神经障碍治疗剂的制作方法

专利名称：神经障碍治疗剂的制作方法
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本发明涉及神经变性疾病的治疗剂，呈现痴呆症状的变性疾病的治疗剂，特别是阿尔茨海默病的治疗剂。更详细地说，本发明涉及具有较高学习记忆障碍改善作用，且毒性、降血压等副作用少，可用于临床的神经变性疾病的治疗剂，呈现痴呆症状的变性疾病的治疗剂，特别是阿尔茨海默病的治疗剂。
在这些神经变性疾病的治疗中，由于病因不明，所以难以采取针对病因的治疗，目前仍处于不得不依赖对症治疗法的状况。
例如，目前认可的治疗阿尔茨海默病的治疗药都是乙酰胆碱神经系统激活药，然而这些药物也是基于阿尔茨海默病患者乙酰胆碱神经系统明显障碍的病理表现而开发出的对症治疗药。实际上，阿尔茨海默型痴呆不仅仅是乙酰胆碱神经系统受到障碍，从这点来考虑，乙酰胆碱神经系统激活药的效果有一定的限度。
近来随着分子水平上的病态研究的进展，已经清楚大多数神经变性疾病的共同点在于，各自特有的异常蛋白在细胞内聚集、蓄积而引起神经障碍/细胞死亡。
例如，在阿尔茨海默病患者的脑中，病状出现的同时可观察到称为老年斑的淀粉状细胞外沉积物，以及以磷酸化的τ蛋白为主要成分的纤维状结构物(神经原纤维变化)。老年斑的主要组成成分是由称为淀粉状β蛋白(Aβ)的40～43个氨基酸残基组成的具有β片层结构的不溶性蛋白。已知该蛋白是称为淀粉状前体蛋白(APP)的膜蛋白在跨膜区域附近切断后生成的。通过遗传性阿尔茨海默病因基因的解析可知，APP基因本身的变异将导致更多Aβ的生成，或是由于其他病因基因早老性蛋白基因的变异而使Aβ的生成量提高。进一步了解到，由生物体提取的、或人工合成的Aβ对神经细胞呈现出毒性。从这些情况考虑，对阿尔茨海默病的发病机制最有力的说法是，所产生的过量Aβ成为不溶的物质，沉积在神经细胞中并产生毒性，进而引起变性。
现已清楚引起神经障碍/细胞死亡的原因在于，除了阿尔茨海默病以外，亨廷顿病、球脊髓肌肉萎缩症、马约病、齿状核赤核淡苍球卢伊小体萎缩症等病中，由于基因内CAG重复单元的延伸而生成的聚谷氨酰胺积累、聚集；克雅氏病等的蛋白粒子病中，正常情况下也存在的蛋白粒子因某些原因而引起其结构改变，生成异常蛋白并积累、聚集。同时现己进一步指出，帕金森氏病、卢伊小体病中，称为α-成束蛋白(α-サイヌクレイン)的蛋白积累、沉淀；肌肉萎缩性侧索硬化症中，变异型的过氧化物岐化酶积累、聚集等也可能是引起神经障碍/细胞死亡的原因。此外也己清楚，在上述物质中，蛋白粒子及α-成束蛋白与Aβ一样具有β片层结构时，才会引起聚集和沉淀。
因此，如果能使动物体内过剩地存在这些引起神经变性疾病的异常蛋白，并做成表现类似于人疾病病态的模型，那么，该模型对开发神经变性疾病的病因治疗法将会很有用。
迄今为止，己尝试过通过转基因鼠技术使动物体内生成过剩的Aβ，或者通过将Aβ直接注入正常动物的脑室内等引起障碍，从而做成阿尔茨海默病的动物模型。例如有文献报道，将微型渗透压泵埋在正常大鼠的背部皮下使β蛋白连续送入脑室内，由此降低了学习记忆能力(Neuroscience Letters，vol.170，pp.63-66，1994)。以上述将β蛋白连续注入脑内的模型作为评价系统，用来评价以病因治疗为目标的阿尔茨海默病治疗剂是最合适的。
另一方面，己知前列腺素(PG)类化合物具有强的血小板凝集抑制作用、血管扩张以及伴随血管扩张的降血压作用、抑制胃酸分泌作用、平滑肌收缩作用、细胞保护作用、利尿作用等多种生理活性。于是，根据这些生理活性，进行了很多将生物体内存在的天然型PG类、或其兴奋剂合成PG衍生物类作为医药品开发的尝试，其中也有真正投入市场的产品。
PG类中，天然的前列环素在生物体中主要是在血管内皮产生的局部激素，利用其强力的生理活性，例如血小板凝集抑制作用、血管扩张作用等，该物质可尝试直接作为医药品供应市场(P.J.lewis，J.O.Grady，Clinical pharmacology of prostaglandin)。但是，天然前列环素的分子内存在容易水解的烯醇醚键，因此在中性或酸性条件下容易失活，而作为医药品使用时，因其化学不稳定性，不是优选的化合物。因此，研究合成了与天然前列环素具有同样的活性、化学稳定性好的合成前列环素衍生物(Synthesis，1984，449，特开昭61-129146)。此外，用次甲基(-CH＝)取代前列环素的6、9位的氧原子，可合成化学稳定性十分优良的9(O)-甲基-Δ6(9α)-前列腺素I1类(异卡巴环素类)的前列环素(特开昭59-210044)，该化合物显示出可与天然前列腺素相媲美的强力的血小板凝集抑制作用、血管扩张性降血压作用等生物活性(特开昭59-210044、特开昭61-197518)。
以前，PG类作为医药品的开发主要是在妇产科、循环器官、或消化器官领域进行。此外，已知也可用作治疗糖尿病的口服剂(特开平2-167227)。但是，在脑神经领域方面，PG类化合物也有可能作为医药品发挥作用。
也就是说，PGD2、PGE1或上述的异卡巴环素衍生物等对处于缺氧状态的动物可呈现出脑保护作用(特开昭60-146826、特开平4-187637、Brain Research，vol.769，pp.321-328，1997)。
此外，关于PGD2、PGE1、PGE2或PGF2α对神经芽肿细胞的突起进展有促进作用(神经化学，vol.24，376，1985；药理和治疗，vol.21，37，1993)，PGI2、PGE2对初代培养神经细胞有保护作用(NeuroscienceLetter，vol.160，106，1993；Brain Research，vol.663，237，1994)，或PGD2、PGJ2等对神经生长因子的生成有促进作用(特开平7-291867)等都己有报道。
但是，这些报告都没有具体描述PG类成为神经变性疾病治疗药的可能性。
不过，在作为脑神经领域方面的医药品开发时，上述的PG类所具有的多种作用则成为产生副作用的原因，为解决这类问题，有必要获得对脑神经系统有特异作用的化合物。还有一个问题是，脑血管系统存在所谓的血脑屏障，并对化合物的透过有所限制，因此为了开发医药品，必须提高PG类的血脑屏障的透过性。
因此，本发明者们用标记的前列环素衍生物([3H]伊落前列素-Schering)对日本猿脑半球的大冠状切片进行了体外放射自显影评价，结果表明，在纹状体、扁桃核、海马、大脑皮质的一部分存在前列环素的结合部位。此外，还发现上述[3H]伊落前列素的结合部位与[3H]PGE2的结合部位不同，并且PGE2与PGE1识别同一个受体。同时，血小板中伊落前列素的结合部位也与PGE1反应，而与PGE2受体完全不同。
由以上的研究过程可知，中枢神经系统中存在新的PGI2受体(Neuroscience，vol.65，pp.493-503，1995)。本发明人中一些成员进一步研究出数种异卡巴环素衍生物，并作为该中枢神经系统存在的新的PGI2受体的特异配体(特开平8-245498、特开平10-87608、特开平10-10610、特开平11-5764、以及Journal of Neurochemistry，vol.72，pp.2583-2592，1999)。这些异卡巴环素衍生物对缺氧状态的培养神经细胞、动物的脑神经细胞呈现出保护作用(EP-911314)。
另一方面，己有报道称将PGE1、PGA1、或上述异卡巴环素类制成脂肪制剂可提高其稳定性(特开昭58-222014、特开昭59-141518、以及特开昭61-289034)，进而还表明，将异卡巴环素衍生物的甲基酯制成脂肪乳剂投入到血中时，可提高该衍生物向脑部的迁移性(J.Pharm.Pharmacol.，vol.48，pp.1016-1022，1996)。
本申请的发明者基于上述课题进行了悉心的研究，其结果是，首先采用将β淀粉状蛋白连续注入脑室内所得的阿尔茨海默病动物模型作为评价系统，发现了中枢神经系统中存在的新的PGI2受体的特异配体，即，特定的异卡巴环素衍生物对β-淀粉状蛋白引起的学习记忆障碍有改善作用，而且，这些化合物对外周循环器官系统几乎无作用，同时它所体现出的作用具有高度的脑特异性，从而完成了本发明。
即，本发明是含有下述式[I]所示的(15R)-异卡巴环素衍生物作为活性成分的神经变性疾病治疗剂， [式中，R1表示C1～C6亚烷基，R2表示氢原子、C1～C7烷基或保护基]含有下述式[III]所示的15-脱氧-异卡巴环素衍生物作为活性成分的神经变性疾病治疗剂， [式中，R1和R2与式[1]的定义相同]上述神经变性疾病是呈现痴呆症状的变性疾病的神经变性疾病治疗剂，以及该大脑变性疾病是阿尔茨海默病的神经变性疾病治疗剂。
实施发明的最佳方式上述式[I]和式[III]中，R1为C1～C6亚烷基，具体例如以-(CH2)n-(n表示1～6的数字)表示的直链状或支链状亚烷基，优选n为1～4，特别优选n为1。上述式[I]和式[III]中，ω链上的甲苯基的甲基取代位置可以是邻位、间位或对位中任意一个位置，但优选为间位。
R2表示氢原子、C1～C7烷基或保护基。作为C1～C7烷基，具体为直链状或支链状烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基等。
R2用作保护基时表示可药用的盐或酯。在此，作为盐的具体例子包括酸加成盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐等无机酸盐类，甲磺酸盐、2-羟基乙磺酸盐、对甲苯磺酸盐等有机磺酸盐，乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、戊二酸盐、己二酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、苯乙醇酸盐等有机羧酸盐类，作为与碱形成的盐，如钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铝盐等与无机碱形成的盐，或甲胺盐、乙胺盐、赖氨酸盐、鸟氨酸盐等与有机碱形成的盐。此外，作为酯，例如C1～C5烷基酯，具体可以是甲基酯、乙基酯等。
作为上述式[I]中优选的化合物，例如下述式[II]所表示的(15R)-16-间甲苯基-17，18，19，20-四去甲异卡巴环素或其甲基酯。 另外，作为上述式[III]中优选化合物，例如下述式[IV]所表示的15-脱氧-16-间甲苯基-17，18，19，20-四去甲异卡巴环素或其甲基酯。 式[I]～[IV]的这些化合物可按照本申请部分发明者己申请的特开平8-245498号或特开平11-5764号所公开的方法制造。
对本发明的神经变性疾病治疗剂的适用对象无特别限制，但该神经变性疾病治疗剂尤其对哺乳类动物有用，其中可优选用于家畜、实验动物、宠物动物、人类。对于治疗对象所患的疾病，只要是因神经变性引起的疾病，则无特别的限制，具体来说，用于阿尔茨海默病、皮克病等呈现痴呆症状的变性疾病时有效，用于阿尔茨海默病时特别有效。
给药的方法无特别限制，优选口服、经皮给药、经鼻给药、静脉内注射、腹腔内给药、直肠内给药或脑室内给药。将本发明的异卡巴环素衍生物或其包合化合物应用于临床时，可将有效成分异卡巴环素衍生物与固体或液体等药用载体组成医药组合物，优选进一步加入稀释剂，即赋形剂、稳定剂等添加剂制成制剂。本发明的异卡巴环素衍生物的注射给药制剂用于治疗给药时，通常必须是灭菌状态的。用孔径0.2μm的膜过滤器，使药剂通过灭菌过滤膜，则很容易达到上述灭菌要求。
这种医药组合物中，上述有效成分相对于载体成分的比例，例如可以在0.000001～90重量％间变动。治疗的有效给药量可根据给药方法、年龄、对象疾病等有所不同，可以是0.01μg～1000mg/日/人，优选为0.01μg～10mg/日/人。对于各给药途径，可根据药学上熟知的方法，确定各种化合物各自在体内的吸收率。
剂型及给药形式方面，可制成颗粒剂、细粒剂、散剂、丸剂、锭剂、胶囊剂或液剂等剂型口服给药，或者也可制成栓剂、气溶胶剂、或软膏和皮肤贴片等局部制剂非口服给药。也可制成注射剂静脉内给药、动脉内给药、肌肉内给药、皮下给药。还可制成注射用粉剂，临用时进行调制。此外，还可以经鼻给药、腹腔内给药、直肠内给药或脑室内给药。
适用于口服、经肠或非口服给药的医药用有机或无机的、固体或液体的载体或稀释剂，可用来将本发明的异卡巴环素衍生物调制为医药制剂。
可组合到锭剂、胶囊剂等中的代表性载体或稀释剂的例子有阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶等粘合剂，微晶纤维素等赋形剂，玉米淀粉或藻酸等崩解剂，硬脂酸镁等润滑剂，蔗糖或乳糖等甜味剂。剂型为胶囊的场合，也可含有上述物质以及脂肪油等液体载体。其他各种物质可用作包覆剂、或用作给药单位的物理形状的改良剂。注射用的灭菌组合物可以按照常用的医药方法做成制剂。例如，优选将活性化合物溶解或悬浮于水或天然植物油等赋形剂、或油酸乙酯等合成脂肪赋形剂中。柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐等缓冲剂，抗坏血酸等抗氧化剂可按照医学上容许的方法组合使用。
在锭剂的形态方面，例如可用乳糖、淀粉、结晶纤维素等赋形剂，羧甲基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等粘合剂，藻酸钠、碳酸氢钠、十二烷基硫酸钠等崩解剂按常规方法成形。
丸剂、散剂、颗粒剂同样也能用上述的赋形剂等按常规的方法成形。液剂或悬浊剂，例如可用三辛精、三醋精等甘油酯类，乙醇等醇类等按常规方法成形。胶囊剂可将颗粒剂、散剂或液剂等充填到明胶等的胶囊中来进行成形。
用作口服给药的制剂时，也可将本发明的异卡巴环素类转变为环状糊精包合化合物。该包合化合物的制备方法是，将环状糊精溶于水和/或易与水混合的有机溶剂中，制成环状糊精溶液；将异卡巴环素类溶于易与水混合的有机溶剂中，制成异卡巴环素溶液，将环状糊精溶液加入到异卡巴环素溶液中，即可调制成包合化合物。将混合物加热后，减压浓缩，或冷却下用过滤器过滤或倾析，将生成物分离，从而使目的环状糊精包合化合物分离出来。有机溶剂与水的比例根据起始物和生成物的溶解性能而变化。环状糊精包合化合物制备过程中的温度要求不超过70℃。α，β或γ-环状糊精或它们的混合物都可用来调制环状糊精包合化合物。将异卡巴环素类转变为环状糊精包合化合物可提高其稳定性。
皮下、肌肉内、静脉内给药的剂型可制成水性或非水性溶液剂等形式的注射剂。水性溶液剂例如可用生理盐水等。非水性溶液剂例如可采用丙二醇、聚乙二醇、橄榄油、油酸乙酯等，这些制剂中根据需要可以添加防腐剂、稳定剂等。注射剂通过可截留细菌的过滤器过滤，以及配合杀菌剂等适当的处理使其无菌化。
经皮给药的剂型例如软膏剂、乳油剂等，软膏剂可采用蓖麻籽油、橄榄油等油脂类，凡士林等；乳油剂可采用脂肪油、二甘醇、山梨糖醇酐单脂肪酸酯等乳化剂按常规的方法成形。
用于直肠给药时，采用明胶软胶囊等常用的栓剂。
非口服制剂可以用乳浊剂给药。亦即，将水加入到由大豆油等植物油、卵磷酯等磷脂和本发明的异卡巴环素类组成的均一溶液中，用加压喷射匀浆器、超声波匀浆器等匀浆器使其均质化，所得的脂肪乳剂用作注射剂。
以下，结合本发明的实施例，对本发明作进一步的详细说明，但是，本发明不受这些实施例的任何限制。
开始的1分钟内，打开闸刀门，让大鼠在装置内自由探索，然后把门关闭，将获得试行的大鼠放入明室，30秒后，再把门打开。大鼠的四肢进入暗室后，把门关闭并立即施加电击，电击的强度为0.5mA、电击5秒钟。然后，立即将大鼠放入明室，用同样的顺序打开闸刀门，并使大鼠在明室内停留120秒，如此反复训练。获得试行的24小时后，将保持试行的大鼠放入明室，30秒后，打开闸刀门，测定开门后至大鼠四肢进入暗室的时间(行走通过等待时间)。保持试行时的最大观察时间为300秒。[参考例2]β蛋白连续注入脑室内来制作阿尔茨海默型痴呆动物模型使用7周龄的Wistar系雄性大鼠(体重220-250g)(N＝5-10)。
将β-淀粉状蛋白(1-40)或β-淀粉状蛋白(1-42)溶于35％的乙腈/0.1％TFA中，按300pmol/天的量注入微量渗透泵中(体积230μl、0.5μl/小时)，该泵通过聚乙烯管与牙科用注射针连接。对照组与注入β-淀粉状蛋白(40-1)的泵连接。用戊巴比妥(50mg/kg，i.p.)麻醉大鼠后，将其头皮切开，进行脑图谱的检测的同时用微钻孔机在头盖骨打孔，插入注射针，使针的尖端在侧脑室(A＝-0.3mm、L＝1.2mm、H＝4.5mm)内，用牙科用粘固剂固定。渗透压泵埋入背部的皮下。
进行微量渗透压泵埋入手术的当天作为0日，第13、14日，按参考例1所示的方法进行被动回避试验，由此实验结果可确定，β-淀粉状蛋白(1-40)或β-淀粉状蛋白(1-42)的给药组与β-淀粉状蛋白(40-1)的给药组比较，前者的学习记忆能力降低。[参考例3]毒性试验的方法6周龄的C57BL系雄性大鼠35只按表1分成7组。
表1

将试验化合物液按1分钟约5ml的速度注入尾静脉内。对每个个体的一般状态，在给药当天的给药前、刚给完药后、给药后15分、30分、60分、2小时、4小时和6小时的时候适当进行观察。随后，自给药后次日起至第14日，每天一次午前观察。另外，给药之前、给药后第1、3、7和14日测定体重。[参考例4]降血压作用的测定方法Wistar系雄性大鼠35只(体重230-270g)按表2分成7组。表2

为了测定血压和将给药液注入静脉内，在左颈动脉和左颈静脉分别插入插管。手术后在笼子内常规饲养过夜，然后在无麻醉下注入给药液。测定给药之前(0分钟)、给药组在5、30、60、120、240分钟时的血压、心跳数。各动物的0分钟时的血压作为100，将各时间的血压测定值标准化。[实施例1]学习记忆障碍改善效果的测定用参考例1和参考例2的评价方法，测定试验化合物A的学习记忆障碍改善作用。将试验化合物A溶于磷酸缓冲食盐水中，与注入β-淀粉状蛋白时同样，用渗透压泵注入。试验化合物A溶于β-淀粉状蛋白溶液中，用渗透压泵与β-淀粉状蛋白同时注入。
表3

也就是说，本实验表明了试验化合物A改善学习记忆障碍的作用。特别是，试验化合物的12fmol/天给药组，以及120fmol/天给药组与单独β-淀粉状蛋白(1-42)的给药组相比，向暗室移动时间明显延长了(p＞0.05)。[实施例2]毒性试验对试验化合物B和试验化合物C的毒性进行了试验，其结果是，认为所有给药组都不会死亡。对试验化合物B来说，3mg/kg的给药组只是在给药后一定时间内运动性能的降低，但只是轻度的变化，给药后30分钟即消失。对试验化合物C来说，所有给药组都无异常。而且，给药次日以后，无论试验化合物B或C，所有给药组都无异常。此外，就体重而言，试验化合物B和C给药组都没有明显的变动。
即，本实施例说明了两种试验化合物的毒性都很低。[实施例3]降血压作用的测定试验化合物B和比较试验化合物D给药后血压的变动如表4中所示。
表4

此外，试验化合物B和比较试验化合物D给药后的心跳数变动如表5所示。
表5

试验化合物B的3mg/kg给药组在给药后会引起血压降低以及心跳加快，但恢复快，特别是血压在给药5分钟后仅有轻微的降低，30分钟后即可恢复正常。0.3mg/kg给药组和0.03mg/kg给药组则未观察到明显的变化。
另一方面，比较试验化合物D的3mg/kg给药组和0.3mg/kg给药组中，可看到血压持续降低30分钟。
由此可知，试验化合物B是对循环器官系统作用极小的化合物。
产业上的实用性含有本发明特定的异卡巴环素衍生物作为活性成分的治疗剂，作为神经变性疾病的治疗剂、呈现痴呆症状的变性疾病的治疗剂、特别是阿尔茨海默病的治疗剂，对学习记忆障碍有较大的改善作用，而且毒性、降低血压等副作用少，可用作临床上的神经变性疾病的治疗剂、呈现痴呆症状的变性疾病的治疗剂、特别是阿尔茨海默病的治疗剂。
权利要求
1.含有下述式[I]所示的(15R)-异卡巴环素衍生物作为活性成分的神经变性疾病治疗剂，式中，R1表示C1～C6亚烷基，R2表示氢原子、C1～C7烷基或保护基。
2. 权利要求1所述的神经变性疾病治疗剂，它含有下述式[II]所示的(15R)-16-间甲苯基-17，18，19，20-四去甲异卡巴环素或其甲基酯作为活性成分。
3.含有下述式[III]所示的15-脱氧-异卡巴环素衍生物作为活性成分的神经变性疾病治疗剂，式中，R1和R2的定义与式[I]相同。
4.权利要求3所述的神经变性疾病治疗剂，它含有下述式[IV]所示的15-脱氧-16-间甲苯基-17，18，19，20-四去甲异卡巴环素衍生物或其甲基酯作为活性成分。
5.权利要求1～4任一项所述的神经变性疾病治疗剂，其中，神经变性疾病是呈现痴呆症状的变性疾病。
6.权利要求1～5任一项所述的神经变性疾病治疗剂，其中，呈现痴呆症状的变性疾病是阿尔茨海默病。
全文摘要
含有通式[I]所示的(15R)－异卡巴环素衍生物或通式[III]所示的15－脱氧异卡巴环素衍生物作为活性成分的神经变性疾病治疗剂;通式[I]和[III]中,R
文档编号A61P25/00GK1378453SQ00813891
公开日2002年11月6日 申请日期2000年8月4日 优先权日1999年8月5日
发明者诹访赖正, 吉冈升, 新井贵巳, 樱井胜俊, 铃木纯, 渡边恭良, 铃木正昭, 佐藤藤实, 渡边由美子, 片冈洋祐 申请人:帝人株式会社, 财团法人大阪生物科学研究所