-1020页(1996)；Lee，R.T.等人，Arch.Biochem.Biophys.，299第129-136页(1992)]。
b)多位点结合减低了试剂从靶标分离的速度。增加了试剂保持结合的时间，从而增加诊断利用时间。
c)多位点结合减少了多螯合物结构的柔性，降低了局部螯合物的运动，并由此改善了各金属中心的弛豫率。与游离分子相比，仅在结合时发生结合状态造影剂的刚性产生更强的成像对比度。与结合形式相比，游离分子诱导相对小的信号变化；因此在由结合形式引起的信号与游离分子产生的信号之间可以得到令人惊讶地大的差异。无论是结合还是非结合状态都是刚性的造影剂没有这种特性。
d)这种信号强度的结合依赖性变化也适用于其它成像模态，在此信号强度的变化可能伴随着这种结合，如光学成像。当结合时信号强度可以增加或减少。有时候，显示信号的减少与分子的刚性相关[Rimer，O.，Chauver，M.，Dell’Amico，M.，Noat，G.，和Bourdeaux，M.Eur.J.Biochem.(1995)228第55-59页]。其它时候，结合时信号增加[Sudlow G.，Birket D.J.，和Wade D.N.Mol.Pharmacol.12第1052-61页(1976)；Sudlow G.，Birkett D.J.，和Wade D.N.Mol.Pharmacol.11第824-32页(1975)；Kane C.D.和Bernlohr，D.A.Anal.Biochem.233第197-204页；Lakowica，J.R.“荧光光谱法的原理”Plenum Press，New York，NY第211-213页(1983)]。多位点结合与仅有单个TBM的光学造影剂相比或是大大减少了信号强度(从而大大增加了信号对比度)或是大大增加了强度。在这情况下，作为造影剂结合的结果，靶标位点信号强度的变化将导致改善信号对比度。
本发明的多位点结合造影剂包含IEM、直接或通过任选的连接基连接IEM的构架和至少两个分开的TBM。TBM可以是相同的或不同的。有时候，构架实际上可以包含IEM或IEM的一部分，例如一些螯合部分也可作为构架或构架的一部分。
这些多体/多位点结合化合物是独特的，因为IEM的局部运动受限，并且通过至少两个TBM在多体结构中多个分开位点上与靶标的非共价结合大大提高了结合弛豫率。这些相互作用让多体以“假-环状”或“拉链-状”方式结合于靶标蛋白质。这种类型的结合惊人地减少了整个多体(包括TBM、构架和各IEM)的柔性。因此，对包括螯合物的IEM而言，减少了局部螯合物运动，而且因为各IEM的松率豫增加，由多体可观察到显著增加的MRI信号。这增加了本发明造影剂与已有技术的那些通过单个TBM结合而不是“假-环状”或“拉链状”结合于靶标位点的造影剂的差异。用多体/多位点结合结构进一步提高对比度，因为它们在非结合状态产生相对低的信号。
本发明可广泛应用于所有靶向MRI和光学的应用，包括靶向生物结构(如血清白蛋白)和其它诊断相关靶标(如血凝块)的图像增强剂，尤其是存在用于多体/多位点结合造影剂的多个结合位点的那些应用。这些结合位点不必相同，只要足够临近能让造影剂上的TBM同时结合即可。
发明详述为了更全面的理解本发明，提供以下具体描述。
在本文中没有明显定义的常用化学缩写可以在“美国化学协会文体指南(The American Chemical Society Style Guide)”第二版；American ChemicalSociety，Washington，D.C.(1997)或有机化学杂志中找到；“Guidelines to Authors”(作者指南)(2000年5月修订)，Copyright 2000 American Chemical Society也可在以下网址中查到Http//pubs.acs.org/instruct/joceah.pdf.
本文所引用的出版物全部纳入作为参考。
在本申请中，DTPA指呈任一式(I)-(IV)的结构 本文的术语“特异性亲和力”指造影剂被某一特定生物成分比被其它成分的吸收、保持或结合程度显著更高的能力。将具有这种特性的造影剂被称为对“靶标”成分是“靶向”的。缺少这种特性的造影剂被称为“非特异性”试剂。
本文所用的术语“弛豫率”指每毫摩尔(mM)浓度的顺磁离子的1/T1或1/T2量的增加，其中T1是水质子或其它成像或光谱核(包括在除水以外的分子中所发现的质子)的纵向或自旋-晶格的弛豫时间，T2是它们的横向或自旋-自旋弛豫时间。弛豫率单位为mM-1s-1。
本文所用的术语“开放配位位点”指通常被水或溶剂分子占据的金属螯合物上的位点。
本文所用的术语“形成常数”指描述形成该化合物的反应的平衡常数。
本文所用的术语“多体”指含有两个或多个IEM的造影剂或其亚基。
本文所用的术语“多位点”指连接于造影剂“构架”(如下定义)的共价TBM的两个或多个位点。
本文所用的术语“多位点结合”指两个或多个不同的TBM与靶标的非共价相互作用。这些非共价相互作用彼此无关，且尤其可能是疏水、亲水、偶极-偶极、pi-堆积或路易斯酸-碱的相互作用。
本文所用的术语“假-环状结构”指通过2个TBM在2个不同位点通过非共价相互作用连合于靶标的造影剂。
图4显示多位点结合结构的典型例子 本文所用的术语“拉链状结构”指通过3个或多个TBM在3个或多个不同位点上通过非共价相互作用结合于靶标的造影剂(参见图4)。
本发明涉及新型的随着结合靶标时柔性降低而提供诊断成像对比度的化合物。这些化合物包含a)两个或多个影像增强部分(“IEMs”)；b)两个或多个靶标结合的部分(“TBMs”)，提供用于体内定位和多体刚性化；c)用于上述部分连接的构架(“骨架”)；
d)将IEMs连接于构架的任选的连接基(“连接基”)。
用于本发明的诊断成像技术的用途包括(但不限制于)MRI和紫外线-可见光-红外线成像。
影像增强部分(“IEMs”)在本发明中，IEM可以是用于在成像过程中提供信号或改善对比度的化学制剂或物质。另外，可任选地将IEM或IEM的一部分用作构架或构架的一部分，且可以具有次要的靶向功能。
IEM可包含有机分子、金属离子或螯合物。[Bonnemain，B.J.Drug Target.，6第167-74页(1998)；Swanson，D.P.，等人，“医学造影用药不透放射性的造影剂、放射性药物、磁共振成像和超声波增强剂”，McGraw Hill，Inc.，(1990)；Johnson，I.Histochem.J.30第123-40页(1998)]中叙述了IEM的许多例子。
一种特别有用的IEM是带有一个或多个环状或非环状有机螯合剂(与有一个或多个金属离子络合)的生理相容性的金属螯合物。用于光学成像的优选的金属离子包括那些原子序数为13，21-31、39-42、44-50或57-83的离子。用于MRI的选优的金属离子包括那些原子序数为21-29，42，44或57-83，更优选的是原子序数为21-29、42、44、或57-83的金属离子的顺磁形式。特别优选的顺磁金属离子选自Gd(III)、Fe(III)、Mn(II和III)、Cr(III)、Cu(II)、Dy(III)、Tb(III和IV)、Ho(III)、Er(III)、Pr(III)和Eu(II和III)。最优选的是Gd(III)。
如果IEM是金属螯合物，在成像剂通过人体时(包括结合于靶组织时)，它必须不能有任何明显程度的解离。游离金属离子的显著释放将导致毒性，这通常是不能接受的。
通常，金属螯合物的毒性程度与排泄前体内它的解离程度相关。毒性通常随着游离金属离子量的增加而增加，因此为了防止毒性浓度的游离金属离子，高形成常数的是优选的。具体说，优选的是形成常数至少为1015M-1，或至少为1016M-1，或至少为1017M-1、或至少为1019M-1、或至少为1020M-1，或至少为1022M-1，或至少为1024M-1或更高。如果金属离子解离的动力学很慢，则具有较低的形成常数(即至少为1010M-1)的复合物也是足够的。
毒性也是复合物中开放配位位点数的函数。通常，水配位位点较少就降低了螯合剂释放顺磁金属的趋势。因此，较佳地复合物含有2个、1个或0个开放配位位点。通常2个以上开放位点的存在，通过在体内金属离子的释放将不可接受地增加毒性。
弛豫率R1和R2(分别定义为每mM金属离子1/T1或1/T2的增加)衡量造影剂提高光谱或成像核弛豫速率的能力。弛豫率单位为mM-1s-1。对临床MRI、水质子MRI最常用的形式而言，当结合于螯合配位体的顺磁离子依旧带有一个或多个水交换的开放配位位点时，弛豫率较高(R.B.Lauffer，Chemical Reviews，87第901-927页(1987)]。然而，这必须与金属螯合物的稳定性平衡，后者通常随着开放配位位点数增加而降低，毒性如上述。因此，较佳地除了铁螯合物Fe(II)或Fe(III)以外，复合物仅含有一个或两个开放配位位点。对Gd(III)而言，一个或两个开放配位位点是最佳的。
为了有效地提高MRI影像，复合物必须能够增加光谱核的弛豫速率、或弛豫率、1/T1(纵向或自旋-晶格)和/或1/T2(横向或自旋-自旋)。较佳地，光谱核是水质子，但其它常见的光谱核包括31P、13C、23Na、19F和除水以外的分子中的质子。光谱核可构成IEM、TBM、其它生物分子或注射的生物标记物。
对MRI造影剂而言，一般通过造影剂顺磁离子和受弛豫的核(如水分子中的氢原子)之间的偶极-偶极相互作用来增加弛豫率(1/T1或1/T2)。已知，如果由两个偶极子所确定的矢量(即由顺磁离子和水的氢质子所确定的矢量)的旋转速率降低，则会改善这种偶极相互作用的效率(即驰豫率)(R.B.Lauffer，ChemicalReview，87第901-927页(1987))。
矢量旋转扩散一个弧度的所需的时间称为“旋转相关时间”；旋转相关时间的倒数为“旋转速率”。通常，大分子比小分子在溶液中旋转得较慢。一种增加弛豫率的方法是在小分子造影剂和大分子间形成非共价加合物。通过形成加合物，偶极矢量的旋转相关时间将与大分子的相同。然而小分子可能依旧围绕一个或多个轴旋转(所谓“局部螯合物动动”)。偶极矢量的转动相关时间是此局部螯合物运动和大分子复合物的整体运动的函数。大分子非共价加合物的旋转相关时间将小于或等于该大分子本身的；局部螯合物运动越少，非共价加合物的旋转相关时间越接近该大分子的。
对MRI造影剂而言，通过造影剂金属离子和受弛豫的核(如水的氢原子)间的偶极-偶极相互作用增加弛豫率。除了通过偶极-偶极相互反应增加组织的1/T1或1/T2值以外，MRI剂还影响增加它们用途和临床价值的两个其它磁性特性1)含有高磁化率的金属螯合物(尤其是Dy、Gd、Tb或Ho的螯合物)的IEM通过产生微观的磁化率梯度能改变组织的MRI信号强度(A.Villringer等人，Magn.Reson.Med.，6第164-174页(1988))。在此应用中螯合物无需具有开放配位位点。
2)含有金属(如Tm或Dy)螯合物的IEM可用于改变光谱核的共振频率。较佳地该光谱核是水质子，但其它常见的光谱核包括31P、13C、23Na、19F和在水以外其它分子中发现的质子。光谱核可以构成造影剂、靶标或水。在此按所用的核和策略，可以使用1-3个开放配位位点。
在本发明的各个实施例中可以使用各种螯合的配位体作为IEM部分。这些螯合的配位体包括(但不限制于)二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)的衍生物和其衍生物；1，4，7-三氮杂环壬烷；1，4，7，10-四氮杂环十二烷(环烯)及其衍生物；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，7-二(乙酸，叔-丁-酯)(DO2A-t-丁-酯)；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三(乙酸，叔-丁-酯)(DO3A-t-丁-酯)；1，4，7-三(叔-丁氧基羰基)-1，4，7-四氮杂环十二烷(DO3-t-BOC)；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)及其衍生物；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四(亚甲基膦酸)(DOTP)；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-a，a’，a”，a-四(甲基乙酸)(DOTMA)；乙二胺-四-乙酸(EDTA)；1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-四乙酸(TETA)；亚乙基二-(2-羟基-苯基甘氨酸)(EHPG)及其衍生物，包括5-氯-EHPG、5-Br-EHPG、5-Me-EHGP、5-t-丁-EHPG和5-sec-丁-EHPG；苯并二亚乙基三胺五乙酸(苯并-DTPA)及其衍生物，包括二苯并-DTPA、苯基-DTPA、二苯基-DTPA、苄基-DTPA和二苄基-DTPA；二-(2-羟基苄基)-亚乙基-二胺二乙酸(HBED)及其衍生物；大环类化合物包括至少3个碳原子(较佳地为6个)和至少2个杂原子(O和/或N)，所述的大环化合物可以包括一个环或两个或三个在杂原子环元素处连接的环，如苯并-DOTA、二苯并-DOTA和苯并-NOTA，其中NOTA为1，4-三氮杂环壬烷-N，N’，N”-三乙酸，苯并-TETA、苯并-DOTMA、苯并-TETMA，其中TETMA是1，4，8，11-四氮杂环十四烷-1，4，8，11-(甲基四乙酸)；1，3-丙二胺四乙酸(PDTA)和三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)的衍生物；和1，5，10-N，N’，N”-三(2，3-二羟基苯甲酰基)氨基甲苯(MECAM)的衍生物。
许多适用于MRI剂的合适的鳌合剂是本领域已知的。也可将这些金属螯合物用于其它形式的生物成像(如光成像)。事实上，最近描述了一系列荧光可检测的MRI造影剂(Huber，M.M.等人，Bioconjugate Chem.，9第242-249页(1998)]。对MRI成像而言，优选的IEM包括顺磁的钆螯合物如二乙三胺五乙酸合钆(GdDTPA)、四胺1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N-四乙酸合钆(GdDOTA)和1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三乙酸合钆(GdDO3A)。本领域已知在一些应用中其它金属可以取代Gd(III)。优选应用于本发明的鳌合剂是DTPA。WO98/18496、WO86/06605、WO91/03200、WO95/28179、WO96/23526、WO97/36619、PCT/US98/01473、PCT/US98/20182和美国专利No.4,899,755描述了用本发明生成的典型鳌合剂和螯合基团的例子，本文将这些参考文献全部纳入。
靶标结合部分(“TBM”)在本发明中，造影剂的另一部分是两个或多个靶标结合部分(TBM)。化合物的TBM(1)使造影剂结合于蛋白质或其它靶标上和(2)降低结合状态分子的柔性。这将使待成像位点上造影剂浓度增加，并增加结合状态的弛豫率。对血管血池成像而言，血清白蛋白是优选的靶标。其它蛋白质靶包括(但不限制于)α酸性糖蛋白、纤维蛋白原、血纤蛋白和胶原。对成像血栓而言，血纤蛋白是优选的靶标。因此可以选择TBM来实现对合适蛋白质的特异性和高度结合亲和力。由于血清中存在高浓度的HSA(约0.6mM)，且HSA以相对高的亲和力结合大范围的分子，因此它是血池造影剂的优选靶标血浆蛋白质。HSA是心血管成像特别优选的靶标。
许多亲脂性或两亲的TBM能有效地结合各种靶标，包括人血清白蛋白(HSA)。它们包括(但不限制于)芳族和饱和的或不饱和的具有4-200个碳原子的脂族基团，其中各碳原子任选地被氧、氮、卤素、硫或其它能共价结合碳的原子取代或替代。为了以高度特异性结合其它蛋白质靶标，通常需要特定的寻靶基团。可用现代技术如组合化学、高通量筛选、噬菌体展示、指数式富集法配体进化(SELEX)和其它已描述过的方法如美国专利No.5,475,096、5,595,877和5,270,163[参见Gold等人，Ann.Rev.ofBiochem.，64第763-797页(1995)]中所述的(本文将它们全部纳入作为参考)，可以鉴定具有足够高亲和力和特异性的寻靶基团。
可以用各种平衡结合方法评估TBM与靶标(如HSA或血纤蛋白)结合的程度。例如，可以用超滤测定与HSA的结合。在一典型的用超滤对结合的测定中，将寻靶基团与4.5％重量/体积HSA(在pH7.4缓冲液中)混合。将样品加样于可购得的配备有30KDa分子量的截断值滤器的离心装置(Millipore UltrafreeMC Low Binding Regenerated Cellulose 30KDa mol.wt.截断值目录#UFC3LTK00)中，该滤器可渗透寻靶基团但不能渗透HSA。用此截断滤器以2000×g离心20分钟可以过滤小部分体积(5-10％)样品，测定滤液样品中未结合的寻靶基团的浓度。
为了测定与血纤蛋白的结合，可在微量滴定板的孔中形成血纤蛋白块，并将其与寻靶基团接触。培养足以建立平衡的时间后，吸取上清液(难溶的血纤蛋白在孔的底部保持凝胶块状结合)。然后测定上清液中未结合的寻靶基团的浓度。
在这两种方法中，测定结合的寻靶基团的浓度，作为初始存在的总寻靶基团的浓度与结合试验后未结合的寻靶基团浓度的差。结合分数是将结合的寻靶基团浓度除以总寻靶基团的浓度。较佳地至少10％，更佳地至少50％，优选至少80％，最优选至少90％造影剂在药物和靶标的生理相关浓度结合于所需的靶标。较佳地至少92％，更佳地至少94％，优选96％或更多的造影剂结合于超滤或微量滴定板方法中的靶标上。
关于含有血纤蛋白结合肽的寻靶部分的详细描述参见题为“血纤蛋白的寻靶部分”的美国临时专利申请No.60/146,425；DYX-010.0Prv和同日(1999年7月29日)申请的美国临时专利申请No.60/146,414(本申请享有的优先权)；且本文将它们全部纳入作为参考。
依据靶标的特性和结合的特殊需要TBM可以多种多样。有用的TBM的例子包括药物、亲脂性或两亲有机分子、卟啉、受体配体、类固醇、脂类、激素、肽、寡核苷酸(DNA、RNA及它们化学修饰的形式)、碳水化合物或其它已知能以充分高亲和力结合于待成像的特异性组织中的一种或多种成分的生物分子或物质。在一些实施例中，相对其它TBM某种TBM对靶标的亲和力比较高，此时将这种较高亲和力的TMB称为“主要”TBM。因此，将亲和力比主要TBM低的其它TBM称为“次要”TBM。
特别优选的TBM是那些可逆结合于血浆、间质空隙(细胞间的流体)或细胞内空隙中蛋白质的TBM。虽然可以使用许多生物分子或物质来结合特异性的靶标，但那些结合蛋白质的是最有用的。
次要TBM可以与主要TBM相同或不同。次要TBM的数目可以是一个到十个或更多。所需次要TBM的确切数目取决于TBM对靶标的特异性和TBM对靶标的亲和力。由次要TBM提供的附加结合相互作用应足以束缚复合物并减少各螯合位点的旋转相关时间。由此弛豫率的增加为影像提供了足够的对比度增加。次要TBM与靶标的结合相互作用和亲和力可以比主要寻靶TBM所需的低，因为主要TBM与靶标最初的结合提供了寻靶识别所需的特异性。在一些情况中，靶标可以包括二体结合位点(在此情况下优选两个相同的TBM)。
本申请所述的造影剂的靶标是广泛和多样的。该靶标可以是任何体区室、细胞、器官或组织或其成分。优选的靶标是那些与诊断和治疗相关的靶标，即那些与疾病症状相关的靶标。特别优选的靶标是那些与体液相关的靶，尤其是那些与血液、血浆、淋巴液和中枢神经系统的液体相关的。其它优选的靶标是以高浓度存在的蛋白质或是对特定配体具有大量结合位点的蛋白质。多个结合位点提供了与一种或多种次要TBM的接触。这种靶蛋白质中包括酶和糖蛋白。
连接IEM和TBM的构架本发明为多体造影剂提供的第三个成分称为化学构架或“骨架”结构来结合IEM和TBM，如图5所示。这种构架是在两个或多个TBM之间的化学构架，对此在不同位点直接或通过连接基结合两个或多个IEM，形成多体/多位点结合化合物。这种新型的含有这些构架结构的化合物通过TBM在几个(至少2个)分开的位点上对靶标的非共价结合限制螯合物的局部运动。这种多体造影剂以“假-环状”或“拉链状”形式结合于靶标，在两个或多个位点形成相互作用。这种类型的结合在整个多体造影剂结构中(包括结合基团、构架和各IEM)造成刚性。
通常，构架结构可以是差异很大的有机分子，包括1到10个重复的单体亚单元。构架可以是开链或环状的。TBM共价结合于该结构内部或末端。任任何情况下，都必须有至少两个分开的TBM来将该分子结合于靶。TBM可以是相同的(均质的)或不同的(异质的)。异质的TBM对靶标可以表现出不同的或类似的结合亲和力。
开链和环状构架还为IEM的连接提供了支持结构。IEM的数目可以在2-12间不等。IEM可以与TBM交替，IEM可以结合于线性构架结构的内部或该结构的末端(可任选通过连接基)，但必须至少连接于该结构上的2个不同位点上。IEM可以是相同的(均质的)或不同的(异质的)。异质的IEM可表现出不同的或类似的产生对比度的能力。
就开链构架而言，可以由标准方法合成许多类型的结构。特别优选的是在整个结构中含有规则重复的杂原子的构架。杂原子通常使IEM或TBM更易连接。特别优选的例子是低聚亚烷基胺构架。这些低聚亚烷基胺构架可以是支链的或线状的。即，这种构架可以是含有规则地分隔开的IEM和TBM的线状构架，也可以是分支的化学构架，使得IEM和/或TBM的基团自构架上的单个位点发散开。这种构架可以杂原子如氧(醇)或氮(胺)封端。开链构架特别优选的例子是以醇或胺为末端的支链或线状构架。
图5显示了多体的多位点结合的一个例子，其中清晰地勾画出了构架部分、IEM、TBM和(任选)的连接基。图6显示了另一带有支链连接基的多体的例子。同样清晰地勾画出了构架部分、IEM、TBM和(任选的)连接基。在图6中，两个TBM是结合于聚胺构架的肽，但这些内容并不限制本发明的范围。
图5带有线性连接基的多位点结合多体的例子 图6带有支链连接基的多位点结合多体的例子 式(V)显示了含有重复胺亚结构的线性构架的通式， X＝L-IEM、TBM或IEM其中，m可以是1-10的整数，n可以为2-10的整数。较佳地，m为1-2、2-4、4-6、6-8、或8-10。较佳地，n为2-4、4-6、6-8或8-10。
式(VI)显示了含有重复胺亚结构和末端氧的可以形成醚-键连的TBM的线状构架的结构通式， X＝L-IEM、TBM或IEM其中m可以是1-10，n可以为2-10。较佳地，m为1-2、2-4、4-6、6-8、或8-10。较佳地，n为2-4、4-6、6-8、或8-10。
构架结构并非限制于含有胺的重复亚结构，也不限于含有末端氧或氮的结构。所述的构架可以含有任何可以连接IEM(任选通过连接基)和TBM的重复亚结构。组成该构架的碳原子可以任选地被杂原子(选自氧、氮、硫、磷和卤素)取代或置换。构架还可以含有取代基如短链烃(1-10个碳原子)。这些烃侧链也可任选地被选自氧、氮、硫、磷和卤素的杂原子取代或置换。因此所述的构架可以含有许多常规的有机基团，例如磷酸二酯、氨基甲酸酯、硫酸酯和磺酰基。同样，连接于这种构架结构上的取代基也可以包括常规的有机基团，如磷酸二酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、磺酰基和氨基酸。
图7显示了一些线状和支链聚胺构架的说明性例子及含有这些构架的造影剂的相应实例。图8提供了低聚体构架的例子和含有这些构架的造影剂的相应例子。在本发明中含有杂原子的构架是优选的例子，因为杂原子使IEM和TBM易于连接(任选通过连接基)。
图7线状和支链聚胺构架的例子 X＝N、O、SL＝连接基图8低聚构架的例子 X＝N、O、SL＝连接基 X＝N、O、SL＝连接基这种构架的其它优选了例子是在体内易降解的构架主链。生物可降解造影剂具有能被如哺乳动物体内存在的酶降解的构架。较佳地这种构架含有1个或多个生物可降解基团(可以特异性地被酶降解)。特别优选的生物可降解构架是能被人的酶降解的构架。因为已知存在许多酶促反应，因此生物可降解基团的确切结构多种多样。生物可降解基团特别优选的例子包括(但不限制于)羰基、酯、二酯、磷酸酯、二磷酸酯、磷酸二酯、酸酐、磺酰基、硫酸酯和氨基甲酸酯。这些生物可降解基团可以让多体造影剂迅速代谢并减少中毒的风险。图9显示了多体生物可降解构架的一个例子。在该例子中，该构架是在含有2个末端醇的分子的存在下由两个羧酸缩合形成的。这种缩合反应的特定反应条件是本领域已知的。
图9生物可降解构架的例子 X＝连接部分另外，当pH或温度变化或用超声波或光能时可以切割生物可降解基团。这些基团可参见前体药物文献。(Kratz，F.，Beyer，U.和Schutte M.T.，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.16第245-88页(1999)；Dougherty，T.J.，Gomer，C.J.Henderson，B.W.，Jori，G.Kessel，D.，Korbelik，M.，Moan，J.，和Peng，Q.J.Natl.Cancer Inst.90第889-905页(1998)；Wang，W.，Jiang，J.，Ballard，C.E.，和Wang，B.Curr.Pharm.Des.5第265-87页(1999))。
含有螯合金属离子的环状元件的构架是另一类型本发明的优选实施例。特别优选的是含有IEM的构架，它螯合钆或提供构架内的以及连接于构架的分开IEM中的钆的螯合。图10显示了这种构架。
图10用部分钆复合物作为构架的多体的例子
将构架分成开链类和环状类并不表示这些类型间的相互排斥。已在考虑结合有限制运动的环状元件的开链结构。这种构架的环状部分可以是同素环或杂环或多环。因此，这些环可以是高度受限的如环丙基环或可以是构象受限较少的环如环己基环。
构架的开链和环状部分都可以任选地被选自氧、氮、硫、磷和卤素的杂原子取代或置换。这些构架还可含有取代基如短链烃(1-10个碳原子)。这些烃侧链可以任选地被选自氧、氮、硫、磷和卤素的杂原子取代或置换。所以这些构架在其开链和环状部分可以含有许多常规的有机基团。一些例子包括(但不限制于)羰基、酯、二酯、磷酸酯、磷酸二酯、酸酐、磺酰基、硫酸酯和氨基甲酸酯。
这些环还可包括常规生物环状化合物(如碳水化合物)的衍生物。环状部分的优选例子包括多环系统如萘烷的杂环衍生物。其它例子包括(但不限制于)含有3-7个原子的碳环，其中至多4个原子被选自O、S、C(O)、S(O)、S(O)2和NH的部分任选地取代。这些环任选地被甲基及其衍生物、烷基、链烯基、或炔基(含2-100个碳)取代，其中至多10个碳原子被选自氧、氮、硫、磷和卤素的杂原子取代或被选自O、S、CO、S(O)、S(O)2和NH的部分置换。就如一些构架如以氨基酸为基础的构架可能包括TBM一样，构架同样也可包括IEM。IEM可以是任何有机部分、金属离子或螯合物。优选的例子是那些带有环状IEM的，更优选的是为金属螯合物的环状IEM。图11显示了线性和环状组合构架的优选例子及相应的含有这些构架的造影剂的例子。
图11包括环状部分构架的例子 X＝N、O、S、CH2n＝1-8任选的连接基本发明一些实施例中造影剂的特征是含有将IEM连接于构架的任选连接基。在本文的其它部分描述影像增强部分(IEM)和寻靶部分(TBM)。连接基部分(L)可以是任何小的亚单位，其含有1-30个通过单键或多键共价连接的碳原子，其中至多10个碳原子可以被O、N、P、S、F、Cl、Br、H或I取代。连接基具有将IEM连接于构架的功能。连接基的例子包括线性或分支的被官能团(如羰基、酯、酰胺、胺、脲、硫醚、芳基、磷酸酯、磺胺等)取代的链烷、链烯或炔。某些实施例中优选的连接基含有2个或多个官能团，其中一个连接于构架，其它连接IEM。
官能团可以是相同的或不同的。所述官能团的例子包括(但不限制于)酮、酯、酰胺、醚、碳酸酯、磺胺、链烷、链烯、炔和氨基甲酸酯。制备连接基的优选试剂的例子是氨基酸，尤其是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、氨基苯丙氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸、二氨基丙酸、羟基脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；二醇，尤其是乙二醇；二卤化物，尤其是二氯乙烷、2-巯基乙醇、2-氨基乙醇、1，2-二氨基乙醇；二羧酸，特别是乙二酸、丙二酸、羟基丁二酸、丁二酸、反式丁烯二酸、戊二酸和己二酸；和其它双官能团、三官能团和多官能团的小分子。
其它连接基(并非限制)可以是脲、醛缩醇、缩酮、二酯、羰基、硫脲、砜、硫酯、酯、醚、二硫化物、内酯、亚胺、磷酰基或磷酸二酯键；取代的或未取代的饱和或不饱和烷基链；线性、分支或环状一种或不同氨基酸的氨基酸链(如血纤蛋白结合部分的N-或C-端的延伸)；丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸和庚二酸；己酸、简单二胺和二醇。
优选连接基的分子量是明确限定的。其分子量的范围可以为从100以下到1000以上。较佳地，连接基的分子量小于200，更佳地是小于100。另外，理想的是用可以体内生物降解的连接基从而为本发明的造影剂提供有效的排泄途径。取决于它们在连接基上的位置，这些生物可降解的官能团包括酯、二酯、酰胺、磷酸酯、醚、醛缩醇和缩酮官能团。
通常，可以用已知的方法将金属螯合物或其它IEM偶联于连接基，并将连接基偶联于TBM。参见如WO95/28967、WO98/18496、WO98/18497。本发明考虑在任何位点连接螯合物，只要该金属螯合物保留了其紧密结合金属的能力(以使毒性最小化)。图12显示了一些连接基的例子，为简化省去了氢原子。
图12具有多个连接点连接基的例子 X＝N、O、S与多位点结合相互作用关联的对比增强本发明在其不同实施例中改进了所有顺磁金属(如钆)靶结合的中心、多体螯合结构的平均弛豫率。表1和表2显示的例子表明多体IEM结构仅通过单个TBM对靶的结合是不足以将平均每个Gd(III)的结合弛豫率改善到可比较的单个IEM结构中所观察到的水平。虽然通过单个TBM的结合降低了多体的总转动相关时间，但各金属(如钆)螯合物显然依旧以不受限制的形式转动。这种过量的运动降低了各金属中心的弛豫率。出人意料的是，发现即使多体包括具有两个芳环的TBM也同样如此。McMurry等人的PCT WO 96/23526表明，用含有两个或多个芳环(以非平面取向)的血浆蛋白质结合部分(PPBM)可改善含有单个IEM造影剂的白蛋白结合弛豫率。如表1所示，用这种TBM(二苯基环己基)能为单个IEM(MS-325)的情况提供优良的弛豫率增强，而对其多体类似物的每个IEM，却提供惊人低的白蛋白结合弛豫率。为了进一步改善寻靶多体的弛豫率，必须降低螯合螯合基团和螯合离子的局部运动。
本发明描述了由多位点结合的相互作用及同时柔性的降低而表现出高弛豫率的寻靶多体。将两个或多个TBM引入靶(条件是结合时每个IEM的弛豫率没有明显减少)，发现显著改善了弛豫率，从而在许多情况中结合状态的造影剂的每IEM弛豫率与在单个IEM中所观察到的类似(提高了7-8倍)。弛豫率(每IEM)的提高是由于寻靶多体结构(包括连接的IEM)柔韧性的降低。通常结合时弛豫率增加1.5倍或更多。优选的图像清晰度是弛豫率增加至少2或3倍的结果。更优选的是弛豫率增加4倍、5倍和6倍。特别优选的是，弛豫率增加7-8倍、9-10倍或10倍以上。在20MHz、37℃优选的弛豫率为至少10mM-1s-1(每IEM)，更优选的是至少20mM-1s-1(每IEM)，较佳地是至少25mM-1s-1(每IEM)，更佳地是至少30mM-1s-1(每1EM)，佳地是至少35mM-1s-1(每IEM)，最佳的是至少40mM-1s-1(每IEM)。较佳地，在20MHz和37℃时造影剂总弛豫率大于60mM-1s-1。
以下数据说明由多位点结合引起的对比度增强。在表2所示的3个特异性比较中多重TBM的益处是显然的。在该表格中，本发明的化合物包括至少2个IEM和至少2个TBM。将本发明的化合物与仅含有一个IEM或一个TBM的化合物作比较。此比较表明本发明的化合物的弛豫率(每个IEM)增加。在该表的测定中，所用的靶标是人血清白蛋白(HSA)。首先，M8-04和M8-05分子的比较表明IEM数量的增加而TBM保持恒定使总弛豫率相应增加。具体说，该比较表明可以加入IEM而每个Gd(III)离子的弛豫率不会有相当的丢失，只要存在至少两个TBM且在该分子中间隔适当的距离。
M8-04和M8-05化合物含有2个TBM，各含有苯并稠合的环戊基、苯基和烷基取代的苯基。这两个TBM显然足以限制该分子，从而当IEM(此时为DTPA部分)的数量自2个增加到4个时，各IEM位点上每个Gd(III)的弛豫率保持相同(在20MHz时为32与32.7mM-1s-1)。因此，与IEM数量的翻倍相同，该分子的总弛豫率也翻倍(2个IEM时为64mM-1s-1，4个IEM时为131mM-1s-1)。
表2通过多位点结合弛豫率的增加单TBM对双TBM
其次，M8-06和M8-05分子的比较表明，当保持IEM的数量恒定时TBM数量的增加将增加每个IEM的弛豫率，只要TBM的间距足够。在这两种分子中，TBM具有相同的结构，且IEM的结构是相同的钆-螯合的DTPA部分。但M8-06化合物仅含有一个TBM而M8-05化合物含有2个TBM。M8-05化合物中的这两个TBM更有效地限制分子，因为每个钆的弛豫率在20MHz时自27.0mM-1s-1增加至32.7mM-1s-1。所以，TBM数量的增加增加了每个IEM的弛豫率，只要TBM间距足够。
第三，M8-07和M8-08分子的比较(见表2)再次表明当保持IEM数量恒定时，间距充足的TBM数量的增加时每个IEM的弛豫率增加。在这两种分子中，TBM含有相同的烷基取代的联苯基结构，且这两种化合物含有相同数量的IEM，同时IEM的结构是相同的钆-DTPA部分。M8-07和M8-08分子的核心结构(构架)也是相同的四胺。M8-07化合物含单个TBM和4个IEM，而M8-08化合物含有2个TBM和4个IEM。同样，M8-08化合物中的2个TBM更有效地限制分子，因为存在HSA时每个钆的结合弛豫率在20MHz时自16.0mM-1s-1增加至44.1mM-1s-1。因此，该计算表明TBM数量的翻倍使该分子的总弛豫率的增加到2倍以上(2.75倍，从1个TBM时的64.0mM-1s-1增加至2个TBM时的176.5mM-1s-1)。另一方面，M8-07和M8-08化合物的自由弛豫率相当，在20MHz时分别为9.2mM-1s-1和10.3mM-1s-1。化合物M8-07和M8-08的R1结合与R1游离的比分别为1.7和4.3，这表明M8-08化合物可以提供更好的靶和背景之间对比度的增强。由于M8-08也增加HSA亲和力并因此具有较高的靶特异性(与M8-07相比)，由这种多位点结合多体产生的对比度的增强比有一个TBM的多体更优越。
最后，该表还包括化合物M8-09和M8-10的数据。这些数据是用于提供含有单个TBM和多个IEM的分子的典型弛豫率的。M8-09和M8-10分子的比较也表明，简单地将IEM添加到含有一定TBM的分子不能成比例地增加总弛豫率，因为IEM数量的3倍增加仅得到弛豫率的2倍增加。
因此，在两个分开的位点限制分子将增加分子总体的和造影剂局部螯合区域的弛豫率(即降低转动相关时间)。但是，TBM必须分开足够的距离，这就有效减少了分子结合靶标时整个分子的柔韧性。从而使添加至4个IEM时每个IEM的平均RI结合不会显著减少。多位点结合惊人地限制了过整个多体螯合物结构的柔韧性。因此，对包括螯合物的IEM而言，随着多位点结合后降低了局部螯合物的运动。结果，与类似的多位点螯合化合物(仅通过一个TBM结合，因此对靶向的位点不是“假-环化”或“拉链状”)相比，观察到MRI信号惊人地增加。这些多体/多位点结合结构还进一步增加了对比度的强化，因为在未结合状态它们也产生信号，但该信号比具有刚性分子结构的造影剂所产生的弱，而且它们具有改善的与靶标的亲和力。简而言之，本发明提供了化合物、组合物和它们的使用方法，其中由于多位点结合相互作用(多个TBM)的结果，每个IEM的弛豫率不会因IEM的添加而减少，从而改善了对比度。
用途血池成像具有许多潜在的诊断和治疗益处。循环系统的详细成像可以为早期检测提供信息，如动脉瘤、栓塞或血栓和其它凝块、和血流受限的区域(如动脉硬化的冠状动脉中存在的)。可用高分辨率血池成像更精确诊断的其它常规循环疾病是与以下疾病相关的循环缺陷糖尿病、心脏病、淋巴水肿、周围性血管疾病、雷诺氏现象、静脉炎；和其它对血管内部损伤、心杂音、静脉曲张；和由瓣膜紊乱和脉管炎引起的其它疾病。同样，直接针对特异性靶标的造影剂可以改善对疾病，如由嗜中性白细胞缺陷导致的中性白细胞减少症的诊断。另外，MR、光学成像和其它形式的成像比已有方法(需要手术切割和全身麻醉下插入导管)的侵害性更小。
按本文公开制备的MRI和光学造影剂可以与常规MRI和光学造影剂相同的方式使用。当对血栓成像时，可能优选MR方法和脉冲序列来提高血栓与背景血液和组织的对比度。这些方法包括(但不限制于)辐射血管造影序列(blackblood angiography sequence)，即设法使血液变深如快速自旋回声序列(fast spinecho sequence)和血流-破坏梯度回声序列(flow-spoiled gradient echo sequence)。这些方法还包括不依赖血流的方法，其由于对比增强的血栓和血流及组织间T1的差异来提高对比差异，如反向回收制备的或饱和回收制备的序列将增加血栓和背景组织间的对比度。T2技术的制备方法证明也是有用的。最后，用于磁化传递方法的制剂可以改善与本发明试剂的对比度。
可以按适用于静脉内给予人或动物模型系统的药物组合物常规流程的方法配制此组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是无菌等渗缓冲水溶液配制的溶液。需要时该组合物也可含有增溶剂和局部麻醉剂(如利多卡因)来缓解注射位点的疼痛。通常，将组分分开或以单位剂量形式，例如干的冻干粉末或无水浓缩物混合在一起给予。可将此组合物存储于密封的容器中如安瓿或小袋中，以活性单位指明活性成分的量。当组合物是以输液给予时，可将其分散于含有无菌的药用级别的“注射用水”或盐水的输液瓶中。当以注射给予此组合物时，可提供一安瓿注射用的无菌水或盐水，从而在施用前混合该成分。
本发明的药物组合物包括本发明的化合物及其药学上可接受的盐，和任何药学上可接受的成分、赋形剂、载体、佐剂或运载体。
较佳地，以可注射组合物的形式将此高弛豫率的多体造影剂给予患者。优选给予MRI造影剂的方法是肠胃外的，即静脉内、动脉内、鞘内、间质内或腔内。可按与其它诊断剂或治疗剂相类似的方法，将本发明的药物组合物给予哺乳动物(包括人)。施用的剂量和施用的方式取决于各种因素，包括患者的年龄、体重、性别、患者的症状和遗传因素，最终可由临床医生在试验确定各种剂量后进行本文所述的成像来决定。一般而言，诊断敏感性或治疗有效所需的剂量范围约为0.001到50,000μg/kg(主体体重)，较佳地在0.01到25.0μg/kg(主体体重)范围之间。可按本文所公开的经验地确定最佳剂量。
在以下实施例中将进一步说明本发明实例中一些高弛豫率多体组合物的合成和用途。以下实施例中所包括的具体参数仅是为说明本发明的实施，对本发明的范围无任何限制。虽然以上已描述了许多实例和特征，本领域技术人员可以理解在本发明的精神和权利要求范围内还可以对所述的实施例和特征进行改善和变化。虽然以描述了许多实例和特征，但本领域技术人员可以理解在本发明的精神和权利要求范围内还可以对所述的实施例和特征进行改善和变化。
实施例实施例1测定弛豫率的方法用在0.47特斯拉(20MHz H-1拉莫尔频率)和37℃操作的Bruker NMS-120Minnispec NMR分光光度计评估本发明化合物的弛豫率。用该装置的软件通过逆转恢复脉冲序列(inversion recovery pulse sequence)确定水质子的T1。通过制备4份独立样品在靶标存在下(通常为4.5％HSA)测定弛豫率。第一份在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中仅含有4.5％HSA，其它三份在PBS中除含有4.5％HSA以外，还分别含有20、30和40μM Gd(III)。将样品在37℃培养至少15分钟以确保进行T1测定前温度的平衡。用感应偶合的等离子体-质谱(ICP-MS)确定样品中Gd(III)的含量。通过以s-1表示的豫率速率(1/T1)对Gd(III)浓度(mM)作曲线确定弛豫率(每个Gd(III)离子)。与该数据拟合的线的斜率即为弛豫率。还以类似的方式(但无靶标)测定了无靶标时化合物的弛豫率。
在另外的实验中如用超滤或平衡渗析确定了这些条件下结合于靶标的品种的浓度。由已知的结合于靶标的品种的浓度、存在靶标时的弛豫率、无靶标时的弛豫率可以计算本文所述的平均结合弛豫率。
实施例2测试血纤蛋白结合本发明造影剂的实验模型在这些实施例中所述对血块(血栓)成像具有高弛豫率和特异性的造影剂能够区分血块和循环中的纤维蛋白原。其可以提供对病症发展的各种状态时血栓的形成进行灵敏有效的探测。可以用其来诊断是否存在早期和晚期血栓。
可以使用的一种动物模型是兔颈静脉血栓模型(颈静脉被钳制)。在两处钳制该静脉，除去这两个钳制处之间的兔血。在两处钳制间加入人血纤蛋白原、兔红血细胞和凝血酶，从而产生含有人血纤蛋白的血栓。通常将这种血栓老化(aged)30分钟。
在这种兔颈静脉模型中，常规测定仪器是用破坏梯度(spoiledgradiet)(SPGR)MRI为36/5/30deg的1.5Tesla。另外，3D GRE 44/10/30deg可以用于1.5Tesla仪器进行成像方法。再者，用于1.5Tesla可以进行IR2000/10/700法。
实施例3实例化合物制备本发明的优选实例是具有图13所示结构的用于MRI成像的造影剂。 图13中的造影剂含有4个用作IEM的DTPA-Gd部分。IEM通过包括一系列重复酰胺的连接基连接于乙二胺构架。TBM是两个表现出对血纤蛋白高亲和力的肽。这两个肽可以通过在两个半胱氨酸残基间形成二硫键而环化。TBM通过肟和酰胺键连接于构架。
在37℃、10μM造影剂、2.5mg/ml血纤蛋白、50mM Tris、150mM NaCl、2mM Ca2+、pH7.4时，原型血栓剂与血纤蛋白DD(E)氨基酸片段的结合为51％结合。在20MHz和37℃时结合化合物的弛豫率为101.4mM-1s-1，每个Gd螯合物为25.4mM-1s-1。游离造影剂的弛豫率为67.7mM-1s-1，每个Gd螯合物为16.9mM-1s-1。该造影剂在结合时弛豫率大为提高。图14显示了作为原型MR试剂的血栓肽多体的合成。虽然显示了特定的肽和造影剂，但本领域技术人员可以理解可以用其它肽代替化合物中的，而且化合物中所用的肽不必相同。
图14靶向人血纤蛋白的多体造影剂的合成 实验部分二Dde-四胺的合成将四胺(Fluka)(1.50ml)与Dde-OH(NovaBiochem)(4.0g)在30mlEtOH中反应。回流此清澈的浅黄色溶液16小时。反应完成后，真空浓缩反应混合物得到干燥的残留物。将残留物溶解于250ml乙醚和2N HCl溶液中。分开浅黄色酸性水层，加入50％NaOH直到pH达到12，然后用EtOAc提取。用盐水洗涤EtOAc层，干燥(Na2SO4)并过滤。真空蒸发滤液得到浅黄色块状固体(2.9g)，将其在快速硅胶柱上纯化，用EtOAc/MeOH(2∶3)和EtOAc/(含有1％的MeOH)(2∶3)洗脱得到呈浅黄色固体的所需产物(2.3g)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ1.02(s，6H)，2.34(s，4H，2)，2.56(s，)，2.79(s，2H)，2.92-2.94(t，2H)，3.48-3.54(q，2H)，198.2。
MSm/z475.2(M+H)+二Dde-四胺二-Dpr(Boc)2的合成将Boc-Dpr(Boc)-OH.DCHA(4.85g)悬浮于60ml EtOAc(含有12.0ml 2MH2SO4)中。振荡该烧瓶，分开EtOAc层。用EtOAc提取水层。合并EtOAc层，用盐水洗涤，无水MgSO4干燥并过滤。真空蒸发滤液，将所得的固体干燥后得到3.23g呈白色晶状固体的Boc-Dpr(Boc)-OH游离酸。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ1.35(s，18H，)，3.30(s，2H)，3.96-3.98(m，1H)，6.87-6.90(d，1H)0℃将作为游离酸的Boc-Dpr(Boc)-OH(1.52g)溶解于15ml DCM中。在其中加入HOAt(0.68g)和DIEA(0.35ml)，0℃搅拌此清澈的溶液。然后将上述二Dde-四胺加到此溶液中，然后再加入HATU(1.90g)和2mmolTEA。加入无水DMF(5ml)，搅拌此反应物36小时。真空蒸发溶剂，用150mlEtOAc吸收残留物，用1N HCl、饱和NaHCO3、盐水洗涤，然后无水Na2SO4干燥，过滤并真空蒸发得到白色固体(1.92g)。在快速硅胶柱上层析纯化该固体，用EtOAc(5％MeOH)洗脱得到呈白色固体的产物(1.3g)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ1.01(s，6H)，1.35(s，18H)，2.34(s，4H)，2.58(s，3H)，3.30(s，2H)，3.44-3.67(bm，6H)，3.85-4.10(m，1H)，5.44-5.52(d，2H)，5.74(bs，1H)。
MSm/z 1047.7(M+H)+二-Dde-四胺-diDpr.HCl盐的合成将二Dde-四胺-diDpr(BOC)2溶解于40ml 4N HCl/二噁烷中，搅拌10小时。用冷乙醚研磨此悬浮液，真空蒸发得到大量白色固体。用高真空泵干燥这些固体，得到以HCl盐形式的所需产物(1.09g)。
MSm/z647.3(M+H)+合成二Dde-二Dpr-四-GlyDTPA-OtBu0℃将Gly-DTPA五-叔-丁酯(Gly-DTPA-O-tBu)溶解于10ml DMF中。加入HOAt(0.41g)和DIEA(0.52ml)，在0℃搅拌此溶液。将上述二-Dde-四胺-diDpr盐溶解于3ml DMF中，并加入DIEA(0.13ml)。将HATU(1.14g)和额外的DIEA(0.09ml)加入该混合物中。搅拌此黄色溶液36小时。真空除去溶剂，用EtOAc吸收残留物。用1N HCl、饱和NaHCO3、盐水洗涤有机层，无水Na2SO4干燥，过滤并真空干燥得到浅黄色固体(3.15g)。用制备型RP-HPLC(C-4，ACN/H2O)纯化。混合含有所需化合物的组分，冷冻干燥得到白色固体(0.25g)。
MSm/z 1244.4(M+3H)3+；933.9(M+4H)4+四胺-四-CN-GlyDTPA-O-tBu的合成将二Dde-四胺-二Dpr-四-GlyDTPA-O-tBu(0.38g)溶解于8ml 2％v/v肼的DMF中，室温搅拌10分钟。真空浓缩此反应混合物，并用CH3CN吸收残留物，用预备型RP-HPLC[C-4，CAN/H2O]纯化。混合含有所需化合物的组分，冷冻干燥得到白色固体(0.25g)。
MSm/z 1702.1(M+2H)2+；1135.1(M+3H)3+二-MeO-三苯甲基-AoA-四-Gly-DTPA-O-tBu的合成0℃将四胺-四-Gly-DPTA-O-tBu(98mg)溶解于3mlDMF中。加入TEA(9μl)和甲氧基三苯甲基氨基氧乙酸琥珀酰亚胺酯(MeO-Trt-AoA-Osu)(29mg)，搅拌过夜，加入MeOH，蒸去溶剂，用DCM提取残留物，用10％柠檬酸水溶液、盐水洗涤，无水MgSO4干燥。用制备型RP-HPLC(C-4，ACN/H2O)进一步纯化产物。混合含有所需产物的组分，冷冻干燥得到白色固体(87mg)。
MSm/z 2047.5(M+2H)2+；1365.3(M+3H)3+AoA-四-GlyDTPA-OH的合成将二-MeO三苯甲基-AoA-四-GlyDTPA-O-tBu(85mg)溶解于10mlCH3Cl/苯硫基甲烷/DCM/TIS(64/16/16/4)中，在0℃搅拌3小时。TIS指(iPr)3SiH。用20ml水稀释此反应混合物，用乙醚提取。在制备型RP-HPLC(C-18，ACN/NH4OAc)进一步纯化水层。分离产物，冷冻干燥得到白色固体(29mg)。
MSm/z 1214.4(M+2H)2+；809.5(M+3H)3+
SLPCDYYGTCLD-NH2的氧化将肽c[SLPCDYYGTCLD-NH2](10mM在NaPi缓冲液中，pH＝6.8)与NaIO4(20mM)反应。用乙二醇淬灭氧化。在C-18Sep-Pak柱上纯化反应物。用含有0.1％TFA的80％CH3CN洗脱产物。真空离心除去溶剂，将所需的产物α-N-乙醛酰-c[SLPCDYYGTCLD-NH2]冷冻干燥成白色粉末。
MSm/z 1315.5(M+H)+化学选择性连接-最后装配M8-11的合成22℃，将α-N-乙醛酰-c[SLPCDYYGTCLD-NH2](13.2mg)和AoA-四DPTA-OH(12.3mg)在20mM乙酸钠缓冲液(pH4.6)中反应。用半制备型RP-HPLC(C-18，CH4CH/5mm NH4OAc)纯化反应物。用标准方法将其转化成钆复合物(参见Lauffer R.B.，等人，Radiology 207第529-38页(1998)]。
MSm/z 1674.6(m+3H)3+；1256.3(m+4H)4+实施例4带有三亚乙基四胺构架的造影剂的合成用Di-Dde-四胺-diDpr和上述流程，以及用二氨基-BOC取代的乙烷连接基和Gly-DTPA-OtBu IEM取代，可以将上述各种螯合物结合于三亚乙基四胺构架。螯合物可以是相同的或不同的，产生同质螯合物造影剂或包含异质螯合物的造影剂。
实施例5M8-07的合成 在4-基苯甲酸(0.7g)和三亚乙基四胺(4.26g)的CH2Cl2(200ml)溶液中加入HOBt(0.89g，5.83mmol)和DIC(0.74g)。室温搅拌此混合物过夜。过滤得到的沉淀物，减压下除去溶剂得到黄色油状物。将反应混合物加样到C4柱上进行制备型-HPLC(洗脱液0.1％TFA/H2O/CH3CN)得到呈白色泡沫的TFA盐的单酰胺(0.63g)。
LC-MS(m/e)369.1(M+)室温，在上述单酰胺(0.63g)的乙醚(100ml)和THF(100ml)溶液中缓慢加入LAH(1.30g)。回流此混合物2小时，然后在室温搅拌过夜。在此混合物中逐滴加入水以淬灭LAH。过滤除去得到的沉淀，减压下除去溶剂得到无色油状物。将反应物加样到C4柱上进行制备型-HPLC(洗脱液0.1％TFA/H2O/CH3CN)得到呈白色泡沫的TFA胺盐(180mg)。
LC-MS(m/e)354.4(M+)在TFA胺盐(180mg)和二异丙基乙胺(287mg)的DMF(50ml)溶液中加入Gly-DTPA-OtBu(1.88g)的CH2Cl2(50ml)溶液、HOBt(370mg)和DIC(301mg)。室温搅拌此混合物过夜。减压下除去溶剂得到黄色油状物。将此反应混合物加到C4柱上进行制备型-HPLC(洗脱液0.1％TFA/H2O/CH3CN)得到呈白色固体的粗产物(0.36g)。
LC-MS(m/e)1719.4(M2+)，1147.2(M3+)在上述白色固体(0.19g)的CH2Cl2(4.5ml)和苯甲醚(4.5ml)溶液中逐滴加入4.5ml 12N HCl。室温搅拌此混合物3小时。在此混合物中加入40ml水，用乙醚洗涤3次。冷冻干燥水溶液，得到粗产物，然后将其加样到C18柱上进行制备型-HPLC(洗脱液100mM AcONH4/CH3CN)得到白色固体(50mg)。
LC-MS(m/e)1158.6(M3+)，772.8(M3+)按标准方法将此物转化成钆的复合物(参见Lauffer R.B.，等人，Radiology207第529-38页(1998)]。
实施例6M8-08的合成 4-基苯甲酸。在基硼酸(10g)和4-溴苯甲酸(12.9g)的1-丙醇(150ml)和DME(200ml)溶液中加入三苯基膦(0.128g)、2M碳酸钠溶液(37ml)和水(30ml)。氮气气氛下在此混合物中加入乙酸钯(82mg)。加热回流此混合物过夜。移去热源后，加入100ml水，搅拌2.5小时同时边冷却至室温。用150ml乙酸乙酯稀释颜色变暗的混合物，将两相分开。用饱和碳酸氢钠溶液洗涤有机层若干次，直到TLC显示完全除去4-溴苯甲酸(Rf＝0.55，洗脱液CH2Cl2/CH3OH＝5)。用200ml 1N NaOH溶液提取此溶液3次。在合并的水层中加入约50ml 12N HCl使pH达到3。过滤得到的沉淀物，用水洗涤，干燥得到呈白色固体的4-基苯甲酸(8.81g)。Rf＝0.75(洗脱液CH2Cl2/CH3OH＝5)1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ1.997(s，6H)，2.340(s，3H)，6.961(s，2H)，7.274(d，J＝8.1Hz，2H)，8.177(d，J＝8.1Hz，2H)。
在4-基苯甲酸(1.5g)和三亚乙基四胺(0.43g)的CH2Cl2(60ml)溶液中加入HOBt(0.96g)和DIC(0.79g)。室温搅拌此混合物过夜。过滤得到的沉淀物，干燥得到白色固体(1.45g)。
LC-MS(m/e)591.3(M+)室温，在上述白色固体(0.45g)的乙醚(20ml)和THF(80ml)溶液中缓慢加入LAH(0.33g)。回流此混合物2小时，然后在室温搅拌过夜。在此混合物中逐滴加入水以淬灭LAH。过滤除去得到的沉淀，减压下除去溶剂得到浅黄色油状物。将反应物加样到C4柱上进行制备型-HPLC(洗脱液0.1％TFA/H2O/CH3CN)得到呈白色固体的TFA胺盐(140mg)。
LC-MS(m/e)564.6(M+)在此TFA胺盐(50mg)和二异丙基乙胺(38mg)的DMF(30ml)溶液中加入Gly-DTPA-OtBu(193mg)的CH2Cl2(30ml)溶液、HOBt(37.5mg)和DIC(31mg)。室温搅拌此混合物过夜。减压下除去溶剂得到褐色油状物。将此反应混合物加到C4柱上进行制备型-HPLC(洗脱液0.1％TFA/H2O/CH3CN)得到呈浅黄色固体的粗产物。
LC-MS(m/e)1824.2(M2+)，1216.3(M3+)，912.5(M4+)在此浅黄色固体(0.58g)的CH2Cl2(5ml)和苯甲醚(5ml)溶液中逐滴加入10ml12N HCl。室温搅拌此混合物3小时。在此混合物中加入40ml水，用乙醚洗涤得到的混合物3次。冷冻干燥水溶液，得到粗产物，然后将其加样到C18柱上进行制备型-HPLC(洗脱液100mM AcONH4/CH3CN)得到白色固体(11mg)。
LC-MS(m/e)1263.2(M2+)，842.4(M3+)，632.2(M4+)。
按标准方法将此物转化成钆的复合物(参见Lauffer R.B.，等人，Radiology207第529-38页(1998)]。
实施例7含有两个相同TBM的HSA结合多体的一般合成 将含有4个叔丁酯保护的DTPA的二胺溶解于二甲基甲酰胺(0.75ml)中。加入RCO3H(3eq)(其表示各种含有TBM的羧酸)、DIC(0.052ml，3.3eq)和HOBt(0.051g，3.3eq)。在逐滴加入DIEA(0.105ml，6eq)之前将反应混合物冷却至0℃。室温搅拌此反应混合物共8.5小时。用CH2Cl2稀释此反应混合物，用0.1NHCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤。Na2SO4干燥有机层，真空除去残留的溶剂，得到叔丁酯保护的中间体。用DCM吸收产物，在0℃加入HCl，搅拌3小时。蒸发溶剂得到白色固体，将此固体与GdCl3(4eq)和NaOH(12eq)反应得到终产物。
表3列出了按此方法合成的含有2个相同TBM的化合物及TBM的结构和质谱数据。
表3含有2个相同的TBM的多体造影剂 实施例8含有两个不同TBM的HSA结合的多体的一般合成 将含有4个叔丁酯保护的DTPA的CBz保护的单胺溶解于二甲基甲酰胺(0.75ml)中。加入R1CO2H(1.5eq)(其表示各种含有TBMl的羧酸)、DIC(0.052ml，1.5eq)和HOBt(0.051g，1.5eq)。在逐滴加入DIEA(0.105ml，6eq)之前将反应混合物冷却至0℃。室温搅拌此反应混合物共8.5小时。
用CH2Cl2稀释此反应混合物，用0.1N HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤。Na2SO4干燥有机层，真空除去残留的溶剂。
将此化合物溶解于EtOAc中并氢化(5％Pd-C)。滤去催化剂后，将产物与另一羧酸(R2CO2H，1.5eq)(代表各种含有TBM2的羧酸)、DIC(0.052ml，1.5eq)和HOBt(0.051g，1.5eq)反应。室温搅拌此反应混合物共8.5小时。用CH2Cl2稀释此反应混合物，用0.1N HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤。Na2SO4干燥有机层，真空除去残留的溶剂。将产物悬浮于DCM中，0℃加入HCl，搅拌此反应物3小时。蒸发掉溶剂后得到白色固体，将此固体与GdCl3(4eq)和NaOH(12eq)反应得到终产物。
表4列出了按此方法合成的化合物及TBM1和TBM2的结构。需注意在一般合成流程中的“R1”代表TBM1，一般合成流程中的“R2”代表TBM2。
表4含有2个不同TBM的多体造影剂
实施例9M8-01的合成 将1，2-二(Boc-氨基)-3-羟基丙烷(1.0eq)和二苯基环己基亚磷酰胺酸酯(1.1eq)溶解于四氢呋喃(1.5ml/mmol亚磷酰胺酸酯)中，与分子筛搅拌30分钟。室温在此混合物中加入四唑(1.2eq)。搅拌此混合物45分钟，31P NMR显示反应完成。在此混合物中加入叔-丁基氢过氧化物(1.2eq)。搅拌此反应混合物约1小时，至31P NMR显示反应完全。过滤除去得到的沉淀和分子筛，然后在滤液中加入二氯甲烷。顺序用硫代硫酸钠溶液、碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤此溶液，硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。在得到的浅黄色油状物中加入2M氨的甲醇溶液。搅拌此混合物过夜，然后真空除去溶剂。用硅胶柱层析(乙酸乙酯/甲醇洗脱)得到磷酸二酯。
在三氟乙酸和二氯甲烷中搅拌使此磷酸二酯去保护，然后将此混合物冷冻干燥得到二胺-二苯基环己基-磷酸二酯。用4当量的Gly-DTPA-O-tBu、EDC和HOBt的二氯甲烷(已加入二异丙基乙胺以增加pH)搅拌此二胺过夜。用制备型反相HPLC纯化此浓缩的反应混合物。在盐酸∶苯甲醚∶二氯甲烷(4∶1∶1)中搅拌来切割2个DTPA单位的叔丁酯，随后按常规方法用GdCl3形成DTPA-钆螯合物(参见Lauffer R.B.，等人，Radiology 207第529-38页(1998)]。
实施例10M8-02的合成
将由N-Boc-O-苄基-丝氨酸制备的苄氧基亚甲基-N-Boc-氮丙啶(2.82g)和N，N”-二Boc-二亚乙基三胺(3.9g)在回流的叔丁醇中搅拌2天，然后真空除去溶剂，用快速层析纯化残留物(甲醇和二氯甲烷为洗脱液)得到4.54g物质。通过1H NMR光谱的积分证明Boc氢与芳族氢的比例。将这种三Boc-保护的四胺苄醚(3.8g)溶解于70ml 7％乙酸的乙酸乙酯(含有1.0g 10％碳钯)中。将此反应混合物置于48psi的氢气中16小时。真空下除去反应混合物的溶剂，快速层析纯化(甲醇和二氯甲烷为洗脱液)残留物，得到3.6g。用上述条件(四唑、叔-丁基氢过氧化物、氨的甲醇溶液)将所得的醇和二苯基环己基亚磷酰胺酸酯反应，得到相应的磷酸二酯。
在1.0ml TFA和1.0ml DCM中搅拌3小时除去此磷酸二酯的三个Boc基团，然后冷冻干燥此混合物得到54ml三胺。将三胺溶解于1.0ml二氯甲烷中，并逐滴加入含有各6当量Gly-DTPA-O-tBu、EDC和HOBt的2.0ml二氯甲烷溶液(其中加入DIEA将pH调节至9.0)。用制备级HPLC(C-4柱，20ml/分钟，30∶70乙腈∶水到100∶0梯度25分钟，然后维持10分钟)纯化此浓反应物。用质谱验证该化合物的分子量。在盐酸∶苯甲醚∶二氯甲烷(4∶1∶1)中搅拌5小时来切割DTPA亚基的叔丁酯以产生羧酸，然后真空除去溶剂，溶解于水中并冷冻干燥。用常规方法[参见Lauffer R.B.，等人Radiology 207第529-38页(1998)]用GdCl3形成DTPA-钆螯合物。
实施例11M8-03的合成 将溴乙酸苄基酯(11ml)的50ml乙腈溶液加入N，N”-二Boc-二亚乙基三胺(14g)的50ml乙腈和19ml三乙胺的溶液中，并搅拌2小时，然后真空除去溶剂，快速层析(己烷/乙酸乙酯为洗脱液)纯化残留物得到11g物质。通过在1∶1的三氟乙酸和二氯甲烷的混合物中搅拌3小时，除去该物质中混合物的2个Boc保护基团，然后真空除去溶剂，在水和乙醚间分配，冷冻干燥得到9.2g物质。在N，N-二甲基甲酰胺中搅拌Gly-DTPA-O-tBu、DIC和HOBt(各2.2当量)45分钟，然后将此三胺(1.0g)作为二(三氟乙酸铵)溶解于N，N-二甲基甲酰胺中，并将它们加到反应容器中，加入二异丙基乙胺将pH调节至9.0。
搅拌12小时后，用水稀释此溶液，用乙酸乙酯提取，然后顺序用柠檬酸水溶液、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠洗涤。真空浓缩乙酸乙酯，快速层析(己烷/乙酸乙酯)得到845mg由质谱证明为四聚物的物质。在氢气气氛中，氢化800mg溶解于10ml己烷、9ml甲醇和1ml三乙胺(含有20％钯碳)的此物质，来除去苄基基团，然后经硅藻土过滤并真空浓缩。在含有EDC和HOBt(各1.2当量)的二氯甲烷中搅拌此羧酸(750mg)30分钟，将上述合成M8-01中所述的二胺-二苯基环己基-磷酸二酯(80mg)溶解于二氯甲烷中，并加到此羧酸溶液中，加入二异丙基乙胺将pH调节至9.0。几小时后，浓缩此混合物，用制备级HPCL(C-4柱，20ml/分钟，30∶70乙腈∶水到100∶0梯度25分钟，然后维持10分钟)纯化得到150mg物质，用质谱验证它的分子量。在盐酸∶苯甲醚∶二氯甲烷(4∶1∶1)中搅拌5小时，切割DTPA亚单位的叔丁酯，以产生羧酸，然后真空除去溶剂，溶解于水中并冷冻干燥(得到90mg)。按常规方法用GdCl3形成DTPA-钆螯合物(参见Lauffer R.B.，等人，Radiology 207第529-38页(1998)]。
实施例12M8-09的合成 在(1R-2S)-(+)-顺式-1-氨基-2-茚满醇(15g)的二氯甲烷(90ml)悬浮液中加入二异丙基乙胺(35ml)，然后再加入苄基溴(17.2g)。搅拌此混合物过夜。用水洗涤此溶液，并用0.1N HCl溶液提取2次，将合并水层的pH升至8，用CH2Cl2提取此水层4次。用饱和氯化钠洗涤合并的有机层，硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到1-苄基氨基-2-茚满醇(15.62g)，用质谱验证其分子量(M+的m/e＝239.95)。在1-苄基氨基-2-茚满醇(10.5)和三乙胺(9.2ml)的二氯甲烷(250ml)溶液中逐滴加入4-丁基苯甲酰氯(9.1ml)。搅拌此混合物4小时，然后在真空下浓缩。
将残留物溶解于乙酸乙酯中，并用水洗涤，硫酸钠干燥，过滤，减压下浓缩并用快速层析(己烷/乙酸乙酯为洗脱液)得到1-对-丁基苯甲酰基-1-苄基氨基-2-茚满醇(12.7g)1H NMR(CDCl3)δ0.93(t，3H)，1.24-1.4(m，2H)，1.5-1.65(m，2H)，2.6(t，2H)，2.8(宽d，1H)，3.07(dd，1H)，4.52(m，1H)，4.65(m，2H)，5.13(m，1H)，7.09-7.32(m，11H)，7.38-7.62(m，2H)。将1-对-丁基苯甲酰基-1-苄基氨基-2-茚满醇(1.26g)和DTPA亚磷酰胺酸酯(2.99g)溶解于四氢呋喃(5ml)中，与分子筛搅拌30分钟，然后在其中加入四唑(265mg)，搅拌此混合物45分钟。
31P NMR表明反应完成，在此混合物中加入叔-丁基氢过氧化物(0.433ml)，然后搅拌此反应混合物1小时直到31P NMR显示反应完成。过滤除去形成的沉淀和分子筛，然后在滤液中加入二氯甲烷。顺序用硫代硫酸钠溶液、碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤此溶液，硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。在得到的浅黄色油状物中加入2M氨的甲醇溶液。搅拌此混合物过夜，然后减压下除去溶剂。快速层析(乙酸乙酯/甲醇为洗脱液)纯化此反应混合物，得到呈白色固体的磷酸二酯31P NMR(THF-d8)δ-0.28；LC-MS(m/e)1165.75(M+)。
通过溶解于二氯甲烷和用12N盐酸处理，除去DTPA亚单元上的叔丁酯以产生羧酸。几小时后，加入5N氢氧化钠水溶液将pH调节至1.5，滤去形成的白色沉淀，用盐酸(pH＝1.5)洗涤2次。冷冻干燥沉淀物48小时，得到呈白色细粉末的产物LC-MS(m/e)885.15(M+)。按常规方法用GdCl3形成DTPA-钆螯合物(参见Lauffer R.B.，等人，Radiology 207第529-38页(1998)]。
实施例13M8-10的合成 在含有3，4-二氢吡喃(12g)和对甲苯磺酸(tosic acid)(20mg)的乙醚(250ml)中搅拌3-丁炔-1-醇(10g)12小时，然后真空浓缩此溶液，残留物在乙酸乙酯和水之间分配。用饱和氯化钠水溶液洗涤此有机溶液，硫酸钠干燥，并浓缩得到DHP-保护的醇(18.7g)，其无需进一步鉴定或纯化。将DHP-醇(18.7g)溶解于乙醚(65ml)中并冷却至-75℃，然后在此温度逐滴加入丁基锂(50.5ml的2.0M溶液)，然后加入多聚甲醛(3.5g)。4小时后，让此溶液升温至室温，加入水(100ml)。弃去水层，真空浓缩有机层得到油状物，快速层析(乙酸乙酯/己烷为洗脱液)纯化得到5-THP-2-戊炔-1，5-醇(13g)，由1H NMR证明其结构。
首先用常规方法将炔醇(2.0g)转化成甲磺酸酯(882mg甲磺酰氯，1.6ml三乙胺，二氯甲烷)，然后再转化成碘化物(6.2g碘化钠，无水丙酮)。在三Boc-1，4，7，10-四氮杂环十二烷(200mg)和碳酸氢钠(200mg)的8ml乙腈溶液中搅拌此碘代炔(1.2g)1.5小时，然后真空浓缩除去溶剂，并快速层析(乙酸乙酯/己烷为洗脱液)纯化，并由1H NMR和LC-MS证明此加合物(240mg)。40℃在4∶2∶1的乙酸∶四氢呋喃∶水(12ml)中搅拌将此加合物(240mg)6小时来除去THP保护，然后用水和乙酸乙酯稀释此反应物，顺序用饱和碳酸氢钠水溶液和氯化钠提取有机层，硫酸钠干燥并浓缩得到醇(250mg)。用上述M8-01合成中所述的标准亚磷酰胺酸酯化学(四唑、叔丁基氢过氧化物、氨/甲醇)合成此醇与1-对-丁基苯甲酰基-1-苄基氨基-2-茚满醇的磷酸二酯。
如上所述通过用酸(三氟乙酸的二氯甲烷溶液)处理除去1，4，7，10-四氮杂环十二烷上的三个Boc保护基团，然后用标准方法将得到的三种胺用Gly-DTPA-O-tBu转化成酰胺(HATU/HOAt，二异丙基乙胺，二氯甲烷)。在4∶1∶1的盐酸∶苯甲醚∶二氯甲烷中搅拌5小时除去DTPA亚单元的叔丁酯以产生羧酸，然后真空除去溶剂，溶解于水中并冷冻干燥。按常规方法用GdCl3形成DTPA-钆螯合物(参见Lauffer R.B.，等人，Radiology 207第529-38页(1998)]。
实施例14M8-06的合成 顺序将乙二胺与N-Boc-甘氨酸甲酯和N-Boc-丝氨酸甲酯反应形成二酰胺。用上述方法(四唑、叔丁基氢过氧化物、氨/甲醇)将游离的醇和1-对-丁基苯甲酰基-1-苄基氨基-2-茚满醇转化成磷酸二酯。用上述条件(DIC/HOBt，二异丙基乙胺、二氯甲烷)将苄基-(3-氨基-2-氨基甲基-2-甲基)丙酸酯和2当量的Gly-DTPA-O-tBu反应形成相应的二酰胺。2当量此二酰胺与乙二胺衍生物反应以形成四聚体。在4∶1∶1的盐酸∶苯甲醚∶二氯甲烷中搅拌5小时除去DTPA亚单元的叔丁酯以产生羧酸，然后真空除去溶剂，溶解于水中并冷冻干燥。按常规方法用GdCl3形成DTPA-钆螯合物(参见Lauffer R.B.，等人，Radiology 207第529-38页(1998)]。
实施例15M8-04的合成 将乙二胺与2当量N-Boc-丝氨酸甲酯反应形成二酰胺。将此二酰胺进一步反应形成如上所示的二磷酸酯衍生物。按所示的合成流程并用实施例14所述的方法，连接TBM并去保护。
实施例16M8-05的合成 在本合成中用作起始物的二酰胺的二磷酸衍生物与实施例15中所示的合成M8-04中的中间体相同。按所示的合成流程并用实施例14所述的方法，结合TBM并去保护。
实施例16-由兔颈静脉模型测定的M8-11的结合图15是用实施例1所述的试验在一个实验中得到的成像的彩色照片。该实验显示了注射前、用对照非靶向的Gd-DTPA化合物注射、用实施例3给出的M8-11注射、用三倍剂量的M8-11注射和用过量序列为LPCDYYGTCLD的肽(以单字母氨基酸形式)注射(其与造影剂的TBM竞争靶标)的成像。因为无TBM的造影剂不结合并因为存在过量肽时结合逆转，由M8-11特异性成像凝块。
实施例16-近红外光学成像剂M8-24 近红外荧光成像剂M8-24含有适用于光学成像的IEM(“R”)。由相应荧光染料的羧酸衍生物(如WO 2000/16810中所公开的)制备该试剂。按实施例13中所示的条件将羧酸衍生物结合于二酰胺的二磷酸衍生物。在实施例13中，类似步骤是Gly-DTPA TBM结合于二酰胺的二磷酸酯衍生物形成M8-04。这种白蛋白靶向的红外线造影剂可用于如眼科血管造影和皮肤癌的诊断中。上述光学造影剂可用于MRI血池造影剂的任何用途中。另外，技术人员将理解通过构建染料的不同羧酸衍生物，这种光学造影剂的IEM可以多种多样。因此这种试剂是适应特定实验标准如特定的激发波长所特制的。
权利要求
1.一种用磁共振成像MRI或光学成像提高对比度的方法，其特征在于，所述的方法包括(a)多位点造影剂结合于靶标，(b)在造影剂结合于靶标后提高靶标上的对比度，(c)用IEM的数量、分子的刚性或这两者改善对比度的提高。
2.一种增加造影剂弛豫率的方法，其特征在于，所述的方法包括(a)多位点造影剂结合于靶，(b)结合于靶标时造影剂的弛豫率增加，(c)结合后造影剂的每IEM的弛豫率没有减少，且其中造影剂包括a)两个或多个影像增强部分(“IEMs”)；b)两个或多个靶标结合部分(“TBMs”)；c)连接TBM和IEM的构架；和d)将IEMs连接于构架的任选的连接基。
3.如权利要求2所述的增加弛豫率的方法，其特征在于，所述的弛豫率至少为每个IEM 10mM-1s-1。
4.如权利要求2所述的增加弛豫率的方法，其特征在于，所述的弛豫率至少为每个IEM 15mM-1s-1。
5.如权利要求2所述的增加弛豫率的方法，其特征在于，所述的弛豫率至少为每个IEM 20mM-1s-1。
6.如权利要求2所述的增加弛豫率的方法，其特征在于，所述的弛豫率至少为每个IEM 25mM-1s-1。
7.如权利要求2所述的增加弛豫率的方法，其特征在于，所述的弛豫率至少为每个IEM 30mM-1s-1。
8.一种在动物或人对象中对靶标进行MR成像的方法，包括如下步骤给予MRI造影剂；使造影剂结合于靶标；将身体靶标所在处的对象部位进行成像；其特征在于，所述的MRI造影剂包括构架；至少两个IEM，各TBM含有顺磁金属离子的螯合物，且直接或通过一个或多个中间的连接基共价结合于构架；和至少两个TBM，各TBM具有与靶标的亲和力，而且共价结合于构架上与IEM结合的原子不同的原子上；其中结合后造影剂的弛豫率增加；且所述靶标是蛋白质、多糖、细胞、液体、糖蛋白或血栓。
9.一种MRI造影剂，其特征在于，包含构架、2-4个共价结合于所述构架的TBM、2-4个IEM的寻靶所述的IEM共价结合于所述的构架或共价结合于一个或多个连接基，其中如果存在所述的连接基，则所述的连接基共价结合于所述的构架，且其中各IEM含有顺磁金属离子的螯合物，各TBM共价结合于构架的不共价结合IEM的原子，各TBM具有对靶标的亲和力，和当与所述的靶标结合时造影剂的弛豫率至少比未结合状态时的弛豫率高2倍。
10.一种用于增加造影剂对其靶标亲和力的方法，包括使造影剂多位点结合于靶标，其特征在于，所述的造影剂包含a)两个或多个影像增强的部分(“IEMs”)；b)两个或多个靶标结合部分(“TBMs”)；c)连接TBM和IEM的构架；和d)将IEMs连接于构架的任选的连接基。
11.一种具有如下结构(IX)的多位点造影剂 X＝L-IEM、TBM或IEM其中m是1-10以内的整数；n是2-10以内的整数；o是0-1；p是0-1；各A分别选自基团O、CH2、C＝O、C＝NH、NH、NR或CHR；和B选自基团CH和N；和R是C1-C10直链或支链烷基、C2-C10直链或支链链烯基或炔基，且其中至多4个碳原子任选地被卤素、O、N或S取代。
12.一种具有如下结构(V)的多位点造影剂 X＝L-IEM、TBM或IEM其特征在于，所述的各m是1-8以内的整数；各A分别选自基团O、CH2、C＝O、C＝NH、NH、NR或CHR；和R是C1-C10直链或支链烷基、C2-C10直链或支链链烯基或炔基，且其中至多4个碳原子任选地被卤素、O、N或S取代；和n是2-10以内的整数。
13.如权利要求12所述的造影剂，其特征在于，所述的A是C＝O。
14.如权利要求12所述的造影剂，其特征在于，所述的A是O。
15.一种具有如下结构(VI)的多位点造影剂 X＝L-IEM、TBM或IEM其特征在于，所述的各m是1-10的整数(包含1和10)；n是2-10以内的整数；o是0-1；p是0-1；各A分别选自基团O、CH2、C＝O、C＝NH、NH、NR或CHR；和B选自CH和N；R是C1-C10直链或支链烷基、C2-C10直链或支链链烯基或炔基，且其中至多4个碳原子任选地被卤素、O、N或S取代。
16.一种具有如下结构(VII)的多位点造影剂
17.如权利要求11-16任一所述的多位点造影剂，其特征在于，所述的TBM包括取代的芳基。
18.如权利要求17所述的多位点造影剂，其特征在于，所述的IEM选自以下基团二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和其衍生物；1，4，7-三氮杂环壬烷；1，4，7，10-四氮杂环十二烷(cyclen)及其衍生物；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，7-二(乙酸叔-丁-酯)(DO2A-t-丁-酯)；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7-三(乙酸，叔-丁-酯)(DO3A-t-丁-酯)；1，4，7-三(叔-丁氧基羰基)-1，4，7-四氮杂环十二烷(DO3-t-BOC)；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)及其衍生物；1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四(亚甲基膦酸)(DOTP)。
19.如权利要求18所述的造影剂，其特征在于，所述的IEM是二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)。
20.如权利要求11-16任一所述的造影剂，其特征在于，所述的TBM是肽。
21.如权利要求20所述的造影剂，其特征在于，所述的TBM是血纤蛋白结合肽。
22.一种下式的造影剂(TBM)q-S-[Lm-IEMn]p其特征在于TBM是靶标结合部分，S是构架，L是连接基，IEM是影像增强的部分，和q、m、n和p分别都是整数，其中q是2-6以内的整数，各m为0或1，各n分别是2-4以内的整数，p是2-4以内的整数，而且其中各TBM通过两个原子间的化学键共价连接于S，如果存在，各L通过两个原子间的化学键共价连接于IEM，如果存在，各L通过两个原子间的化学键共价连接于S，至少两个TBM连接于构架上不同的原子上。
23.一种用于光学或MR成像的造影剂，其特征在于，含有a)两个或多个影像增强的部分(“IEMs”)；b)两个或多个靶标结合部分(“TBMs”)；c)连接TBM和IEM的构架；和d)各IEMs连接于构架的任选的连接基。其特征在于，其中所述的构架包括式(VIII) 且m和n各是整数，其中m是0-3以内的整数，n是0-2以内的整数，各A是分别选自如下基团NH、NR、O、S、CH2、C＝O、C＝NH、C＝NR和CHR，其中R是C1-C10直链或支链烷基、C2-C10直链或支链链烯基或炔基，且其中至多4个碳原子任选地被卤素、O、N、或S取代。
24.化合物M8-24
25.化合物M8-11
26.化合物M8-08
全文摘要
本发明涉及用于诊断成像的造影剂。具体说,本发明涉及新型的多体化合物,其表现出在结合内源蛋白质或其它生理相关位点时改善的弛豫率。这种化合物包括:a)两个或多个包括多体亚单位的影像增强部分(“IEMs”)(或信号产生部分);b)两个或多个靶标结合部分(“TBMs”),提供体内定位和多体刚性化;c)用于上述部分连接的构架(“骨架”);和d)将IEMs连接于构架的任选的连接基。本发明还涉及含有这些化合物的药物组合物,和用这些化合物和组合物提高诊断成像对比度的方法。
文档编号A61K49/00GK1382062SQ00813045
公开日2002年11月27日 申请日期2000年7月28日 优先权日1999年7月29日
发明者R·B·劳弗, T·J·麦克默瑞, S·迪马, A·科沃杰伊, J·阿梅迪奥, P·卡拉文, 张昭达, S·奈尔 申请人:埃匹克斯医学股份有限公司