专利名称：超级活性的猪生长激素释放激素类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生长缺陷的治疗；生长表现的改善；刺激动物生长激素的产生，使其高于与正常生长相关的水平；以及利用生长激素释放激素类似物的给药来增强生长。此外，本发明还涉及编码所述生长激素释放激素类似物的核苷酸序列在肌肉组织中的应用，特别是使用基因治疗技术进行的应用，该核苷酸序列受调节于肌肉特异性启动子。
背景技术：
生长激素(GH)途径由一系列相互依赖的基因组成，这些基因的产物为正常生长所需。这些GH途径基因包括(1)配基，如GH以及胰岛素样生长因子-I(IGF-I)；(2)转录因子，如prophet of pit1，或prop 1和pit 1；(3)激动剂和拮抗剂，其例子分别如生长激素释放激素(GHRH)和促生长素抑制素；以及(4)受体，如GHRH受体(GHRH-R)以及GH受体(GH-R)。这些基因是在不同的器官和组织中表达的，包括下丘脑、脑垂体、肝脏以及骨胳。GH途径的有效和可调表达对于最佳的线性生长以及碳水化合物、蛋白质和脂肪代谢的动态平衡至关重要。GH的合成以及从前脑垂体中的分泌为GHRH所刺激并且被促生长素抑制素所抑制，这两者均为下丘脑激素。GH在控制人类和其他脊椎动物躯体生长中的重要作用以及调节GH从脑垂体中分泌的生理相关途径为人所熟知。GH首先提高肝脏，及其它靶器官中IGF-I的产生。IGF-I和GH依次反馈作用于下丘脑以及脑垂体以抑制GHRH和GH的释放。GH对于周围组织具有直接和间接作用，其间接作用主要由IGF-I介导。
在儿童和成人中存在着广泛的临床症状，在该症状中线性生长(青春期前患者)或者躯体组成受到损害，并且该症状可因GH或者GHRH治疗而好转。在所有情况下GHRH-GH-IGF-I轴均是功能性的，但出于各种可能的原因，不在最佳敏感度或者反应性下发挥作用。
儿童GH缺陷的主要特征为体形矮小。GH轴不同点的遗传缺陷可产生类似的表型(Parks et al.，1995)以及非GH-缺陷的矮小体形。非GH-缺陷具有不同的病因(1)遗传疾病，特纳综合征(Jacobs etal.，1990；Skuse et al.，1999)，hypochondroplasis(Tanaka etal.，1998；Key and Gross，1996)以及克罗恩氏病(Savage et al.，1999)；以及(2)子宫内生长迟缓(Albanese and Stanhope，1997；Azcona et al.，1998)；以及(3)慢性肾功能不全(Sohmiya et al.，1998；Benfield and Kohaut，1997)。GH轴未受损的病例(即，患者具有正常的激素、基因和受体)占生长迟缓总病例数超过50％。在这些病例中，GHRH或者GH治疗是有效的(Gesundheit and Alexander，1995)。
GH从脑垂体中分泌的减少导致骨骼肌重量在从25岁至衰老的老化过程中丧失。GHRH-GH-IGF-I轴在老化期间及老年中经受着巨大的变化(D’Costa et al.，1993)，这些变化有GH产生速度以及GH半衰期的降低，IGF-I对GH和GHRH刺激物反应的降低，导致骨骼肌重量的失去(sarcopenia)，骨质疏松症以及脂肪的增加和瘦肉的减少(Bartke，1998)。先前的研究已经表明在相当大量的正常老人中，血清中的GH以及IGF水平比其十几岁时的水平降低了70-80％(Corpaset al.，1993；Iranmanesh et al.，1991)。已经证明sarcopenia的发展可通过GH治疗而消除。然而，在老年人中，该治疗由于其费用以及经常的副作用而仍然是一种有争议的疗法。
重组蛋白的产生是治疗这些疾病的一种有效工具。尽管GH替换疗法被广泛用于具有生长缺陷的患者中并且产生了令人满意的生长，对被治疗的儿童也具有积极的作用(Rosenbaum和Saigal，1996；Erling，1999)，但该疗法具有一些不足，这包括不实际地要求GH的经常给药(Monti et al.，1997；Heptulla et al.，1997)以及不理想的次级效果(Blethen et al.，1996；Watkins，1996；Shalet et al.，1997；Allen et al.，1997)。
已经确认以成熟肽或者截短分子形式进行颅外分泌的GHRH(如在胰岛细胞肿瘤以及多种定位肿瘤中所见)通常具有生物活性并且甚至可产生肢端肥大症(Esch et al.，1982；Thorner et al.，1984)。以重组GHRH对GH缺陷儿童或成人进行的给药提高了IGF-1水平，使GH分泌相对于GH剂量成比例增加，还激活了对于大剂量(bolusdose)GHRH的反应(Bercu and Walker，1997)。因此，GHRH给药更大程度上代表了一种提高低于正常的GH和IGF-1水平的生理替代方法。
尽管GHRH蛋白疗法可产生并刺激正常的循环GH分泌而没有实质性的副作用，但GHRH在体内短暂的半衰期要求经常性的(每天一至三次)静脉内、皮下或者鼻腔内(需要300倍高的剂量)给药。因此，作为一种长期治疗，GHRH给药是不切合实际的。但是，以加工后蛋白型(Tyr1-40或者Tyr1-Leu44)或者作为更短的截短分子而进行颅外分泌的GHRH具有生物活性(Thorner et al.，1984)。重要地，血液供给中的低水平GHRH(100pg/ml)刺激GH分泌(Corpas et al.，1993)，并且使GHRH成为用于基因治疗表达的优秀候选者。直接质粒DNA转移目前是许多存在的基因治疗策略的基础，并且从而不需要病毒基因或脂质颗粒(Muramatsu et al.，1998；Aihara and Miyazaki，1998)。骨骼肌是一种优选的靶组织，这是由于肌肉纤维寿命长并且可被环状DNA质粒转导，该质粒可在免疫活性宿主中进行超过一个月或者一年的表达(Davis et al.，1993；Tripathy et al.，1996)。先前的报道表明人类GHRH cDNA可通过一种可注射的肌源表达载体被传递入小鼠的肌肉，其中它在两周的时间内瞬时地刺激适度水平的GH分泌(Draghia-Akli et al.，1997)。
野生型GHRH在人和畜循环系统中的半衰期相对较短。人(Frohmanet al.，1984)在血浆中培养60分钟后，95％的GHRH(1-44)NH2被降解，而较短的(1-40)OH形式的激素在类似条件下培养60分钟后，仅仅表现出77％的肽降解(Frohman et al.，1989)。在基因治疗载体中插入编码较短的GHRH类型(1-40)OH的cDNA可能产生在血清中具有较长半衰期，并且提高效能的分子，并且该cDNA的插入将在经质粒注射的动物中产生更高的GH释放。另外，通过对蛋白酶敏感氨基酸进行氨基酸替换可延长hGHRH分子的血清半衰期。此外，通过使用超活性的类似物可获得GHRH生物活性的增强，该类似物可提高其对特异性受体的结合亲和性。
已经发表了一些专利，其着眼于以新的GHRH类似物蛋白(U.S.Pat.Nos.5,847,066；5,846,936；5,792,747；5,776,901；5,696,089；5,486,505；5,137,872；5,084,442；5,036,045；5,023,322；4,839,344；4,410,512；RE33,699)或者GHRH的合成或者天然存在的肽片段(U.S.Pat.Nos.4,833,166；4,228,158；4,228,156；4,226,857；4,224,316；4,223,021；4,223,020；4,223,019)进行给药，以提高生长激素的释放。已经报道了含有以下突变的GHRH类似物(美国专利号No.5,846,936)1位的Tyr变为His；2位的Ala变为Val、Leu或其它氨基酸；8位的Asn变为Gln、Ser或Thr；15位的Gly变为Ala或者Leu；27位的Met变为Nle或Leu；以及28位的Ser变为Asn。本发明的类似物无需含有在美国专利号No.5,846,936中报道的，活性所必需的全部氨基酸替换。
尽管美国专利号No.5,756,264中的具体实施方案涉及到基因治疗，其中治疗基因被传递到肌源组织中，并且在说明书中提及的一个例子是生长激素释放激素，但两个重要的差异将本发明同该系统区分开。首先，本发明涉及到一种生长激素释放激素的类似物，该类似物由于重要的修饰而区别于野生型，这些修饰提高了其作为GH促分泌物的功能对蛋白酶的敏感性降低，而稳定性提高，其可以延长进行治疗的能力；增强生物活性，其还可以提高进行治疗的能力。另外，在本发明的一个方面中，使用了一种独特的合成启动子，名为SPc5-12(Li et al.，1999)，该启动子含有来自骨骼肌α-肌动蛋白的近端血清反应元件(SRE)、多个MEF-2位点、MEF-1位点和TEF-1结合位点，该启动子显著地超越了天然肌源启动子的转录能力。这种合成启动子的独特性对于涉及到肌源启动子及其应用(例如U.S.Pat.No.5,374,544)或者用于核酸序列肌源表达系统(例如U.S.Pat.No.5,298,422)的公开专利具有显著的改善。
由此，本发明提出了一种含有提高引发生长激素释放能力的突变的类似物应用。如在实施例中所阐述，所述的类似物成功地提高了生长激素的释放，尽管没有现有技术中的类似物在8位上以Gln、Ser或者Thr进行的替换。此外，本发明提供了基因治疗技术，以向骨骼肌组织的优选选择中引入所述的类似物，这是由于肌肉纤维寿命长并且可被环状DNA质粒所诱导，其中所述类似物的表达被一种合成的肌源启动子所调节。这对于现存技术是一种改进，在现存技术中对于GHRH经常性给药的需求妨碍了其作为长期治疗的应用。
发明概要本发明的一个实施方案为具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的生长激素释放激素。
本发明的另外一些实施方案包括(1)一种用于治疗同生长激素途径相关的生长激素关联缺陷的方法；(2)一种用于治疗同遗传疾病相关的生长激素关联缺陷的方法；(3)一种用于改善动物生长表现的方法；(4)一种治疗患有生长缺陷疾病的动物的方法；(5)一种提高某种动物被用作食物的效率的方法；以及(6)一种治疗动物消瘦症状(wasting symptom)的方法，该症状与烧伤、外伤、AIDS或其它消耗性疾病相关；(7)一种刺激动物体内生长激素的产生，使其高于与正常生长相关的水平；以及(8)一种增强动物生长的方法。所有这些方法均包括向动物体内引入一种质粒载体的步骤，其中所述载体含有一种启动子；一种编码SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一种3’非翻译区，其以适于功能性表达的距离按顺序可操作地连接。
在一个优选的实施方案中，该启动子为一种合成肌源启动子，并且hGH 3’非翻译区位于3’非翻译区中。
在具体的实施方案中，所述载体选自质粒、病毒载体、脂质体或者阳离子脂类。在其它具体的实施方案中，所述的载体被引入肌源性细胞或者肌肉组织。在另一具体的实施方案中，所述的动物为人类、宠物、劳作动物或者食用动物。
一个额外的实施方案为一种药物组合物，该组合物用于刺激动物体内生长激素的释放，该组合物在药学可接受载体中含有SEQ ID NO1。
本发明的另一个实施方案为编码生长激素释放激素的核苷酸序列，该激素具有SEQ ID NO1的氨基酸序列。
在本发明的一个额外的实施方案中有一种提高动物体内生长激素的方法，该方法包括向动物体内引入治疗有效量的载体，所述的载体含有一种启动子；一种编码SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一种3’非翻译区，其适于功能性表达地可操作地连接。在另一个具体的实施方案中该启动子为一种合成的肌源性启动子。在另一个具体的实施方案中，该3’非翻译区为hGH 3’非翻译区。在另一个具体的实施方案中，该动物选自人类、宠物、劳作动物或者食用动物。在另一个具体的实施方案中该载体被引入到肌源性细胞中。在又一具体的实施方案中该载体被引入到所述动物的肌肉组织中。在另一个具体的实施方案中，该引入治疗了一种同生长激素途径相关的生长激素关联缺陷。在另一个具体的实施方案中，该缺陷疾病为所述动物体内遗传材料变化的结果。在又一实施方案中，该引入导致所述动物生长表现的改善。在另一个实施方案中，该引入提高了该动物的作用，其中该动物被用作食物。在另一个实施方案中，该引入治疗了动物同烧伤、外伤、AIDS或其它消耗性疾病相关的消瘦症状。在另一个具体的实施方案中，该引入导致了所述动物生长的提高。在另一个具体的实施方案中，该载体是以单独给药的方法而被引入所述动物中的。在又一具体的实施方案中，该载体选自质粒、病毒载体、脂质体或者阳离子脂类。
在本发明的一个额外的实施方案中有一种治疗动物体内同生长激素途径相关的生长激素关联疾病的方法，该方法包括向动物体内引入治疗有效量的载体，所述载体含有一种合成的肌源启动子；一种编码SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一种hGH的3’非翻译区，其为了功能性表达而可操作地连接。
在本发明的另一个实施方案中，有一种刺激动物体内生长激素的产生，并使其高于与正常生长相关的水平的方法，该方法包括向动物体内引入治疗有效量的载体，所述载体含有一种合成的肌源启动子；一种编码SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一种hGH的3’非翻译区，其适于功能性表达地可操作地连接。
通过阅读以下的说明书并参考构成其一部分的附图或者本发明优选实施方案的例子，其它以及进一步的目的、特征以及优点将是很明显并且更为易于理解的。
附图描述
图1A到图1C证明GHRH超活性类似物可提高GH促分泌活性和稳定性。图1A为猪野生型(1-40)OH氨基酸序列同类似物HV-GHRH的比较。图1B所示为不同GHRH种类对猪GH在猪原代脑垂体培养物(primary pituitary culture)中释放的影响。图1C所示为HV-GHRH以及野生型猪GHRH在4至6小时培养期间所发生的稳定性变化。
图2A到图2E所示为在以超活性类似物GHRH肌源表达载体进行单独注射2个月后的GHRH、GH和IGF-1血清水平的提高。图2A所描述的是含有SPc5-12合成启动子以及GH的3’UTR的结构体。作为一种突变蛋白的模型，HV-GHRH结构体被使用，并且以猪野生型作为阳性参照，以及使用β-半乳糖苷酶结构体作为阴性参照。图2B所示为经pSP-GHRH注射的猪与经安慰剂注射的参照猪相比血清GHRH的相对水平。图2C所示为经pSP-GHRH注射的猪与参照猪相比血清GHRH的绝对水平，该值经体重/血液体积的提高而校正。图2D所示为GH水平在经pSP-HV-GHRH注射的猪体内的变化。图2E所示为在以pSP-GHRH进行直接肌内注射后的血浆IGF-1水平。
图3A到图3C所示为肌源GHRH表达载体对猪生长的影响。图3A所示为经pSP-GHRH或pSP-GHRH-HV注射2个月的猪的平均重量的变化。图3B所示为经pSP-GHRH注射的猪同参照相比的饲养效率水平。图3C为注射45天后的经pSP-HV-GHRH注射的猪与经安慰剂注射的猪的比较。
图4所示为以不同量pSP-GHRH-HV进行的注射对10天大小猪的影响。
图5所示为以不同量pSP-GHRH-HV进行的注射对10天大小猪的IGF-1水平的影响。
图6所示为对小猪进行pSP-GHRH-HV质粒注射的时间过程。
发明详述本领域的技术人员很容易明白在此处披露的发明中，可以进行多种替换和修饰而并不偏离本发明的范围和精神。
此处所用的术语“动物”指的是动物界的任何物种。在优选的实施方案中该术语更加具体地指人类、宠物动物(狗、猫、马)、劳作动物(马、牛)以及食用动物及其它本领域所熟知的动物，该食用动物包括生产食物的动物(鸡、牛、鱼)或者其本身为食物(蛙、鸡、鱼、蟹、龙虾、虾、贻贝、扇贝、山羊、公猪、牛、羊羔、猪、鸵鸟、鸸鹋、鳗)。
此处所用的术语“消耗性疾病”被定义为这样一些疾病，在这些疾病中患者失去体重(多数为肌肉质量)，失去肌肉力量，骨骼可能失去矿物质(难以察觉，其机制未知)，可能并发病毒/细菌感染或者具有某些基础代谢失调。这样疾病的一些例子为AIDS、结核病或者癌症。
此处使用的术语“有效量”被定义为在宿主中产生作用所需的组合物的量，该作用可使用本领域技术人员所知的几种终端来监测。
此处所使用的术语“效率”被定义为动物每日所食用食物的量同所述的动物获得的体重量之比。
此处所用的术语“生长缺陷”被定义为任何健康状态、医学症状或疾病，在其中生长低于正常。该缺陷可以是某种畸变的结果，该畸变直接影响生长激素途径(如GHRH-GH-IGF-I轴)、间接影响生长激素途径或完全不影响生长激素途径。
此处所用的术语“生长激素”被定义为这样一种激素，其涉及生长并且作为一种化学信使在靶细胞上发挥作用。
此处所用的术语“生长激释放激素素”被定义为这样一种激素，其辅助或刺激生长激素的释放。
此处所用的术语“生长激素释放激素类似物”被定义为这样一种蛋白质，该蛋白质在该氨基酸序列的天然形式(不含合成的右旋或者环状氨基酸)中含有氨基酸突变，但该突变在天然情况下并不存在于GHRH分子中，该蛋白质仍然保持其增强生长激素合成和分泌的功能。
此处使用的术语“肌源”具体指肌肉组织。
此处使用的术语“药学可接受的”指的是某种化合物，其中以所述化合物进行的给药可被受体哺乳动物所承受。
此处使用的术语“促分泌物”指的是某种天然或者合成分子，该分子增强一种下游调节的分子的合成和分泌(例如，GHRH为GH的一种促分泌物)。
此处使用的术语“治疗有效量”指的是被用于给药的化合物的量，该量具有生理意义。一种试剂，如果其存在导致受体动物生理中的技术变化，那么它具有生理意义。例如，在生长缺陷的治疗中，一种提高生长的组合物为治疗有效的；在消耗性疾病中，一种降低消耗速度或提高生长的组合物是治疗有效的。技术人员应当了解，足量的载体被用于提供编码SEQ ID NO1的核苷酸序列的治疗有效水平的表达。
此处使用的术语“治疗”被定义为对生长缺陷疾病的至少一种症状进行良性影响或者对动物的生长进行良性影响的举措。技术人员了解术语“治疗”并不一定表示治愈，尽管对某种或某些症状的治愈包括在术语治疗的范围之内。
此处使用的术语“载体”指的是任何向细胞或者生物体传送核酸的负载物。例子包括质粒、病毒载体、脂质体或者阳离子脂类。
此处使用的术语“消瘦症状”被定义为一种同消耗性疾病相关的症状。
本发明的一个实施方案为生长激素释放激素类似物，该类似物具有SEQ ID NO1的氨基酸序列以及编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明的另一个实施方案包括(1)一种用于治疗同生长激素途径相联系的生长激素相关缺陷的方法；(2)一种用于治疗同遗传疾病相联系的生长激素相关缺陷的方法；(3)一种改善动物生长表现的方法；(4)一种治疗患有生长缺陷疾病的动物的方法；(5)一种提高某种食用动物的效率的方法；(6)一种治疗动物消瘦症状的方法，该症状与烧伤、外伤、AIDS或其它消耗性疾病相关；(7)一种用于刺激动物体内生长激素的产生，使其高于与正常生长相关的水平的方法；以及(8)一种增强动物生长的方法。所有这些方法均包括向动物体内引入一种质粒载体的步骤，其中所述的载体含有一种启动子；一种编码SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一种3’非翻译区，其以适于功能性表达的距离按顺序可操作地连接。在一个具体的实施方案中，这些方法导致生长的提高、改善或增强，或者导致生长激素生产的提高。
在本发明的一个具体实施方案中有一种治疗动物体内同生长激素途径相关的生长激素关联疾病的方法，该方法包括向动物体内引入治疗有效量的载体，所述载体含有一种启动子；一种编码SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一种3’非翻译区，其以适于功能性表达的距离可操作地连接。技术人员应当了解生长激素途径中的缺陷可能直接或者间接影响生长，并且该被影响的环节可以位于GHRH作用或功能的上游或者下游。在一个GHRH作用或功能的下游环节受影响的具体实施方案中，本发明GHRH类似物水平的提高克服了这一受影响的环节，该类似物最初以基因治疗的形式给药。
在本发明的另一个具体实施方案中有一种治疗动物同遗传疾病相关的生长激素关联疾病的方法，该方法包括向动物体内引入治疗有效量的载体，所述载体含有一种启动子；一种编码SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一种3’非翻译区，其以适于功能性表达的距离可操作地连接。该缺陷由遗传疾病直接或者间接地导致，并且可能存在其它症状。这些遗传疾病的例子包括，Creutzfeldt-Jakob病、Cohen综合征、氨基喋呤-氨甲喋呤综合征、Kabuki综合征、Wolf-Hirschhorn综合征、Russell-Silver综合征、Miller-Dieker综合征、朗格罕氏细胞组织细胞增多病综合征、Roberts综合征以及18q综合征，但不限于此。
在本发明的另一个实施方案中，有一种治疗患有生长激素缺陷疾病的方法，该方法包括向动物体内引入治疗有效量载体的步骤，所述载体含有一种启动子；一种编码SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一种3’非翻译区，其以适于功能性表达的距离可操作地连接。该生长缺陷疾病可能由一种基因缺陷或者生长激素途径的缺陷所导致。
在本发明的另一个实施方案中，有一种改善动物生长表现的方法，该方法包括向动物体内引入治疗有效量的载体，所述载体含有一种启动子；一种编码SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一种3’非翻译区，其以适于功能性表达的距离可操作地连接。此处所用的术语“生长表现”被定义为动物生长的状态或者状况。该生长表现可能是遗传疾病、生长相关缺陷或者该动物或其亲本暴露于生长影响剂的结果。在一个具体的实施方案中，改善动物生长表现的方法包括提高动物生长的方法。
在本发明的另一个具体的实施方案中，有一种刺激动物生长激素产生，并使其高于与正常生长相关水平的方法，所述方法包括向动物体内引入有效量的载体，所述载体含有一种启动子；一种编码SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一种3’非翻译区，其以适于功能性表达的距离可操作地连接。高于与正常生长相关的水平包括患有生长相关缺陷的动物或者与同种群其它类似动物，包括未患有生长相关缺陷的那些动物，具有类似生长水平的动物的基线的，固有的生长。
在本发明的另一个实施方案中，有一种增强动物生长的方法，该方法包括向动物体内引入有效量的载体，所述载体含有一种启动子；一种编码SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一种3’非翻译区，其以适于功能性表达的距离可操作地连接。生长被增强的该动物可能患有或者未患有生长缺陷。
在本发明的一个实施方案中有一种载体，该载体含有一种启动于；一种编码SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一种3’非翻译区，其以适于功能性表达的距离可操作地连接。本领域的技术人员认识到，各种核苷酸序列均可用于编码SEQ ID NO1。所使用的具体序列是在待修饰的具体序列上部分决定的并且实验条件由技术人员针对具体用途而决定。如本文所示，技术人员可使用GHRH cDNA序列进行定点诱变以在该序列中产生变化，使同时含有天然或者种属特异性序列以及所需的蛋白酶抗性的氨基酸替换等等。此处所提供的例子是针对如何通过诸如定点诱变这样的方法来改变核苷酸序列以获得所需的序列。技术人员因此应当了解如何通过使用诸如SEQ ID NO8或者来自GenBank(见下文)的类似序列作为模板通过定点诱变或其它已知的方法来对其进行改变以获得编码SEQ ID NO1的核苷酸序列。SEQ ID NO1的氨基酸序列可以由能够从GenBank中检索序列、了解此处提供的用于进行定点诱变的方法以及遗传密码表的技术人员容易地制造，因为各密码子的摆动位置(第三)，该氨基酸序列由多个核苷酸序列所编码，该密码表的例子可见于任何标准的生化或者分子生物学教科书(例如，Biochemistry，3rded.，L.Stryer；W.H.Freeman and Co.，N.Y.(1988))。
在一个优选的实施方案中，该启动子为合成的肌源启动子并且hGH3’非翻译区位于该3’非翻译区。在本发明的一个具体的实施方案中使用了一种合成的启动子，名为SPc5-12(Li et al.，1999)(SEQ IDNO6)，该启动子含有来自骨骼肌α-肌动蛋白的近端血清反应元件(SRE)、多个MEF-2位点、MEF-1位点和TEF-1结合位点，该启动子显著地超越了天然肌源启动子的转录能力。包括反式作用因子结合位点和增强子在内的其它元件可根据本发明的这一实施方案而使用。在一个替代的实施方案中，一种天然的肌源启动子被使用，并且技术人员知道如何从数据库中获得这样的启动子序列，这些数据库包括国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank数据库(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html)或者NCBI PubMed站点(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed)。技术人员知道这些万维网站点可用于获得本发明所涉及的序列或者相关文献。
在一个具体实施方案中，该hGH 3’非翻译区(SEQ ID NO7)在一种核酸载体，例如质粒中被使用。
在一个具体的实施方案中有一种方法，该方法用于增加动物体内生长激素，该方法使用一种含有编码SEQ ID NO1的核苷酸序列的载体。如在实施例中所述，人类GHRH cDNA(SEQ ID NO8)被用作定点诱变的模板以产生该序列的变化，以此获得同时含有猪的天然序列以及所需的可以蛋白酶抗性的氨基酸替换等等。由此，这些例子提供了指导，该指导在此处涉及到如何通过诸如定点诱变这样的方法来获得所需的序列。技术人员因此应当知道如何通过使用诸如SEQ ID NO8或者来自GenBank(见上文)的类似序列作为模板，通过定点诱变或其它已知的方法来对其进行改变，以获得编码SEQ ID NO1的核苷酸序列。SEQ ID NO1的氨基酸序列可以由能够从GenBank中检索序列、了解此处提供的用于进行定点诱变的方法以及遗传密码表的技术人员容易地制造，因为各密码子的摆动位置(第三)，该氨基酸序列由多个核苷酸序列所编码，该密码表的例子可见于任何标准的生化或者分子生物学教科书(例如，Biochemistry，3rded.，L.Stryer；W.H.Freeman and Co.，N.Y.(1988))。
在一个具体的实施方案中，所述载体选自质粒、病毒载体、脂质体或者阳离子脂类。在又一具体实施方案中，所述载体被引入肌源细胞或者肌肉组织。在又一具体实施方案中所述动物为人类、宠物、劳作动物或者食用动物。
另一个实施方案为一种药物组合物，该组合物用于刺激动物体内生长激素的释放，该组合物在一种药学可接受的载体中含有SEQ ID NO1。
本发明的另一实施方案是编码生长激素释放激素的核苷酸序列，其中的生长激素释放激素具有SEQ ID NO1的氨基酸序列。
除经过一种质粒载体向动物体内引入所述结构体的具体实施方案之外，本领域已知的用于向动物或者其细胞进行核酸转染的传递系统也可被使用。例如，可使用其它非病毒或病毒方法。技术人员认识到，一种用于非病毒形式DNA或RNA的靶向系统包括四个组分1)目的DNA或RNA；2)识别并结合细胞表面受体或抗原的部分(moiety)；3)DNA结合部分；4)实现该复合物从细胞表面向细胞质转运的溶细胞部分。此外，脂质体和阳离子脂类可被用于传递该医疗基因组合，以获得相同的疗效。可能的病毒载体包括衍生自病毒的表达载体，病毒的例子为腺病毒、痘病毒以及猪乳头状瘤病毒。另外，附加型载体也可使用。其它DNA载体和转运蛋白系统在本领域中是已知的。
本领域的技术人员认识到，衍生自各种细菌质粒、反转录病毒、腺病毒、疱疹病毒或者痘病毒的表达载体均可用于向靶器官、组织或者细胞群体传递核苷酸序列。本领域的技术人员所熟知的方法可被用于构建重组载体，该载体表达编码生长激素释放激素类似物的基因。以非复制载体进行的瞬时表达可持续一个月或更久，如果该载体系统的一部分为适当的复制元件，该时间可更长。
核酸1.载体术语“载体”用于指一种用于向一种细胞引入核取分子的载体核酸分子，该载体可在该细胞中复制，该载体中可插入核酸分子。核酸序列可以是“外源的”，这指的是该核酸对于被引入载体的，细胞是外来的，或者该序列与该细胞中的一个序列同源，但在该宿主细胞核酸中的位置没有发现该序列。这些载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒以及植物病毒)以及人工染色体(例如，YAC)。本领域的技术人员应配有较好的设备以通过标准重组工艺来构建载体，这些工艺的描述见Maniatis et al.，1988和Ausubel et al.，1994，两者均在此引为参考。
术语“表达载体”指的是一种载体，该载体含有一种核酸序列，该序列编码能够被转录的一种基因产物的至少一部分。在一个具体的实施方案中，该核酸序列编码部分或全部的GHRH。在某些情况下，RNA分子随后被翻译成为蛋白质、多肽或肽。在其它的情况下，例如在反义分子或者核糖体的产生中这些序列并不被翻译。表达载体可含有多种“控制序列”，该术语指在特定的宿主生物体中，可操作连接的编码序列可能的转录和翻译所必需的核酸序列。除控制转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体可能还含有发挥其它作用的核酸序列，其在下文中描述。
a.启动子和增强子
“启动子”为一种控制序列，该序列是一种核酸序列的区域，在该区域中转录的起始和速度受到控制。启动子可能含有遗传元件，调节蛋白和分子可在该元件上同RNA聚合酶以及其它转录因子相结合。短语“可操作地位于”、“可操作地连接”、“受控于”以及“受到转录控制”意指启动子相对于核酸序列处于正确的功能性位点和/或方向，这样可以控制转录的起始和/或该序列的表达。启动子是否同“增强子”联合使用均可，“增强子”指的是一种顺式作用调节序列，该序列参与核酸序列转录的激活。
一种启动子可能同一种基因或者序列具有天然的联系，这是由于该启动子可通过分离位于编码部分和/或内含子上游的5’非编码序列而获得。这样的启动子可称之为“内源的”。类似地，一种增强子可能同一种位于该序列上游或下游的核酸序列具有天然的联系。在替代的情况下，通过使编码核酸片段处于一种重组或者异源启动子的控制之下，可以获得特定的好处，该重组或者异源启动子指的是一种在正常情况下同某种核酸序列在其天然环境中并无联系的启动子。一种重组或者外源启动子指的是一种在正常情况下，同在其天然环境中的某种核酸序列并无联系的启动子。这样的启动子或者增强子可包括其它基因的启动子或者增强子、分离自任何其它原核、病毒或者真核细胞的启动子或者增强子以及非“天然存在的”启动子或者增强子，即，该启动子或者增强子含有不同转录调节区域的不同元件，和/或可改变表达的突变。除合成产生启动子或者增强子的核酸序列之外，这些序列还可以使用重组克隆和/或包括PCRTM在内的核酸扩增技术来产生，这些序列的产生与在此披露的组合物相联系(见，美国专利4,683,202,美国专利5.928.906，在此均引为参考)。此外，应当考虑到引导诸如线粒体、叶绿体等的非核细胞器中序列的转录和/或表达的控制序列也可使用。
自然地，使用一种在被选用于表达的细胞型、细胞器和生物体中有效地引导该DNA片段表达的启动子和/或增强子是很重要的。分子生物学领域的技术人员一般了解用于蛋白表达的启动子、增强子和细胞类型组合的使用，例见Sambrook et al.，(1989)，在此引为参考。所使用的启动子可以是组成型、组织特异性、可诱导和/或在适当条件下可用于引导被引入DNA片段的高水平表达，例如，该启动子有利于重组蛋白和/或肽的大规模生产。该启动子可以是异源的或者内源的。在一个具体的实施方案中，该启动子为一种合成的肌源启动子，如在Liet al.(1999)中的描述。
组织特异性启动子或元件的鉴定以及其活性的特征分析对于本领域的技术人员是已知的。这样的区域包括人类LIMK2基因(Nomoto etal.，1999)、促生长素抑制素受体2基因(Kraus et al.，1998)，鼠科动物附睾视黄酸结合基因(Lareyre et al.，1999)、人类CD4(Zhao-Emonet et al.，1998)、小鼠α2(XI)胶原蛋白(Tsumaki，et al.，1998)、D1A多巴胺受体基因(Lee et al.，1997)、胰岛素样生长因子II(Wu et al.，1997)、人类血小板内皮细胞粘附分子-1(Almendro et al.，1996)。
b.起始信号和内部核糖体结合位点编码序列的有效翻译可能需要一种特异的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或者邻近的序列。可能需要提供包括ATG起始信号在内的外源翻译控制信号。本领域的普通技术人员将能够方便地决定这一点并且提供必要的信号。众所周知该起始密码子必须处于所需编码序列读框的“框架内”以保证插入全部翻译。该外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然或者合成的。表达的效果可以由适当转录增强子元件的引入所增强。
在本发明的特定实施方案中，内部核糖体进入位点(IRES)元件的使用被用于产生多基因或者多顺反子信息。IRES元件能够省略5’甲基化加帽依赖的翻译核糖体扫描模式，并且在内部位点起始翻译(Pelletier and Sonenberg，1988)。来自细小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件已经被描述(Pelletier and Sonenberg，1988)，被描述的还有一种来自哺乳动物信息的IRES(Macejak and Sarnow，1991)。IRES可被连接于异源开放读框。多开放读框可被一起转录，各框架之间由一个IRES分隔，这产生了多顺反子信息。由于IRES元件的优点，各开放读框可进入核糖体以进行有效的翻译。使用单独的启动子/增强子可有效表达多基因以转录一种单独的信号(见美国专利5,925,565，在此引为参考)。
c.多克隆位点载体可含有一个多克隆位点(MCS)，该位点为一种核酸区域，该区域含有多个限制性内切酶位点，这些位点均可联系标准重组技术而用于消化载体。(见Carbonelli et al.，1999，Levenson et al.，1998以及Cocea，1997，在此引为参考。)“限制性酶消化”指的是以一种酶进行的对一种核酸分子的催化切割，该酶仅作用于核酸分子中的特定位点。多种这样的限制性酶可从商业上获得。这种酶的使用为本领域的技术人员所广泛了解。通常情况下，载体是使用一种限制性酶进行线性化或片段化的，其在MCS内进行切割以使外源序列能同该载体连接。“连接”指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，这两个片段彼此可能邻近或者并不邻近。涉及到限制性酶以及连接反应的技术为重组技术领域的技术人员所熟知。
d.剪接位点多数转录的真核RNA分子经过RNA剪接以从原始转录本中除去内含子。含有基因组真核序列的载体可能需要供体和/或受体剪接位点以确保用于蛋白表达的转录本的适当加工。(见Chandler et al.，1997，在此引为参考。)e.多腺苷酸化信号在表达中，多聚腺苷酸化信号在典型情况下，包括一如有效地进行转录本适当多聚腺苷酸化的多聚腺苷酸化信号。多聚腺苷酸化信号的特性对于成功实践本发明据信并不是决定性的，并且/或者任何这样的序列均可被使用。优选的实施方案包括SV40多聚腺苷酸化信号和/或牛生长激素多聚腺苷酸化信号，这些信号对于在多种靶细胞中良好地发挥功能是方便和/或已经为人所知的。转录终止位点同样被考虑为表达弹夹的一个元件。这些元件发挥作用以增强信息水平和/或通过从弹夹到其它序列中而使阅读最小化。
f.复制起点为在一种宿主细胞中增殖一种载体，它可含有一个或者多个复制位点的起点(通常称为“ori”)，该起点为一种特异的核酸序列，复制起始于该点。或者，如果该宿主细胞为酵母，则使用一种自主复制序列(ARS)。
g.可选择和可筛选的标记在本发明的特定实施方案中，所述细胞含有本发明的核酸结构体，通过在表达载体中包含入标记，而可在体内或者体外对细胞进行鉴别。这样的标记可使细胞获得一种可鉴别的变化，该变化使含有该表达载体的细胞可被容易地鉴别。通常情况下，可选择的标记为赋予允许选择的特性的标记。阳性可选择标记为该标记的存在考虑到其选择的标记，而阴性可选择标记为该标记的存在防止其选择的标记。阳性可选择标记的一个例子为药物抗性标记。
通常情况下药物选择标记的引入方便了克隆和转化体的鉴别，例如，导致对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin以及组氨醇的抗性的基因为有用的可选择标记。除赋予某一基于条件的补充可实现对转化体辨别的表型的标记外，包括诸如GFP这样的可筛选标记在内的其它类型的标记也在考虑的范围内，GFP标记的基础为比色分析。或者可以利用诸如肝炎单一病毒胸苷激酶(tk)或者氯霉素乙酰转移酶(CAT)这样的筛选酶。本领域的技术人员还应了解如何使用免疫学标记，该标记可能同FACS分析联合使用。所使用的标记据信并不重要，只要该标记能够同编码一种基因产物的核酸同步表达便可。可选择标记和可筛选标记的进一步的例子为本领域的技术人员所熟知。
2.宿主细胞此处所使用的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用。所有这些术语还包括其子代，这些子代为任意和全部的后代。可以认为全部子代由于人为或者自然的突变而可能不尽相同。在对异源核酸序列进行表达的情况下，“宿主细胞”指的是一种原核或者真核细胞，该术语包括任何可转化的生物体，该生物体能够复制一种载体和/或表达载体所编码的异源基因。宿主细胞可以并且已经被用作为载体的受体。宿主细胞可以被“转染”或者“转化”，该术语指的是一种外源核酸被转移或者引入该宿主细胞的过程。被转化细胞包括该原初主体细胞及其后代。
宿主细胞可以来自原核或者真核生物，这取决于所需的结果为该载体的复制还是部分或者全部载体编码的核酸序列的表达。数目众多的细胞系或者细胞培养物均可用作宿主细胞，它们可从American TypeCulture Collection(ATCC)中获得，ATCC为一个组织，该组织作为活培养物和遗传材料的档案馆而发挥作用(www.atcc.org)。该领域的技术人员可根据载体主链和所需的结果而决定适当的载体。例如，可向一种原核宿主细胞引入质粒或者粘粒，以进行多种载体的复制。被用作进行载体复制和/或表达的宿主细胞的细菌细胞包括DH5α、JM109和KC8，以及一批商业化的细菌宿主如SURE感受态细胞和SOLOPACKGold细胞(STRATAGENE，La Jolla)。在替代情况下，诸如大肠杆菌LE392这样的细菌细胞可被用作噬菌体病毒的宿主细胞。
用于载体复制和/或表达的真核宿主细胞的例子包括HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。来自于各种细胞类型和生物体的多种宿主细胞可以获得并且对于本领域的技术人员是已知的。在类似的情况下，病毒载体可同真核或者原核宿主细胞联合使用，特别是允许该载体的复制或者表达的细胞。
一些载体可使用控制序列，该控制序列使其可以在原核细胞和真核细胞中表达。该领域的技术人员还应了解培养上述所有宿主细胞以对其进行维持并且使载体进行复制的条件。应当被了解的还有进行载体大规模生产以及载体所编码的核酸以及其关联多肽、蛋白质或肽的生产工艺和条件。
3.表达系统存在多种含有部分或者全部上述组合物的表达系统。基于原核和/或真核的系统可被用于本发明以产生核酸序列或其关联多肽、蛋白质和肽。许多这样的系统已经商业化并且被广泛应用。
昆虫细胞/杆状病毒系统可产生异源核酸片段的高水平蛋白表达，例如在美国专利No.5,871,986，4,879,236中的描述，这两者在此引为参考，并且该系统可购自INVITROGEN，名为MAXBAC2.0以及CLONETECH，名为BACPACK。
表达系统的其它例子包括STRATAGENE的COMPLETE CONTROL诱导哺乳动物表达系统，该系统涉及到一种合成的蜕皮激素-诱导型受体，其它例子还包括其pET表达系统，该系统为一种大肠杆菌表达系统。诱导型表达系统的另一个例子来自INVITROGEN，该系统携带有T-REXTM(四环素调节的表达)系统，该系统为一种哺乳动物表达系统，该系统使用全长CMV启动子。INVITROGEN还提供了一种酵母表达系统，称为Pichia methanolica表达系统，该系统被设计用于重组蛋白在甲基营养酵母Pichia methanolica中的高水平表达。该领域的技术人员应当了解如何表达一种诸如表达结构体这样的载体，以产生核酸序列或及其关联多肽、蛋白质或肽。
诱变在应用的情况下，诱变可通过多种标准诱变程序而完成。突变是一种过程，通过该过程在生物体的量或者结构上产生变化。突变可涉及到某种单一的基因、基因群或者整个染色体的核苷酸序列的修饰。单基因的变化可以是点突变的结果，该点突变涉及到一个DNA序列中的一个单一核苷酸碱基的删除、添加或替换，或者单基因的变化可以是一些变化的结果，这些变化涉及到大量的核苷酸的插入或删除。
突变可作为一些事件的结果而自发产生，这些事件如在DNA的复制中的保真性错误或者可转座遗传因子(转座子)在基因组中的移动。突变还可通过暴露于化学或者物理诱变剂而被诱导。这样的突变诱导剂包括离子化辐射、紫外线以及多种的化学品的组合，如烷基化试剂以及多环芳香族烃，所有这些均可直接或间接地(通常随一些代谢的生物转化进行)同核酸相互作用。通过这样的环境试剂所诱导的DNA损害在受影响的DNA被复制或者修复的情况下，可能导致碱基序列的修饰，并由此而导致突变。突变还可通过使用特定的靶向方法进行定点。
定点诱变结构介导的位点特异性诱变为对蛋白-配基相互作用进行分析和改造的重要工具(Wells，1996，Braisted et al.，1996)。该技术通过向被选中的DNA中引入一种或者多种核苷酸序列变化而提供了序列变体的制备和测试。
位点特异性诱变使用特异性的寡核苷酸序列，该序列编码所需的突变以及足量的毗邻未修饰核苷酸的DNA序列。通过这一途径提供了具有足以在所穿过的缺失接头两侧形成双链体的大小和复杂度的引物序列。长约17到25个核苷酸的引物是优选的，在该序列的接头两侧约有5到10个残基被变动。
该工艺在典型的情况下使用噬菌体载体，该载体以单链和双链形式存在。可用于定点诱变的载体包括诸如M13噬菌体这样的载体。这些噬菌体载体可从商业上获得并且其应用一般为该领域的技术人员所熟知。在常规情况下，双链的质粒也可用于定点诱变，这消除了将目的基因从噬菌体中转移到质粒中的步骤。
通常情况下首先获得一种单链的载体，或熔化一种双链载体的两条链，该载体的序列中包括编码所需蛋白或者遗传因子的DNA序列。经合成制备的带有所需突变序列的寡核苷酸引物随即同该单链DNA制品进行退火，选择杂交条件时应考虑到不匹配程度。对该杂交产物使用DNA聚合酶，如大肠杆菌聚合酶I(Klenow片段)，以完成携带突变链的合成。由此而形成了一种异双链体，其中一条链编码原始的未突变序列，另一条链携带有所需的突变。该异双链体载体随后被用于转化适当的宿主细胞，例如大肠杆菌细胞，选择含有携带突变序列的重组载体的克隆。
功能性意义的综合信息以及蛋白的一个给定残基的信息内容在最佳情况下可通过饱和突变获得，在该突变中所有19个氨基酸替换均经过测试。这一方法的缺点为多残基饱和突变的后勤工作令人生畏(Warren et al.，1996；Brown et al.，1996；Zeng et al.，1996；Burton and Barbas，1994；Yelton et al.，1995；Jackson et al.，1995；Short et al.，1995；Wong et al.，1996；Hilton et al.，1996)。必须对成百甚至上千的位点特异性突变进行研究。但是，经过改进的技术使突变体的产生和筛选更加直接。“walk-through”诱变的描述又见美国专利5,798,208和5,830,650。
定点诱变的其他方法披露于美国专利5,220,007；5,284,760；5,354,670；5,336,878；5,389,514；5,635,377以及5,789,166。
体外扫描诱变随机诱变可使用错误倾向PCR(error prone PCR)进行引入(Cadwell and Joyce，1992)。诱变速度可通过在多个含模板溶液的试管中进行PCR而提高。
一种特别有用的诱变工艺为丙氨酸扫描诱变，在该工艺中一批残基被丙氨酸单独地替换，以测定失去侧链相互作用的影响，同时使蛋白构象中大范围干扰的危险达到最小(Cunningham et al.，1989)。
在最近几年，使用微量蛋白来测定配基结合的平衡常数的技术已被开发出来(Blackburn et al.，1991；美国专利5,221,605和5,238,808)。以少量材料进行功能性分析的能力可被用于开发高效的，用于抗体饱和诱变的体外方法。本发明者通过将PCR诱变同体外转录/翻译结合使用而省却了克隆步骤，以进行蛋白质突变体的高通量生产。在此，PCR产物被直接用作进行突变单链抗体体外转录/翻译的模板。由于该方法中产生并分析了所有19种氨基酸高效率的替换，在大量的目的残基上进行饱和诱变如今成为可能，该过程可被描述作体外扫描饱和诱变(Burks et al.，1997)。
体外扫描饱和诱变提供了一种用于获得大量结构功能信息的快捷方法，这些信息包括(i)调控配基结合特异性的残基的鉴别，(ii)配基结合的更好理解，其基于在一个给定位置上维系活性氨基酸和导致失去活性的氨基酸的鉴别，(iii)对活性位点或者蛋白亚结构域的整体弹性的评估，(iv)对导致结合增强的氨基酸替换的鉴定。
剂量和配方本发明的组合物(活性组分；如SEQ ID NO1或者编码该序列的核苷酸或者含有编码SEQ ID NO1的核苷酸的载体)可经制剂化并且进行给药以治疗多种生长缺陷状态，该给药通过任何可使活性成分与动物体内试剂作用位点相接触的手段进行。本发明的组合物被定义为一种含有编码本发明化合物的核苷酸的载体，该化合物为一种此处所描述的氨基酸序列类似物。以足量的所述组合物进行给药以产生所述化合物的医疗有效量。技术人员了解，足量的载体被用于提供医疗有效水平的编码SEQ ID NO1的核苷酸序列表达。该领域的技术人员了解，术语“经过给药”和“被引入”可互换使用。
该组合物可通过任何同药物联合使用的常规方法进行给药，在该药中该组合物可作为单独的医疗活性成分或者存在于多种医疗活性成分的组合中。这些组合物可被单独进行给药，但在一般情况下同一种药学载体一起进行给药，该载体基于所选给药途径和标准药学实践进行选择。这样的药学组合物可被用于人类或者兽医临床医学的医疗或者诊断目的。例如，它们可用于生长相关失调的治疗，如垂体功能减退性矮小和由于生长激素产生异常所导致的糖尿病。进一步，它们还可为肉类的生产而用于刺激动物的生长或者增强动物的饲养效率，增强奶产量以及刺激蛋产量。
给药的剂量应为活性组分的医疗有效量，并且理所应当地应根据已知的因素进行改变，如特定活性成分的药效特征及其给药模式和路线；动物的种类；受体的年龄；受体的性别；受体的健康情况；受体的体重；症状的性质和程度；同时进行治疗的种类；治疗的频率；以及所需的效果。用于给药的本发明载体的适当剂量应根据各个受治疗者以及待治疗的症状而略有变化。技术人员应能够根据已知的生长激素循环水平，联系正常的生长以及该载体的生长激素释放活性来确定适当的剂量。正如该领域所已知，生长相关失调的治疗必须根据生长激素产生的不足程度而在个体间加以变化。用以刺激牲畜中生长活性的剂量应明显高于(每千克被治疗者体重)用于在诸如人垂体性矮小这样的生长激素缺陷的情况下，恢复正常生长的剂量。
由此，根据本发明提供了一种治疗生长相关失调的方法，该失调的特征在于生长激素产生的缺乏，该方法包括以一定量的本发明的类似物进行给药，该量足以刺激生长激素在正常生长水平上的生产。在各个体中，生长激素的水平变化很大，并且对于某一给定的个体，在一天期间，生长激素的循环水平也有明显变化。
所提供的还有一种通过以一定量的本发明的GHRH类似物进行给药来提高动物生长速度的方法，该量足以刺激生长激素在高于与正常生长相关的水平上生产。
基因疗法给药在适当情况下，该基因治疗载体可通过该领域已知的方法配制成为固体、半固体、液体或者气体形式的制剂，用于它们各自途径的给药。该领域已知的方法可被用于在该组合物到达靶器官之前防止其释放和吸收或用于确保该组合物的缓释释放。所应用的应为药学上可接受的形式，该组合物不应使本发明的组合物失效。在药学剂量形式中，该组合物可单独使用或同其它药学活性化合物适当联合，组合使用。
因此，本发明的药物组合物可经过多种途径被传递到动物体内的多种位点以获得特定的效果(例见Rosenfeld et al.(1991)；Rosenfeldet al.(1991a)；Jaffe et al.，1992)。该领域的技术人员应当了解，尽管多种途径可被用于给药，一种特定的途径与其他途径相比，可提供更加直接并且更加有效的反应。通过给药可进行局部或者全身的传递，该给药包括制剂的应用或者向体腔的滴注、气溶胶的吸入或者吹入或者胃肠道外的引入，这包括肌内、静脉内、腹膜、皮下、真皮内的引入，除此之外还有局部给药。
该领域的技术人员认识到不同的传递方法可被用于以一种载体向细胞进行给药。其例子包括(1)利用物理手段的方法，例如电穿孔(电学)、基因枪(物理力)或者使用大体积的脂类(压力)；(2)所述载体同另一种实体形成复合体的方法，该实体的例子如脂质体或者转运蛋白分子。
因此，本发明提供了一种将一种医疗基因转移入一种宿主的方法，该方法包括以本发明的载体进行给药，该给药过程使用任一种上述的给药途径或者该领域的技术人员所已知的适于某一特定的应用的替代途径进行，在优选的情况下该载体为一种组合物的一部分。根据本发明，载体至宿主细胞的有效基因转移可以以疗效的方式进行监测(例如，与被治疗的特定疾病相关的一些症状的减轻)，或者，进一步，可通过被转移基因或者该基因在宿主中表达的证据来监测(例如，使用与测序关联的聚合酶链反应、Northern或者Southern杂交或者转录分析来检测宿主中的核酸，或者使用免疫印迹分析、抗体介导的检测、mRNA或者蛋白质半衰期研究或者具体化分析来检测由被转移核酸所编码的蛋白质或者多肽，或者由于该转移所导致的水平或者功能上的影响)。
此处所描述的方法绝非面面俱到，并且对于普通的技术人员来说，适于具体应用的其它方法是很明显的。此外，可进一步通过同已知的化合物进行类比而估计出这些组合物的有效量来产生所需的效果。
进一步，实际的剂量和用药时间表可根据该组合物是否同其它药物组合物进行组合给药，或根据个体间在药动学、药性或者代谢上的差异来进行变化。类似地，这些量在体外应用中可根据使用的具体细胞系而变动(例如，根据存在于细胞表面的载体受体的数量或者用于基因转移的具体载体在该细胞系中复制的能力)。进一步，被加入每个细胞中的载体量很可能应随着被插入该载体的医疗基因的长度和稳定性，以及该序列的性质而变化，并且该量为一种需要根据经验来确定的参数，并可由于一些非本发明方法所固有的参数而变化(例如，合成费用)。该领域中的技术人员可很容易地根据具体情况的需要而进行任何必要的调整。
以下的实施例通过例子的形式给出，并且并不期望以任何方式限制本发明的范围。
实施例1GHRH超活性类似物提高GH促分泌活性和稳定性GHRH在人类(Frohman et al.，1984)以及猪的循环系统中的半衰期相对较短，约为12分钟。通过使用延长其生物半衰期和/或提高其GH促分泌活性的GHRH类似物达到了对GH分泌的增强。通过定点诱变产生了GHRH突变体。Gly15为Ala15所替换以增加α-螺旋构象以及两亲性结构从而降低了胰蛋白酶样酶对其的切割(Su et al.，1991)。具有Ala15替换的GHRH类似物对GHRH受体表现出4-5倍更强的亲和性(Campell et al.，1991)。为降低Met氧化所造成的生物活性的损失，使用具有游离COOH未端分子约稍更稳定形式(Kubiak et al.，1989)而进行了以Met27和Ser28对Leu27和Asn28的替换。由此形成了命名为GHRH-15/27/28的三氨基酸替换突变体。二肽基肽酶IV为一种主要的血清GHRH降解酶(Walter et al.，1980；Martin et al.，1993)。通过获取GHRH15/27/28并随后以Ala2(GHRH-TI)替换Ile2或以Val2(GHRH-TV)替换，或通过以Tyr1和Ala2替换His1以及Val2(GHRH-HV(图1A)；H1V2A15L27N28)而产生了二肽酶的不良底物。
实施例2DNA结构体为检测突变的猪GHRH cDNA序列的生物活性而对质粒载体进行了改造，该载体能够通过一种新描述的合成肌肉启动子SPc5-12来控制骨骼肌特异基因的最高水平的表达，该启动子含有一种来自骨骼α-肌动蛋白、多MEF-2位点、多MEF-1位点以及TEF-1结合位点的近血清效应元件(Li et al.，1999)。通过该领域已知的方法向肌源GHRH表达载体引入一个228-bp的pGHRH片段，该片段编码31个氨基酸的信号肽以及完整的成熟猪GHRH肽(Tyr1-Gly40)和/或GHRH突变体，随后为hGH cDNA的3’非翻译区域。质粒pSPc5-12在pSK-GHRH主链的SacI/BamHI位点(Draghia-Akli et al.，1997)中含有一个360bp的SPc5-12合成启动子的SacI/BamHI片段(Li et al.，1999)。
通过对人类GHRH cDNA(SEQ ID NO8)进行定点突变而获得了野生型和突变的猪GHRH cDNA，该突变使用试剂盒Altered Sites II在体外诱变系统中进行(Promega；Madison，WI)。人类GHRH cDNA作为BamHI-HindIII片段被亚克隆入pALTER Promega载体的对应位点并根据制造商的指导进行诱变。通过使用SEQ ID NO2的引物改变人类氨基酸34和38而从人类cDNA中获得猪野生型cDNA5’-AGGCAGCAGGGAGAGAGGAACCAAGAGCAAGGAGCATAATGACTGCAG-3’。
猪HV突变以SEQ ID NO3的引物制造5’-ACCCTCAGGATGCGGCGGCACGTAGATGCCATCTTCACCAAC-3’。
猪15Ala突变以SEQ ID NO4的引物制造5’-CGGAAGGTGCTGGCCCAGCTGTCCGCC-3’。
猪27Leu28Asn突变以SEQ ID NO5的引物制造5’-CTGCTCCCAGGACATCCTGAACAGGCAGCAGGGAGAG-3’。
诱变之后所产生的克隆经测序以确认其正确性并且随后通过该领域技术人员所熟知的方法将其亚克隆入本实施例所描述的pSK-GHRH的BamHI/HindIII位点。
技术人员了解，其它的GHRH序列可代替SEQ ID NO8而被利用，这些序列包括来自Mus肌(SEQ ID NO9；GenBank登记号NM_010285)；Bos taurus(SEQ ID NO10；GenBank登记号AF168686或者SEQ ID NO11；GenBank登记号BTU29611)；Equus caballus(SEQ ID NO12；GenBank登记号AF097587)；Rattus norvegicus(SEQ ID NO13；GenBank登记号RNU10156)。
实施例3细胞培养和转染在猪垂体前叶和鸡原代成肌细胞培养物中进行的实验均获得了成功。然而，所有的图展示了为猪垂体前叶培养物的数据。鸡原代成肌细胞培养物如下获得。采集鸡胚组织，解剖外面的皮肤和软骨并进行机械分离。使细胞悬浮物通过干酪包布和拭镜纸，并以1×108到2×108/100mm的密度铺于塑料培养皿内。悬浮物中存留的细胞群体以2×106到3×106个细胞/胶原包埋的100mm塑料皿的密度铺平板并在37℃下，在5％CO2环境中保养。细胞随后在转染前以1.5×106/100mm平板的密度保温24小时，培养在最低基本培养基(MEM)中进行，该培养基补充以10％的热失活马血清(HIHS)、5％的鸡胚抽提物(CEE)(Gibco BRL；Grand Island，NY)和庆大霉素。进一步的细节见Draghia-Akli et al.，1997以及Bergsma et al.，1986。猪垂体前叶培养物基本根据描述获得(Tanner et al.，1990)。简而言之，在酶解条件下解离垂体组织，铺于塑料培养皿上足够的时间使其附着。随后漂洗细胞并在实验前暴露于培养基中。细节见Tanner et al.，(1990)。
每100mm平板以4mg质粒对细胞进行转染，转染根据制造商的指导使用脂质转染胺进行。转染之后，将培养基换成MEM以使细胞分化，该MEM含有2％HIHS以及2％CEE。分化后72小时收集细胞和培养基。通过参照组平板的β-牛乳糖苷酶组织化学估测转染效率为10％。收集前一天，将细胞在Hank’s平衡盐溶液中(HBSS)进行洗涤并将培养基换成0.1％牛血清白蛋白的MEM。条件化培养基的处理为，加入0.25体积的1％三氯乙酸和1mM苯甲磺酰氟，在-80℃下冷冻，冻干，在C-18Sep-柱中纯化(Peninsula实验室，Belmont，CA)，再冻干并用于放射性免疫分析或者重悬浮于对原代猪垂体前叶培养物进行条件化的培养基内。
实施例4GHRH超活性类似物提高了GH促分泌活性和稳定性按照实施例3以各种结构体对骨骼成肌细胞进行转染，并且对纯化自条件化培养基细胞的GHRH部分进行猪垂体前叶细胞培养物的生长激素分泌分析。如图1B所示，24小时后收集并经过猪特异性GH-放射免疫分析的培养基显示，经修饰的GHRH类型(GH15/27/28；GHRH-TI；GHRH-TV)相对于野生型pGHRH在GH分泌上适度地提高了20％到50％。四种突变体中只有一种，GHRH-HV，在GH促分泌活性上有较大的提高，其中DGH水平由基线值200ng/ml提高至1600ng/ml(图1B)。
实施例5HV-GHRH分子的血浆培养从对照组的猪体内收集混合猪血清并在-80℃下保存。通过肽合成制备化学合成的HV-GHRH。融化该猪血清并进行离心，置于37℃下并进行平衡。将GHRH突变体在100μg/ml的浓度下溶于血清样品。加入GHRH突变体之后立即以及在15、30、60、120和240分钟后取出1ml血浆并以1ml 1M的TFA进行酸化。在C18亲和SEP-Pak柱上对酸化的血浆进行纯化，将其冻干并以HPLC进行分析，这些过程使用Walters600多系统传递系统、Walters智能样品加工仪717型以及Walters分光检测仪490(Walters Associates，Millipore Corp.，Milford，MA)。检测在214nm下进行。通过峰面积积分测量肽在这些时间点的降解百分比。
测定猪血浆中的野生型GHRH和类似物GHRH-HV的稳定性，该测定通过对GHRH肽进行培养，随后进行固相抽提以及HPLC分析而进行。如图1C中所示，在血浆中培养60分钟后95％的野生型GHRH(1-44)NH2被降解。与之相比，对猪血清中GHRH的培养表明，至少75％的多肽在培养的4-6小时期间被保护不受酶的切割。由此，在相同的条件下，大部分的GHRH-HV保持完整，而野生型GHRH完全被降解，这表明GHRH-HV对血清蛋白酶的稳定性有显著的提高(图1C)。
实施例6动物研究三组阉猪被用于GHRH研究，每组包括5只3-4周大的杂种阉猪(Yorkshire，Landrace，Hampshire and Duroc)。这些动物被单独关养，可自由喝水并饲以其体重6％的食物(24％蛋白猪饲料，Producers Cooperative Association，Bryan，TX)。每隔一天在8:30AM对动物们称重，随后加入饲料。动物们的豢养根据NIH Guide，USDA和Animal Welfare Act指导原则进行。
实施例7质粒DNA在猪体内的肌内注射在PBS(pH7.4)中，将pSPc5-12-HV-GHRH、pSPc5-12-wt-GHRH和pSPc5-12bgal的不含内毒素的质粒制备物稀释至1mg/ml。这些动物等同地被安排了这些处理的其中一种。以异氟烷对这些猪进行麻醉(以浓度2-6％进行诱导并且以浓度1-3％进行维持)。通过外科程序植入颈部导管以在注射后的第3、7、14、21、28、45和65天从动物体内采血。当麻醉时，将10mg的质粒直接注射入猪的半肌腱。注射2分钟后，将被注射肌肉至于卡钳之间并进行电穿孔，电穿孔使用的最佳条件为200V/cm，4次60毫秒的脉冲(Aihara et al.，1998)。注射65天后，处死动物并且收集内部器官和被注射的肌肉，对之称重，在液氮中冷冻并保存于-80℃。尸体经称重和中子激活分析。测定其背部脂肪(back fat)。
实施例8pSPc-HV-GHRH的肌肉注射增加了猪的GHRH；两个月后的GH和IGF-I血清水平对最佳的蛋白酶抗性pSPc-HV-GHRH载体促进GHRH长期表达和刺激GH和IGF-I分泌水平的能力进行了测定。图2A所示为pSPc-HV-GHRH、作为野生型参照的野生型结构体pSP-wt-GHRH以及作为安慰剂参照组合成肌源启动子大肠杆菌β-牛乳糖苷酶表达载体pSP-bgal的简要图谱。对3周大的公阉猪进行麻醉，插入颈静脉导管以在不对动物造成不适的情况下采集血样。将质粒表达载体DNA(10mg的pGHRH-HV；pSP-GHRH；或者pSP-bgal的DNA)直接注射入半肌腱，随后对其进行电穿孔(见实施例7)。
实施例9猪GHRH、GH和IGF-I测定通过异源人类分析系统对猪的GHRH进行了测量(Peninsula实验室，Belmont，CA)。该分析的敏感度为1pg/管。以特异的双抗体程序RIA对血浆中的猪GH进行了测定(宾夕法尼亚州立大学)。该分析的敏感度为4pg/管。通过异源人类分析系统对猪的IGF-1进行了测量(诊断系统实验室，Webster，TX)。使用微软的Excel统计分析包对数据进行了分析。图中所示值为平均值±s.e.m.。具体的p值通过使用Students t test进行比较而获得。p＜0.05被设定为具有统计学意义的水平。在以pSP-GHRH-HV进行了半肌腱注射的猪体内，GHRH水平在注射后7天有所增加(图2B)，在14天比参照组水平高出150％(652.4±77pg/ml比419.6±13pg/ml)。60天后pSP-GHRH-HV表达活性达到稳定，该水平约比注射安慰剂的参照值高出2-3倍。，经过pSP-GHRH-HV注射的猪分泌的血清GHRH绝对值比经安慰剂注射的参照值高出3倍(1426.49±10.47ng比266.84±25.45ng)(图2C)，这些值根据第0天到第60天的体重增加而进行过校正(血液体积占总体重的8％)。经过野生型pSP-GHRH注射的动物在进行注射后45天，其GHRH水平仅开始表现出适度的增加，但在注射后60天增加了2倍(779.36ng)，该水平足以产生生物学效果，其中所述的注射在半肌腱中进行。
幼体动物具有很高水平的GH，该水平随着年龄而逐渐降低。在注射后第7和第14天，血样在24小时期间每15分钟采集一次，对其进行pGH水平分析，通过该水平推测pGH含量的总体变化。经过pGHRH-HV注射的猪(图2D)在注射后第7天(g变分HV＝+1.52，wt＝-0.73，比参照＝-3.2ng/ml)以及第14天(g变分HV＝+1.09，wt＝-4.42，比参照＝-6.88ng/ml)表现出GH含量明显的提高。
GH系统水平提高的另一个迹象为IGF-I水平的提高。经过pSP-GHRH-HV注射的猪血清IGF-I水平在注射后3天开始提高(图2E)。在第21天，这些动物的血清IGF-I水平平均提高了3倍，这一水平可维持60天以上(p＜0.03)。与之相比，经野生型pSP-GHRH表达载体注射的猪在其循环IGF-1的水平上仅有40％的提高(p＝0.39)，如图2E所示。
实施例10增强猪生长的肌源GHRH表达载体在以肌源pSP-GHRH表达载体进行肌内注射后而被分泌入系统循环的猪GH在阉割的幼体公猪中增加了超过65天的生长。还在体内进行了躯体组成的测定，该测定在注射后30和65天(光密度测定法，K40)或者在死后(器官，尸体、脂肪，直接解剖并随后进行中子激活)进行。经野生型pSP-GHRH注射的动物比经安慰剂注射的参照组平均重21.5％(37.125kg比29.375kg)，而经pSP-GHRH-HV注射的猪比参照组平均重37.8％(41.775kg，p＝0.014)，如图3A所示。与参照组相比，经GHRH结构体注射的猪的饲养效率也提高了20％(在pSP-GHRH-HV组，相对于每kg体重的增长为0.267kg食物/日，在pSP-wt-GHRH组中该值为0.274kg，对比在经pSP-bgal注射的猪中该值为0.334kg(图3B))。通过光密度测定、K40钾室(K40 potassiumchamber)和中子激活室(neutron activation chamber)进行的躯体组成研究表明，在经GHRH注射的动物体内所有身体组分均成比例地增加，没有器官巨大、脂肪比例增加或者相关病理的迹象。图3C所示为经安慰剂注射的参照组猪和经pSP-GHRH-HV注射的猪在45天后的照片。
表I所示的经pSP-GHRH-HV注射的猪的代谢特征显示了血清尿素水平的显著减少，pSP-GHRH和pSP-GHRH-HV分别为(参照为9±0.9mg/dl，经注射的猪为8.3±1mg/dl以及6.875±0.5mg/dl)(p＝0.006)，这表明了氨基酸代谢的降低。参照组和经质粒GHRH注射的猪血清葡萄糖水平接近(参照猪为99.2±4.8mg/dl，经pSP-GHRH-HV注射的猪为104.8±6.9mg/dl而经野生型pSP-GHRH注射的动物为97.5±8mg/dl)(p＝0.263)。没有发现其它的代谢变化。
表1经GHRH注射的猪和参照体内的代谢特征(值的单位为mg/ml)葡萄糖 尿素 肌酸酐 总蛋白参照 99.2±4.8 9±0.9 0.82±0.06 4.6±0.22pSP-wt-GHRH 97.5±8 8.3±1 0.83±0.056 4.76±0.35pSP-HV-GHRH 104.8±6.9 6.875±0.5 0.78±0.04 4.88±0.23实施例11以不同水平的pSP-HV-GHRH进行的实验为进一步研究pSP-HV-GHRH对于小猪生长的影响，以pSP-HV-GHRH对出生后10天的几组小猪进行了注射(3mg，1mg，100μg)，每组由2只组成。如图4所示，以100μg的质粒进行注射的组给出了最佳的生长曲线，该组在50日龄后同参照组具有显著的统计差异。以3mg质粒进行注射的组中的一只动物产生了抗体并且表现明显降低的生长模式。
同样，以所示的剂量的pSP-HV-GHRH对出生后10天的几组小猪进行了注射，每组由2只组成。IGF-I值在注射后10天开始提高，并且在注射后35天经100μg质粒注射的猪的IGF比参照组平均高出10.62倍。以1mg进行注射的猪平均超出参照组7.94倍，以3mg进行注射的猪平均比参照值高出1.16倍。
由此，在一个具体的实施方案中，较低剂量的pSP-HV-GHRH被用于注射。在一个具体的实施方案中使用了100μg(.1mg)的该质粒。在另一个具体的实施方案中，约200-300μg被用于注射。
实施例12以pSP-HV-GHRH进行的年龄比较为最优化用于进行pSP-HV-GHRH注射的小猪的年龄，以2mg的pSP-HV-GHRH对几组小猪进行了注射，每组由2只组成。如图6所示，在出生后14天接受注射的组给出了最佳的生长曲线，该组与参照组相比在各时间点均有明显的统计学差异。出生后21天进行注射的组产生了抗体并且表现明显降低的生长模式。如果治疗的过早(即，＜约10-14日龄)有可能会有胰岛素抗性。在一个具体的实施方案中，该治疗在天然GH和IGF-I水平最低时最为有效(约10-14天大)，而在GHRH水平正常时其产生可能被抵消。
实施例13简述简而言之，注射的最佳时间点为出生后14天(在注射后40天比参照组平均重8磅(p＜0.04))。用于注射的优选剂量为2-5ml体积中100μg质粒(在注射后40天比参照组平均重6磅(p＜0.02))。母猪1(时间过程)和母猪3(剂量曲线)的后代的激素和生化常数正常(IGF-I、IGF-BP3、胰岛素、尿素、葡萄糖、总蛋白、肌酸酐)并且与体重的增加相关，无不良副作用。来自前几个实验的躯体组成研究表明，HV-GHRH决定了所有躯体组成的统一增加(躯体组成类似于参照组，但是更大)，而野生型GHRH决定了瘦肉的增加以及脂肪的减少。
在说明中提及的所有专利和出版物对于本领域的技术人员的水平是很明了的。所有的专利和出版物在此引为参考，如同各出版物个体被特别和单独地表明被引为参考一样。
引用的参考文献美国专利文件美国专利No.5,847,066，发表于1998年12月8日，Coy et al.被列为发明者。
美国专利No.5,846,936，发表于1998年12月8日，Felix et al.被列为发明者。
美国专利No.5,792,747，发表于1998年8月11日，Schally et al.被列为发明者。
美国专利No.5,776,901，发表于1998年7月7日，Bowers et al.被列为发明者。
美国专利No.5,756,264，发表于1998年5月26日，Schwartz et al.被列为发明者。
美国专利No.5,696,089，发表于1997年12月9日，Felix et al.被列为发明者。
美国专利No.5,486,505，发表于1996年1月23日，Bowers et al.被列为发明者。
美国专利No.5,137,872，发表于1992年8月11日，Seely et al.被列为发明者。
美国专利No.5,084,442，发表于1992年1月28日，Felix et al.被列为发明者。
美国专利No.5,036,045，发表于1991年7月30日，Thorner et al.被列为发明者。
美国专利No.5,023,322，发表于1991年6月11日，Kovacs et al.被列为发明者。
美国专利No.4,839,344，发表于1989年6月13日，Bowers et al.被列为发明者。
美国专利No.4,410,512，发表于1983年10月18日，Bowers et al.被列为发明者。
美国专利No.RE33,699，发表于1991年9月24日，Drengler被列为发明者。
美国专利No.4,833,166，发表于1989年5月23日，Grosvenor et al.被列为发明者。
美国专利No.4,228,158，发表于1980年10月14日，Momany et al.被列为发明者。
美国专利No.4,228,156，发表于1980年10月14日，Momany et al.被列为发明者。
美国专利No.4,226,857，发表于1980年10月7日，Momany et al.被列为发明者。
美国专利No.4,224,316，发表于1980年9月23日，Momany et al.被列为发明者。
美国专利No.4,223,021，发表于1980年9月16日，Momany et al.被列为发明者。
美国专利No.4,223,020，发表于1980年9月16日，Momany et al.被列为发明者。
美国专利No.4,223,019，发表于1980年9月16日，Momany et al.被列为发明者。
出版物Aihara，H.& Miyazaki，J.Nat.Biotechnol.16，867-87C(1998).Albanese，A.and R.Stanhope.1997.GH治疗诱导了患有子宫内生长障碍的幼儿的Catch-up维持生长7年的结果(GH treatment inducessustained catch-up growth in children with intrauterine growthretardation7-year results.)Horm.Res.48173-177.Allen，D.B.，A.C.Rundle，D.A.Graves，and S.L.Blethen.1997.用人生长激素治疗儿童白血病的危险回顾与再分析(Risk of leukemia inchildren treated with human growth hormonereview andreanalysis.)J.Pediatr.131832-S36Azcona，C.，A.Albanese，P.Bareille，and R.Stanhope.1998.在患有子宫内生长障碍/R-S综合征的生长激素充足和不足的幼儿体内的生长激素治疗。(Growth hormone treatment in growthhormone-sufficient and -insufficient children withintrauterine growth retardation/Rnssell-Silver syndrome.)Horm.Res.5022-27.
Bartke，A.1998.Growth hormone and aging.Endocrine 8103-108.
Benfield，M.R.and E.C.Kohaut.1997.生长激素在经肾移植的幼儿中是安全的(Growth hormone is safe in children after renaltransplantation.)J.Pediatr.131S28-S31Bercu，B.B.，R.F.Walker.1997.在生长情况不同的幼儿体内的生长激素促分泌物(Growth hormone secretagogues in children withaltered growth.)Acta Paediatrica 86102-106.
Bergsma，D.J.，Grichnik，J.M.，Gossett，L.M.& Schwartz，R.J.Mol.Cell.Biol.6，2462-2475(1986).
Blethen，S.L.and A.C.Rundle.1996.用生长激素治疗幼儿滑动的重要大腿松果体(Slipped capital femoral epiphysis in childrentreated with growth hormone.A summary of the NationalCooperative Growth Study experience.)Horm.Res.46113-116.
Campbell，R.M.，Y.Lee，J.Rivier，E.P.Heimer，A.M.Felix，andT.F.Mowles.1991.GRF类似物和片段受体结合、活性和结构之间的相关性。
(GRF analogs and fragmentscorrelation between receptor binding，activity and structure.)Peptides 12569-574.
Corpas，E.，S.M.Harman，and M.R.Blackman.1993.人类生长激素和人类成熟衰老(Human growth hormone and human aging.)Endocrine Reviews 1420-39.
Corpas，E.，S.M.Harman，M.A.Pineyro，R.Roberson，and M.R.Blackman.1993.生长激素(GH)释放激素1-14的连续14天皮下滴注在老年人体内增加了GH和胰岛素样生长因子-I水平。(Continuous subcutaneous infusions of growth hormone(GH)releasing hormone 1-44 for14 days increase GH and insulin-like growth factor-I levels in old men.)Journal ofClinical Endocrinology & Metabolism 76134-138.
Davis，H.L.，Whalen，R.G.& Demeneix，B.A.Hum.Gene Ther.4，151-159(1993).
D′Costa，A.P.，R.L.Ingram，J.E.Lenham，and W.E.Sonntag.1993.在正常成熟衰老过程中的生长激素和胰岛素样生长因子1的调节和作用机制。(The regulation andmechanisms of action of growth hormone and insulin-like growth factor 1 during normal aging.)J.Reprod.Fert.-Supp.4687-98.
Draghia-Akli，R.，Li，X.G.，Schwartz，R.J.，et al.Nat.Biotechnol.15，1285-1289(1997).Eicher，E.M.and W.G.Beamer.1976.小鼠遗传的发育不全矮小症。染色体6上很少突变的特性。(Inherited ateliotic dwarfism in mice.Characteristics of the mutation，little，on chromosome 6.)J.Hered.6787-91.
Erling，A.1999.幼儿的健康相关生命质量的评估方法学考虑(Methodological considerations in the assessment of health-related quality of life inchildren.)Acta Paediatrica Scandin.-Supp.428106-107.0803-5326.
Esch，F.S.，P.Bohlen，N.C.Ling，P.E.Brazeau，W.B.Wehrenberg，M.O.Thorner，M.J.Cronin，and R.Guillemin.1982.来自人类胰腺肿瘤的具有生长激素释放活性的40残基肽的性质鉴定。(Characterization of a 40 residue peptide from a humanpancreatic tumor with growth hormone releasing activity.)Biochemical & BiophysicalResearch Communications 109152-158.
Frohman，M.A.，T.R.Downs，P.Chomczynski，and L.A.Frohman.1989.小鼠生长激素释放激素(GRH)的互补DNA的克隆和鉴定生长激素缺乏的lit/lit小鼠体内的提高的GRH信使RNA水平(Cloning and characterization ofmouse growth hormone-releasing hormone(GRH)complementary DNAincreased GRH messenger RNA levels in the growth hormone-deficient lit/lit mouse.)Mol.Endocrinol.31529-1536.
Frohman，L.A.，J.L.Thominet，C.B.Webb，M.L.Vance.，H.Uderman，J.Rivier，W.Vale，and M.O.Thomer.1984.男性体内的人类胰腺肿瘤生长激素释放因子的代谢清除和血浆内的消失(Metabolicclearance and plasma disappearance rates of human pancreatictumor growth hormone releasing factor in man.)J.Clin.Invest.731304-1311.
Gesundheit，N.and J.K.Alexander.1995.以重组激素和生长因子进行的内分泌治疗(Endocrine Therapy with Recombinant Hormonesand Growth Factors.)In Molecular EndocrinologyBasic Conceptsand Clinical Correlations.B.D.Weintraub，editor.RavenPress，Ltd，，New York.491-507.
Heptulla，R.A.，S.D.Boulware，S.Caprio，D.Silver，R.S.Sherwin，and W.V.Tamborlane.1997.在具有矮小身材的儿童进行激素治疗后的胰岛素敏感度的降低和代偿性的胰岛素过量(Decreasedinsulin sensitivity and compensatory hyperinsulinemia afterhormone treatment in children with short stature.)J.Clin.Endocrinol.Metab.823234-3238.
Iranmanesh，A.，G.Lizarralde，and J.D.Veldhuis.1991.年龄和相对的多脂肪为生长激素分泌爆发频率和幅度以及健康人的内源GH半衰期的负因子(Age and relative adiposity are specific negativedeterminants of the frequency and amplitude of growth hormone(GH)secretory bursts and the half-life of endogenous GH inhealthy men.)Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism731081-1088.
Jacobs，P.A.，P.R.Betts，A.E.Cockwell，J.A.Crolla，M，J.Mackenzie，D.O.Robinson，and S.A.Youings.1990.一系列患有特纳综合症的患者的细胞遗传和分子再评测(A cytogenetic andmolecular reappraisal of a series of patients with Turner′ssyndrome.)Ann.Hum.Genet.54209-223.
Jaffe，H.A.，C.Danel，G.Longenecker，M.Metzger，Y.Setoguchi，M.A.Rosenfeld，T.W.Gant，S.S.Thorgeirsson，L.D.Stratford-Perricaudet，M.Perricaudet，A.Pavirani，J.-P.Lecocq and R.G.Crystal.1992.腺病毒介导的体内基因转移和在正常大鼠肝脏中的表达(Adenovirus-mediated in vivo gene transferand expression in normal rat liver.)Nat Genet 1(5)372-8.
Key，L.L.J.and A.J.Gross.1996.患有软骨发育不全的儿童的对生长激素的反应。(Response to growth hormone in children withchondrodysplasia.)J.Pediatr.128S14-S17Kubiak，T.M.，C.R.Kelly，and L.F.Krabill.1989.牛和猪血清中的一种牛生长激素释放因子类似物Leu27-bGRF(1-29)NH2的体内代谢降解。同血浆二肽酰肽酶活性的相关性。(In vitro metabolicdegradation of a bevine growth hormone-releasing factor analogLeu27-bGRF(1-29)NH2 in bovine and porcine plasma.Correlationwith plasma dipeptidylpeptidase activity.)Drug Metabolism &Disposition 17393-397.
Li，X.，Eastman，E.M.，Schwartz，R.J.，& Draghia-Akli，R.Nat.Biotechnol.17.3，241-245(1999).
Martin，R.A.，D.L.Cleary，D.M.Guido，H.A.Zurcher-Neely，andT.M.Kubiak.1993.
来自猪肾的二肽酰肽酶IV(DPP-IV)切割在2位上经Scr，Thr或Val修饰的牛生长激素释放因子(bGRF)的类似物。是否为DPP-IV的扩展的底物特异性。(Dipeptidyl peptidase IV(DPP-IV)from pig kidneycleaves analogs of bovine growth hormone-releasing factor(bGRF)modified at position 2 with Ser，Thr or Val.Extended DPP-IVsubstrate specificity？)Biochimica et Biophysica Acta1164252-260.
Monti，L.D.，P.Brambilla，A.Caumo，F.Magni，S.Omati，G.Nizzoli，B.di Natale，M.Galli-Kienle，C.Cobelli，G.Chiumello，and G.Pozza.1997.在患有特纳综合症的女孩中进行生长激素治疗后的葡萄糖运转和胰岛素清除(Glucose turnover and insulin clearanceafter growth hormone treatment in girls with Turner′ssyndrome.)Metabolism 461482-1488.
Muramatsu，T.，Nakamura，A.& Park，H.M.Int.J.Mol.Med.1，55-62(1998).
Parks，J.S.，R.W.Pfaffle，M.R.Brown，H.Abdul-Latif，and L.R.Meacham.1995.
生长激素缺陷(Growth Hormone Deficiency.)In MolecularEndocrinologyBasic Concepts and Clinical Correlations.B.D.Weintraub，editor.Raven Press，Ltd.，New York.473-490.
Rosenbaum，P.L.and S.Saigal.1996.对儿童的健康相关生命质量的测量概念性问题(Measuring health-related quality of life inpediatric populationsconceptual issues.)In Quality of lifeand pharmacoeconomics in clinical trials.B.Spilker，editor.Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia.
Rosenfeld，M.A.，K Yoshimura，L.E.Stier，B.C.Trapnell，L.D.Stratford-Perricaudet，M.Perricaudet，W.Dalemans，S.Jallat，A.Mercenier，A.Pavirani，J.P.Lecocq，W.B.Guggino，R.G.Crystal.1991.人类囊性纤维化基因向呼吸道上皮组织的体内转移(Invivo transfer of the human cystic fibrosis gene to therespiratory epithelium.)Clinical Research 39(2)，311A.
Rosenfeld，M.A.，W Siegfried，K Yoshimura，K Yoneyama，MFukayama，LE Stier，PK Paakko，P Gilardi，LD Stratford-Perricaudet，M Perricaudet，S.Jallat，A.Pavirani，J.P.Lecocq；and R.G.Crystal.1991.重组外抗胰蛋白酶基因向肺上皮组织的腺病毒介导的体内转移(Adenovirus-mediated transfer of a recombinantalpha 1-antitryps in gene to the lung epithelium in vivo.)Science252(5004)431-4.
Savage，M.O.，R.M.Beattie，C.Camacho-Hubner，J.A.Walker-Smith，and I.R.Sanderson.1999.克罗恩氏病中的生长(Growth inCrohn′s disease.)Acta Paediatrica Scandin-Supp，42889-92.
Scanlon，M.F.，B.G.Issa，and C.Dieguez.1996.生长激素分泌的调节(Regulation of Growth Hormone Secretion.)HormoneResearch 46149-154.
Shalet，S.M.，B.M.Brennan，and R.E.Reddingius.1997.生长激素治疗和恶性肿瘤(Growth hormone therapy and malignancy.)Horm.Res.48 Suppl 429-3229-32.
Skuse，D.H.，K.Elgar，and E.Morris.1999.特纳综合症的生命质量涉及到染色体组成遗传学咨询和操控的伏笔(Quality of life inTurner syndrome is related to chromosomal constitutionimplication for genetic counseling and management.)ActaPaediatrica Scandin.-Supp.428110-113.
Sohmiya，M.，K.Ishikawa，and Y.Kato.1998.在患有慢性肾性能不全的贫血患者中，持续用重组人GH皮下滴注可刺激促以细胞生成素的分泌(Stimulation of erythropoietin secretion by continuoussubcutaneous infusion of recombinant human GH in anemic patientswith chronic renal failure.)Eur.J.Endocrinol.138302-306.
Su，C.M.，L.R.Jensen，E.P.Heimer，A.M.Felix，Y.C.Pan，andT.F.Mowles.1991.猪血清中的生长激素释放因子(GRF)类似物的体外稳定性(In vitro stability of growth hormone releasing factor(GRF)analogs in porcine plasma.)Hormone & Metabolic Research2315-21.
Tanaka，H.，T.Kubo，T.Yamate，T.Ono，S.Kanzaki，and Y.Seino.1998.生长激素治疗对患有软骨发育不全的儿童的影响生长模式，下丘脑垂体功能和基因型(Effect of growth hormone therapy inchildren with achondroplasiagrowth pattern，hypothalamic-pituitary function，and genotype.)Eur.J.Endocrinol.138275-280.
Tanner，J.W.，Davis，S.K.，McArthur，N.H.，French，J.T.& Welsh，T.H.，Jr.J.Endocrinol.125，109-115(1990).
Thorner，M.O.，L.A.Frohman，D.A.Leong，J.Thominet，T.Downs，P.Hellmann，J.Chitwood，J.M.Vaughan，and W.Vale.1984.外下丘脑生长激素释放因子(GRF)分泌是肢端肥大症的一个罕见病因177名患者中的血浆GRF水平(Extrahypothalamic growth-hormone-releasing factor(GRF)secretion is a rare cause of acromegalyplasma GRF levels in 177 acromegalic patients.)Journal ofClinical Endocrinology & Metabolism 59846-849.Tripathy，S.K.，Svensson，E.C.，Black，H.B.，etal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，10876-10880(1996).
Walter，R.，W.H.Simmons，and T.Yoshimoto.1980.脯氨酸特异的内肽酶和外肽酶(Proline specific endo-and exopeptidases.)Mol.Cell Biochem.30111-127.
Watkins，S.L.1996.摄入生长激素的患者中的骨骼疫病(Bone diseasein patients receiving growth hormone.)Kidney Int.Suppl.53S126-7S126-S127本领域的技术人员应很容易地赞同本专利发明很适合于达成目标并获得所提及的本文的内在目的和利益。本文所述的生长激素、生长激素释放激素、类似物、质粒、载体、药物组合物、治疗、方法、程序以及工艺在此代表了优选的实施方案，它们意在示例而非对范围进行限定。本领域的技术人员应能想到对本文的变化和其它应用，这些变化或者应用包含于本发明的精神之内或者由附上的权利要求所定义。
序列表SEQUENCE LISTING<110>Schwartz，RobertDraghia-Akli，Ruxandra<120>超活性的猪生长激素释放激素类似物<130>P01857CN0/09902845<140>PCT/US00/20127<141>2000-07-24<150>US 60/145,624<151>1999-07-26<160>13<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>40<212>PRT
<213>激素<220>
<221>激素<222>(1)..(40)<223>合成的<400>1His Val Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gln1 5 10 15Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Leu Asn Arg Gln Gln Gly20 25 30Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala35 40<210>2<211>48<212>DNA<213>引物<220>
<221>引物<222>(1)..(48)<223>合成的
<400>2aggcagcagg gagagaggaa ccaagagcaa ggagcataat gactgcag 48<210>3<211>42<212>DNA<213>引物<220>
<221>引物<222>(1)..(42)<223>合成的<400>3accctcagga tgcggcggca cgtagatgcc atcttcacca ac42<210>4<211>27<212>DNA<213>引物<220>
<221>引物<222>(1)..(27)<223>合成的<400>4cggaaggtgc tggcccagct gtccgcc 27<210>5<211>37<212>DNA<213>引物<220>
<221>引物<222>(1)..(37)<223>合成的<400>5ctgctcccag gacatcctga acaggcagca gggagag 37<210>6<211>358<212>DNA
<213>启动子<220>
<221>启动子<222>(1)..(358)<223>合成的<400>6gagctccacc gcggtggcgg ccgtccgcct tcggcaccat cctcacgaca cccaaatatg60gcgacgggtg aggaatggtg gggagttatt tttagagcgg tgaggaaggt gggcaggcag120caggtgttgg cgctttaaaa ataactcccg ggagttattt ttagagcgga ggaatggtgg180acacccaaat atggcgacgg ttcctcaccc gtcgccatat ttgggtgtcc gccctcggcc240ggggccgcat tcctgggggc cgggcggtgc tcccgcccgc ctcgataaaa ggctccgggg300ccggcggcgg cccacgagct acccggagga gcgggaggcg ccaagctcta gaactagt 358<210>7<211>649<212>DNA<213>3’UTR<220>
<221>3’UTR
<222>(1)..(649)<223>Homo sapiens<400>7atcggggtgg catccctgtg acccctcccc agtgcctctc ctggccctgg aagttgccac60tccagtgccc accagccttg tcctaataaa attaagttgc atcattttgt ctgactaggt120gtccttctat aatattatgg ggtggagggg ggtggtatgg agcaaggggc aagttgggaa180gacaacctgt agggcctgcg gggtctattg ggaaccaagc tggagtgcag tggcacaatc240ttggctcact gcaatctccg cctcctgggt tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccga300gttgttggga ttccaggcat gcatgaccag gctcagctaa tttttgtttt tttggtagag360acggggtttc accatattgg ccaggctggt ctccaactcc taatctcagg tgatctaccc420accttggcct cccaaattgc tgggattaca ggcgtgaacc actgctccct tccctgtcct480tctgatttta aaataactat accagcagga ggacgtccag acacagcata ggctacctgc540catggcccaa ccggtgggac atttgagttg cttgcttggc actgtcctct catgcgttgg600gtccactcag tagatgcctg ttgaattcaa gcttatcgat accgtcgac649<210>8<211>262<212>DNA<213>激素<220>
<221>激素<222>(1)..(262)<223>Homo Sapiens<400>8atggtgctct gggtgttctt ctttgtgatc ctcaccctca gcaacagctc ccactgctcc60ccacctcccc ctttgaccct caggatgcgg cggtatgcag atgccatctt caccaacagc120taccggaagg tgctgggcca gctgtccgcc cgcaagctgc tccaggacat catgagcagg180cagcagggag agagcaacca agagcgagga gcgaggagca agggcacggc tttaatgact240gcaggaattc gatatcaagc tt 262<210>9<211>632<212>DNA<213>激素<220>
<221>激素<222>(1)..(632)<223>Mus肌
<400>9acccttatct ttccatcatt tctttttcta acagcaaaga tcacaatgac agaagtgaat60gatcagaatg taaaaatatt tgtgcaaaat tgcattaact gttctcacca tctaatcggg120gtacaacctc aaacacaacg gccataatga agaaaagcta cactggaagt tctagatgtc180atctggctcc cacaacatca cagagtccca cccaggagtg aaggatgctg ctctgggtgc240tctttgtgat cctcatcctc accagtggct cccactgctc actgcccccc tcacctccct300tcaggatgca gcgacacgta gatgccatct tcaccaccaa ctacaggaaa ctcctgagcc360agctgtatgc ccggaaagtg atccaggaca tcatgaacaa gcaaggggag aggatccagg420aacaaagggc caggctcagc cgccaggaag acagcatgtg gacagaggac aagcagatga480ccctggagag catcttgcag ggattcccaa ggatgaagcc ttcagcggac gcttgagccc540cccgagcccc aaacacaact gtaccctgtt acttctgctt cagctctgac cttttccgtc600ctctgtaaat acaataaaac ccccattctc at 632<210>10<211>391<212>DNA<213>激素<220>
<221>激素<222>(1)..(391)<223>Bos taurus
<400>10ctcaccctca gcagcggctc ccacggttcc ctgccttccc agcctctcag gtaagcagtt60ctgagaagag aagcaagaga ggccctttga ggatgcagac tcgagctggt ccccagctgg120gtcctcaggc agcctccctt gctcatctct gggagggtgg cagactgagc cccagagagg180tcaccaccca gccctggttc cagccctctc tggggacgag cagggcaaga ggcgacagaa240agacctcaca gagaccaagt gagcacagtc ccctgggcct cccaccccac cctttgacct300ctgactcctt ctactaggat tccacggtac gcagatgcca tcttcactaa cagctaccgg360aaggttctgg gccagctgtc tgcccgcaac t 391<210>11<211>392<212>DNA<213>激素<220>
<221>激素<222>(1)..(392)<223>Bos taurus<400>11ctcaccctca gcagcggctc ccacgggttc cctgccttcc caagcctctc aggtaagcag60ttctgagaag agaagcaaga gaggcccttt gaggatgcga ctcgagctgg tccccagctg120
ggtcctcagg cagcctccct tgctcatctc tgggagggtg gcagactgag ccccagagag180gtcaccaccc agccctggtt ccagccctct ctggggacga gcagggcaag aggcgacaga240aagacctcac agagaccaag tgagcacagt cccctgggcc tcccacccca ccctttgacc300tctgactcct tctactagga ttccacggta cgcagatgcc atcttcacta acagctaccg360gaaggttctg ggccagctgt ctgcccgcaa ct 392<210>12<211>88<212>DNA<213>激素<220>
<221>激素<222>(1)..(88)<223>Equus caballus<400>12atgcagatgc catcttcacc aacaactacc ggaaggtgct gggccagctc tctgcccgca60agatcctcca ggacatcatg agcaggca 88<210>13<211>511
<212>DNA<213>激素<220>
<221>激素<222>(1)..(511)<223>Rattus norvegicus<400>13ctgcggatgc cacggaacat cgagccaaat cccaggaaca cgctctgaac cccaggagct60gcacaccact ctattaggtc ccgcccagga gtgaaggatg ccactctggg tgttctttgt120gctcctcacc ctcaccagtg gctcccactg ctcactgccc ccctcacctc ccttcagggt180gcggcggcat gcagacgcca tcttcaccag cagctaccgg agaatcctgg gccaattata240tgcccgcaaa ctgctgcacg aaatcatgaa caggcagcaa ggggagagga accaggaaca300aagatccagg ttcaaccgcc atttggacag agtgtgggca gaggacaagc agatggccct360ggagagcatc ttgcagggat tcccaaggat gaagctttca gcggaggctt gagccctcgg420cccccaaaca tagctggacc ctgttacttc tacttcagtt ctgatcttct ccttcctctg480tgaatacaat aaagacccag ttctcatctg c 51权利要求
1.组合物形式的具有SEQ ID NO1氨基酸序列的生长激素释放激素。
2.一种药物组合物，该组合物用于刺激动物体内生长激素的释放，该组合物在一种药学可接受的载体内含有权利要求1的生长激素释放激素。
3.组合物形式的一种核苷酸序列，该序列编码具有SEQ ID NO1氨基酸序列的生长激素释放激素。
4.一种载体，该载体含有一种启动子；一种编码SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及一种3’非翻译区，它们为功能性的表达而可操作地连接。
5.权利要求4的载体，其所述的载体为一种合成的肌源启动子。
6.权利要求4的载体，其所述的3’非翻译区为hGH的3’非翻译区。
7.增加动物体内生长激素的方法，该方法包括向所述的动物引入一种治疗有效量的权利要求4的载体的步骤。
8.在一种动物体内治疗与生长激素途径相关联的生长激素相关的缺陷疾病的方法，该方法包括向所述动物引入一种治疗有效量的权利要求4载体的步骤。
9.权利要求8的方法，其所述的缺陷疾病为所述动物体内遗传材料的变化的结果。
10.用于改善动物生长表现的方法，该方法包括引入一种治疗有效量的权利要求4载体的步骤。
11.提高动物效率的方法，该方法包括引入一种治疗有效量的权利要求4载体的步骤。
12.治疗动物消瘦症状的方法，其所述的消瘦症状同烧伤、外伤、AIDS或者其它消耗性疾病相关联，该方法包括引入一种治疗有效量的权利要求4载体的步骤。
13.增强动物生长的方法，该方法包括引入一种治疗有效量的权利要求4载体的步骤。
14.治疗与生长激素途径相关联的生长激素相关的缺陷疾病的方法，该方法包括引入一种治疗有效量的权利要求4载体的步骤。
15.权利要求7、8、9、10、11、12、13或者14的方法，其中该动物选自人类、宠物动物、食用动物以及劳作动物。
16.权利要求7、8、9、10、11、12、13或者14的方法，其中所述的载体被引入到一种肌源细胞中。
17.权利要求7、8、9、10、11、12、13或者14的方法，其中所述载体被引入到所述动物的肌肉组织中。
18.权利要求7、8、9、10、11、12、13或者14的方法，其中所述的载体被在单次给药中引入到所述动物中。
19.权利要求4的载体，其所述的载体选自质粒、病毒载体、脂质体以及阳离子脂类。
20.一种治疗动物中与生长激素途径相关联的生长激素相关的缺陷疾病的方法，该方法包括向动物体内引入一种治疗有效量的载体的步骤，所述的载体含有一种合成的肌源启动子；编码SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及hGH的3’非翻译区，它们为功能性的表达而可操作地连接。
21.一种方法，该方法可在动物体内刺激生长激素在高于于正常生长相关的水平上产生，所述的方法包括向所述动物体内引入一种治疗有效量的的载体的步骤，所述的载体含有一种合成的肌源启动子；编码SEQ ID NO1的核苷酸序列；以及hGH的3’非翻译区，它们为功能性的表达而可操作地连接。
全文摘要
由生长激素(GR)，生长激素释放激素(GHRH)缺乏所导致的不充分生长，或遗传疾病可通过利用新GHRH类似物的重组蛋白疗法加以改善，其中的GHRH类似物具有(SEQ ID NO1的)序列。还包括(1)一种治疗与生长激素途径有关的生长激素相关缺陷疾病的方法；(2)一种治疗与遗传疾病有关的生长激素相关缺陷疾病的方法；(3)一种改善动物生长表现的方法；(4)一种治疗具有生长缺陷疾病的动物的方法；(5)一种增加用于食用的动物效率的方法；和(6)一种提高动物生长的方法。
文档编号A61K48/00GK1635898SQ00813372
公开日2005年7月6日 申请日期2000年7月24日 优先权日1999年7月26日
发明者R·J·施瓦茨, R·德拉希尔－阿克利 申请人:贝勒医学院