6,9－二－[(2－氨基乙基)氨基]苯并[g]异喹啉－5,10－二酮二马来酸酯的脂质体制剂的制作方法

专利名称：6,9－二－[(2－氨基乙基)氨基]苯并[g]异喹啉－5,10－二酮二马来酸酯的脂质体制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及化合物6，9-二-[(2-氨基乙基)氨基]苯并[g]异喹啉-5，10-二酮二马来酸酯(BBR 2778)的脂质体药物制剂。
脂质体是由一个或多个双分子层构成的天然和/或合成磷脂(具有生物相容性的和生物降解性)的水分散体。当磷脂在水性介质中形成水合物时，它们自动形成胶体微粒或载体，其直径通常为0.05-5.0μm。脂质体的粒度在0.025-2.5μm范围之间，这依赖于它们的结构，其中所述结构可为单一或多个双分子层。囊泡的大小是决定脂质体半衰期的一个关键参数并且它影响到可装入胶囊中药物的量。
脂质体可根据它们在天然和/或合成磷脂(含磷-鞘脂类)中的组成分类，并且它们的双分子层可进一步包含其它成分，如胆固醇和与脂质共轭的亲水性聚合物。根据其双分子层的大小和数量，也可以将脂质体分成下列种类(a)多层脂质体(MLV)，(b)大单层脂质体(LUV)，(c)小单层脂质体(SUV)，(d)多泡脂质体(MVV)，(e)少层脂质体(OLV)。
构成脂质体的磷脂之理化特性(如膜流动性、电荷密度、位阻和通透性可影响脂质体与血成分、组织和细胞间的相互作用。
脂质体被公认为是潜在的有价值之药物载体。脂质体容纳、携带和释放药物的能力已导致了许多临床应用。脂质体在药学领域最简单的用途是作为不溶性药物的无毒性载体。更复杂的应用涉及将脂质体用作“储库”，用于药物的缓释或药物的定位，以避开或到达特定组织。脂质体形式的药物对许多疾病的治疗和预防都提供了良好的结果，如在抗微生物治疗中、在抗癌治疗中、作为疫苗中的佐剂、在激素和酶的治疗中、在诊断技术中以及在皮肤和眼疾的治疗中。用于治疗疾病如癌症的药物通常具有有限的治疗指数，并且对正常组织可能是高毒的。脂质体制剂可通过改变药物的生物分布，从而改善治疗指数。与给予游离药物的对照动物相比，用具有延长血浆半衰期之脂质体封装的蒽环霉素(anthracycline)进行的一些试验显示其可降低心脏毒性并且动物存活较好。在阿霉素(一种蒽醌抗肿瘤药)的情况下，应用脂质体制剂证明在降低毒性方面是有效的。阿霉素最危险的副作用是进行性、不可逆的心脏损害。脂质体封装的阿霉素显示了较低的毒性同时保留了其治疗功效。US 4,797,285、US 4,898,735和US5,043,166中公开了阿霉素/脂质体制剂及其在癌症治疗中的应用。
化合物BBR 2778是蒽醌类抗肿瘤药物，具抗肿瘤活性和降低的心脏毒性，其结构式如下 有关化合物BBR 2778的完整描述报道于US 5,587,382、US 5,717,099、US 5,506,232、US 5,616,709和医学化学杂志(J.Med.Chem.)，1994，37卷，828-837中。
将40或60mg/kg剂量的BBR 2778以弹丸注射方式静脉内施与CD1小鼠后，在治疗期间或治疗后立即观察到一些动物死亡。
此类突然死亡被认为是由于与使用BBR 2778有关的下列因素之一形成血栓的活性；血凝固参数的改变，其导致播散性血管内凝固的形成；过敏性休克的诱导；对中枢神经系统的直接毒性效应；形成心律失常的活性；电解质不平衡。当注射速率降低(每次注射7-8分钟，速率为0.1ml/min)并通过腹膜内施用时，该剂量-依赖现象减小。
因此，本发明所要克服的根本问题是找到化合物BBR 2778的合适制剂，以克服上述缺点，特别是以弹丸注射形式施用活性组分后观察到的突然死亡。意外地发现，以特定组成表征的BBR 2778脂质体制剂成功地解决了所述问题。
因此，本发明提供了由脂质体组成的化合物BBR 2778的脂质体制剂，其中所述脂质体包含磷脂酰胆碱、胆固醇和BBR 2778，其中胆固醇/磷脂的重量比为1∶2至1∶7，并且BBR 2778/磷脂的重量比为1∶4至1∶25。磷脂酰胆碱优选地包含选自棕榈酸、油酸、亚油酸、γ-亚油酸、亚麻酸和硬脂酸的脂肪酸残基，并且脂质体由氢化和非氢化磷脂酰胆碱以1∶2至2∶1的比例混合而成，其中磷脂酰胆碱具有所述的脂肪酸组分，更优选地，所述混合物是由具有120℃熔点和90℃结晶点的氢化磷脂酰胆碱以及具有如图5所报道之温谱图的非氢化磷脂酰胆碱组成。具有上述组分的氢化和非氢化磷脂酰胆碱可分别在PHOSPHOLIPON90H和PHOSPHOLIPON90的商品名称下，通过商业渠道获得。
优选地，本发明之组合物除包含上述组分外，还包含带电化合物，如硬脂酰胺和二鲸蜡基磷酸酯。所述组分的加入给脂质体提供了表面电荷，这些表面电荷诱导脂质体相互排斥，因此可阻止它们萎陷。磷脂混合物也可以包含十二烷基硫酸钠、cremophor RH60、α-生育酚磷酸盐和醋酸钙。而且，在膜的双分子层中可包含小部分(5-19mol％)具有亲水基的化合物，如单唾液酸神经节苷酯、氢化磷脂酰肌醇和与脂质共轭的聚乙二醇(PEG-DSPE)，以减少脂质体与细胞和血成分之间的相互作用。
根据本发明的脂质体制剂通过体内试验，对其抗肿瘤活性和毒性进行了测试。P388鼠白血病用作肿瘤模型。特别地，通过与施用游离药物制剂的对照组比较来评价对突然死亡的抑制活性。在实施例中进行了详情报道。该试验结果证实了本发明之脂质体制剂可导致平均存活时间的显著改善和毒性的显著降低。此外，再也观察不到突然死亡。
总之，可因此陈述本发明之制剂可保持抗肿瘤活性而不诱发突然死亡，而在施用游离药物或含活性组分的其它常规制剂时，可观察到突然死亡。
下列实施例对本发明进行了更详细的阐述。实施例1-将卵磷脂纯化为磷脂酰胆碱卵磷脂的主要来自大豆、棉花、向日葵和菜籽的植物油或来自动物组织(卵)。按照产量来说，大豆和卵来源的卵磷脂是最重要的。将大豆用己烷提取，得到半固体形式的粗卵磷脂，它包含52％的磷脂、35％的油和脂肪、10％的糖脂和糖、2％的不可皂化物以及1％的水。
从粗卵磷脂中提取脂肪酸，以获得细的或颗粒状的卵磷脂粉末，再进一步用乙醇提取并分级分离，以获得具有较高磷脂酰胆碱含量的较纯的卵磷脂。
粗卵磷脂也可使用工业生产磷脂酰胆碱的一步法来纯化，所述方法为使用丙酮提取，US5,442,276中对此进行了公开。
粗卵磷脂的纯化
提取(乙醇)色谱层析(硅胶)
色谱层析(氧化铝)
氢化作用
通过对PHOSPHOLIPON90(PHO90)的氢化作用，获得了PHOSPHOLIPON90 H(PHO90H)。
两种商购磷脂(Rhone-Pouleno Rorer)具有下列特性PHOSPHOLIPON90一过氧化物指数最大5一酸值最大0.5一乙醇最大0.5％
-水最大1.5％-形态黄色糊状固体-加入的d，1α-生育酚最少0.1％。
PHOSPHOLIPON 90H-碘值最大1-水最大2.0％-在水中的20％分散液的相转化温度约为54℃-形态白色结晶固体。
用脂肪酸如棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和硬脂酸来酯化磷脂酰胆碱分子中的甘油1-和2-位。实施例2-磷脂的色谱分析通过GLC分析来定量和定性确定磷脂酰胆碱样品的脂肪酸组分。使用纯脂肪酸甲基酯(Carlo Erba)和标准橄榄油检测和定量磷脂样品中的脂肪酸。
样品的皂化作用将50mg产品置于试管中，并加入3ml 1N氢氧化钠(Baker)。紧紧密封试管并在合适的烤箱中于110℃下放置1小时。冷却到室温后，将样品用2N盐酸(Baker)酸化，并用10ml正己烷/乙酸乙酯90/10(Merck)混合物提取。在温和的氮气流下除去有机溶剂。
样品的酯化作用从试管中除去有机相，加入1ml BF3甲醇液，紧紧密封试管并于100℃保持1小时。冷却到室温后，向样品中加入5ml蒸馏水并用正己烷/乙酸乙酯90/10混合物提取两次，每次5ml。用硫酸钠干燥1μl有机相，然后注射到气相色谱装置中。操作条件气相色谱Mega 5300 Carlo Erba柱Megawax，长度30m，内径0.32mm，f.t.0.25μm载体氦气速度45cm/sec注射器250℃，1/100分流检测器F.I.D.280℃烘烤120℃1分钟最终温度250℃，每分钟热增加5℃附

图1-3分别显示标准物、PHO90和PHO90H的气相色谱图。
表1显示在所分析脂中酸的百分数表1
实施例3-磷脂的热分析通过DSC分析单一的以及混合物中的商购磷脂PHO 90和PHO 90H。
如下制备样品将500mg PHO 90溶解于10ml二氯甲烷+1ml MeOH中(S1)；将500mg PHO 90H溶解于10ml二氯甲烷+1ml MeOH中(S2)。
样品12ml S1样品22ml S2样品30.5ml S1+1.5ml S2样品41ml S1+1ml S2样品51.5ml S1+0.5ml S2在氮气流和适当加热下干燥样品，然后通过DSC分析。用Mettler DSC20，以3℃/分钟的梯度加热到200℃，然后让样品冷却来进行分析。
附图4-5报道了两种磷脂的温谱图。由图4可见，PHO 90H具有明显的、界限分明的熔点(120℃)和结晶点(90℃)。
就PHO 90而言，图5显示其不是结晶粉末，而是糊状物，所以就像所有脂肪一样，它没有界限分明的熔点，但有软化点(脂肪开始流动时的温度)和透明点(脂肪完全透明时的温度)。
这一点通过PHO 90的温谱图得以证实，其中观察到了与软化点相对应的宽带，而不是像PHO 90H的温谱图那样有特定的峰。
至于混合物的温谱图，在较低温度下观察到了结晶点的降低，从PHO90H∶PHO 90 2∶1混合物到1∶1混合物进一步降低，直至PHO 90H∶PHO90 1∶2混合物(其中PHO 90的性能占优势)最终完全消失。实施例4-脂质体制剂的制备将3.6g PHO 90、1.8g PHO 90H(2∶1比例)和0.52g胆固醇置于500ml圆底烧瓶中，并加入50ml二氯甲烷。超声该混合物约10分钟以促进溶解。将所得溶液在旋转式膜蒸发器(Rotavapor)中，于40℃真空蒸发至干，并轻轻旋转直至获得均一的磷脂膜。
冷却所得磷脂膜；然后加入BBR 2778溶液，该溶液是通过将300mg BBR2778溶解于60ml水/丙二醇60/40并通过0.22μm滤器过滤制得；并加入10ml平均直径为2mm的玻璃珠。将与旋转蒸发器连接并缓慢运转的圆底烧瓶在室温和室压下放置过夜(15小时，300转/分钟)直至完全再水合。表2报道了对所得BBR 2778制剂的分析结果。
表2
实施例5-BBR 2778脂质体抗肿瘤活性的评价动物小鼠，由Charles River Breeding laboratories(Calco，Como，Italy)提供；为6-8周龄的雄性小鼠，在标准饲养条件下饲养。
制剂以10mg/kg剂量的BBR 2778(施与小鼠前用无菌水溶解和稀释)作为对照。使用实施例4的脂质体制剂。
肿瘤模型通过在DBA2小鼠中的一系列腹膜内移植而维持P388鼠白血病(由NCI Frederick Cancer Facility(USA)提供)。每只小鼠移植106个P388鼠白血病细胞，在肿瘤移植后第1、4、7天静脉内施与脂质体化合物和对照标准品。
通过测定小鼠存活时间的增加百分数来测定抗肿瘤活性，以治疗组(T)平均存活时间(TMS)与对照组(C)平均存活时间的百分比T/C％表示
表3报道了试验制剂中BBR 2778的抗肿瘤活性结果。表3
*中毒死亡数/小鼠总数**多次试验的平均值实施例4的制剂和BBR 2778溶液之间进行比较，可清楚地表明施用脂质体制剂的小鼠突然死亡消失。对施用的每个单剂量的分析显示出脂质体制剂和溶液剂之间T/C％和毒性的变化；在18mg/kg和27mg/kg剂量下，所观察到的T/C％基本上没有差异，然而仅在用非封装BBR 2778治疗后可观察到毒性方面有差异。
在40mg/kg剂量下，与BBR 2778溶液相比，本发明制剂显著改善平均存活时间分别为287、250和159，并显著降低毒性(分别12％和60.4％)。在60mg/kg的剂量下，两种制剂都引起中毒。
因此说明，施用本发明的BBR 2778脂质体制剂不引起突然死亡，并可降低毒性。
至于抗肿瘤活性，即使在某些剂量下T/C％可明显上升，但来自BBR2778溶液的试验结果仍可证实抗肿瘤活性。
权利要求
1.下式化合物6，9-二-[(2-氨基乙基)氨基]苯并[g]异喹啉-5，10-二酮二马来酸酯(BBR 2778)的脂质体药物制剂 其特征在于所述脂质体包括磷脂酰胆碱、胆固醇和化合物BBR2778，其中胆固醇/磷脂的重量比为1∶2至1∶7，并且BBR2778/磷脂的重量比为1∶4至1∶25。
2.如权利要求1所述的脂质体制剂，其中所述磷脂酰胆碱包含选自棕榈酸、油酸、亚油酸、γ-亚油酸、亚麻酸和硬脂酸的脂肪酸残基。
3.如权利要求1所述的脂质体制剂，其中所述磷脂酰胆碱是以1∶2至2∶1重量比混合的氢化和非氢化形式混合物。
4.如权利要求3所述的脂质体制剂，其中所述氢化形式的熔点为120℃且结晶点为90℃，所述非氢化形式的温谱图基本上如图5所示。
5.如任一上述权利要求所述的脂质体制剂，其中脂质体进一步包含硬脂酰胺和/或二鲸蜡基磷酸酯。
6.权利要求1-5之脂质体制剂的用途，其用于制备抗肿瘤药物。
全文摘要
化合物6,9－二－[(2－氨基乙基)氨基]苯并[g]异喹啉－5,10－二酮二马来酸酯的脂质体药物制剂、其制备方法及其应用。
文档编号A61K47/24GK1382039SQ00814600
公开日2002年11月27日 申请日期2000年10月19日 优先权日1999年10月22日
发明者C·布盖逖 申请人:诺威斯药物有限公司