专利名称：一种用于治疗烧伤的生物制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医用配制品及其制备方法，具体地说是属于治疗烧伤的生物制剂和生产该制剂的方法。
烧伤是一种常见病、多发病，也是致残率较高的创伤性疾病。据地区抽样调查表明，每年烧伤人群的发病率为2％人次，留疤率为30％左右。目前临床治疗烧伤常采用的方法，一般是在进行创面早期处理后，或采用包扎疗法或采用暴露疗法进行治疗(《烧伤治疗学》黎鳌主编，人民卫生出版社出版)。包扎疗法是用灭菌吸水的厚敷料包扎创面，使之与外界隔离，以保护创面。该方法的不足之处是，在包扎处理时，包扎内层敷料常常出现或是与创面粘着、交换困难，或是引流效果欠佳。在包扎治疗过程中，还常常由于创面潮湿，诱发感染。暴露疗法是将烧伤创面暴露于干燥空气中，不用敷料覆盖或包扎，使创面的渗液及坏死组织干燥成痂，以暂时保护创面。这种方法虽然创面不利于细菌的生长，但可使淤滞区组织干枯坏死，其损坏程度不亚于初期烧伤的损坏。暴露疗法对外部环境条件要求高，且干痂时间长，一般在烧伤48小时后方可成痂。现有的治疗方法因缺少适合烧伤皮肤使用的药物，因而疗效不尽如人意。另外，无论是包扎疗法还是暴露疗法，在早期清创时，都要进行创面抗感染处理。清创所选用的抗感染药物主要有三类一是中草药制剂，如四季青、毛冬青、黄连、黄柏、桉树叶等；二是化学药物制剂，如双氧水、新洁尔灭、甲磺灭脓等；三是抗生素制剂如青霉素、庆大霉素等。由于大多数药物均可从创面吸收，因此大面积使用这些药物，尤其是浓度过大或使用粉剂时常常可引起中毒或内脏损害。再则，这些药物一般都有一定的刺激性，在使用时常常会给患者增加痛苦。
本发明的目的就是提供一种适合烧伤皮肤愈合、刺激性小、疗效好的生物制剂，同时提供一种制备该制剂的方法。
本发明的目的是这样实现的，所制备的生物制剂含有蜡状芽孢杆菌CGMCC0601发酵液。
蜡状芽孢杆菌CGMCC0601发酵液所用的微生物L-72(即本发明所用微生物)，经中国科学院微生物研究所(依据1、Krieg N.R.et al.Bergey′s Manual ofSystematic Bacteriology(Vol，2)p.1105-1138.1986.2、Colin R·Harwood，Bacillus，Plenum Press，1989.3、R·E·戈登等《芽孢杆菌属》蔡妙英等译，农业出版社1978.)鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。本发明所用微生物在本发明申请日前已提交中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC0601，保藏日为2001年7月12日。
本发明所用微生物呈革兰氏阳性杆状，大小为0.9-1.0×2.5-4.0μ；芽孢为椭圆形，近端生，不膨大；胞内有聚β-羟基丁酸盐(PHB)颗粒的积累；接触酶和氧化酶皆阳性，厌氧菌生长阳性，V-P反应阳性，对葡萄糖产酸，对阿拉伯糖、木糖、甘露醇不产酸，水解淀粉，分解酪朊，利用柠檬酸盐和丙酸盐，V-P反应终了，PH值为5.0，在7％NaCl中不生长。
本发明所用微生物生长条件有氧环境，PH值7.8-8.5；温度28-32℃；培养状态静置、动态均可；生产周期静置60-72小时，动态10-16小时。
本发明所用微生物具有良好的稳定性。该微生物发现于1972年，因对霉菌有较强的抑制作用而分离留种，4℃保存备用。每经两个月倒管(传代)一次；每一至二年筛选一次，挑选菌落大、粘稠、拉长丝、边缘整齐、镜下观查有该菌的特殊花纹结构，即可选取，扩大培养，定为母种，用于制剂。
每五年做一次较系统的生理生化检测(见表1)，经过二十多年的培养使用，未发现该菌有变异现象，每年不同时期所生产的制剂，药效也无差异。
该微生物在使用、保存及多次传代过程中，不易产生变异现象，故作为一个生产菌种是可靠而有前途的。
该微生物自发现至今，已有二十多年，总传代一百多次，从生理生化反应及使用上，未发现有变异和衰退现象。其主要的生理生化反应检测见表1。
表1蜡状芽孢杆菌CGMCC0601主要生理生化反应检测表检测项目 检测时间(年、月)72.5 77.5 82.8 88.5 93.7革兰氏染色 +++++菌落粘稠拉长丝 +++++菌落特殊花纹 +++++液体培养形成菌膜 +++++淀粉酶 +++++酪朊 +++++硝酸盐 +++++醋酸盐 +++++V-P反应 +++++7.5％NaCI生长-----厌氧生长 -----葡萄糖产酸 +++++乳糖产酸 -----蔗糖产酸 +++++麦芽糖产酸 +++++甘露醇产酸 -----木糖产酸 -----过氧化酶 +++++本发明所含微生物其菌种的培养方法是1、母种培养基牛肉膏10g，蛋白胨5g，蔗糖10g，琼脂18g，氯化钠2.5g，普通水1000ml，PH值7.5，15P 30分钟灭菌。降温至60℃，倾注平板。
2、接种将接种环沾湿插入菌种(CGMCC0601)划线于平板上，30℃恒温培养24小时，选取单个、形大、乳白、粘稠、拉丝长、边缘整齐、镜下观察保持独特花纹结构的菌落作为生产菌种。
3、制母种将优选的菌落接入斜面中30℃培养三天，向管中加入无菌水3ml，将菌膜洗下，然后钩出培养基，将菌液煮沸三次后接入斜面管，30℃培养三天，4℃保存，备用。
4、制原种培养基为牛肉膏10g，蛋白胨5g，蔗糖10g，氯化纳2.5g，水蒸200ml、15P 30分钟灭菌。
5、将母种以一支接五瓶原种为准，向母种基中加入5.5ml原种基，用带吸球的2ml吸管反复吹吸，将菌苔洗入溶液中，每毫升接原种一瓶，混合后30℃培养24小时，即为原种。
本发明生物制剂的制备方法，包括下列步骤a、制备培养基培养基含有杨叶粉25-35份，槐叶粉20-30份，玉米粉80-120份，黄豆粉20-30份，碳酸钠8-10份，加水至膏状，放置0.5-1小时，加水8000-10000份，用氢氧化钠调PH值为8.0-8.5，搅拌、封口，15P 20-30分钟灭菌；b、培养基温度降至28-32℃，按培养基容量的5-12％接入原种；30±1℃培养2-3天，至白色菌膜形成；c、加入0.5-1％的苯酚，搅拌，加入0.5-1％的助滤剂，过滤，收集清亮透明液体。
为保证制剂具有更好的疗效，其中杨叶粉最好选用小叶杨叶粉，槐叶粉最好选用洋槐叶粉。
本发明生物制剂与草酸钾反应可以生成等大、均匀、分散、有光折性的球状颗粒，所制备的生物制剂每毫升含球状颗粒总数为10-20亿，其疗效尤佳。
本发明生物制剂可通过质量控制来确保其在治疗烧伤疾病时的稳定疗效。
其定性检测方法为取本品5ml加10％草酸钾0.2ml混匀形成白色乳状液体，其沉淀溶于0.2％稀硫酸，不溶于36％醋酸，干燥粉末溶于二甲苯。
本品与草酸钾反应可生成不溶于水的固体物质，在显微镜下观察系等大、均匀、分散、有折光性的球状颗粒，其颗粒数目与有效成份成正相关系。
定量分析方法是取本品5ml，加10％草酸钾0.2ml，混合后取1ml加蒸馏水至100ml混均，取少许置于血球计数板上，用400倍显微镜取四角的四个中方格(每个中方格有16个小方格)中的颗粒总数进行计算。
公式 例颗粒数328个。
计算
即本发明的生物制剂的特异性颗粒数为20.5亿。
本发明的生物制剂的特异性颗粒带有相同电荷，在溶液中可形成均匀分散的个体，能在血球计数板上进行计数。
本发明的生物制剂对烧伤创面的疼痛、渗出、感染、积浓、烧伤组织的进行性坏死以及深II°创面的疤痕性愈合，有良好的疗效。使用本发明生物制剂，可使烫伤表面干燥，渗出减少，能加快新生肉芽组织生长，促进烫伤组织愈合，同时具有刺激性小、止痛快、可有效控制感染、疗程短、不留疤痕等优点。
本发明的CGMCC0601微生物在发酵过程中，使培养基中的叶绿素变成叶红卟啉。叶红卟啉上的羰基和羧基与苯酚的羟基反应，生成相应的脂或醚。这与正常皮肤表面存在的脂类物质相似，因而可与创伤皮肤表面的水分起乳化作用而产生脂类膜，能够对皮肤创伤表面起到保护作用。
本发明的优良效果通过下列实验研究得到了进一步的证实。
药效学研究1、实验材料1.1药物实验组，本发明生物制剂，批号94025；对照组，烧伤灵，批号940766，石家庄乐仁堂制药厂生产。
1.2动物昆明种小鼠24-25g，雌雄各半，由河北医学院实验动物中心提供。
1.3菌种金黄色葡萄球菌(26003)，大肠杆菌(44102)，粪链球菌(32221)、绿脓杆菌(10104)、白色念珠菌(10231)，均由北京药品生物制品检定所提供。
1.4培养基沙氏培养基，普通琼脂培养基和肉汤。
2、方法与结果2.1对小鼠烫伤创面愈合的影响取健康小鼠，背部脱毛24小时后，将动物用乙醚麻醉，置于80℃恒温铝板上，持续15秒，造成10％的II°烧伤。烧伤创面面积约(2×3cm2)(此条件是经预试验由病理组织学检查后确定)。将动物随机分成四组，空白对照组，对照组，实验组依据高、低两个剂量分为实验1组、实验2组。每组12只，烫伤后立即喷药，空白对照组喷水，对照组给烧伤灵0.5ml/次，实验组给药量0.5ml/次，各组2次/日，连续给药14天，观察各组动物给药后结痂时间、脱痂时间及4天、8天、12天各组之间体重变化情况。结果见表2、表3。
表2本发明生物制剂对小鼠烧伤创面愈合的影响组别 结痂时间(天)痂皮脱落时间(天)空白对照组 7.0±1.315.6±4.2实验1组(高量) 4.8±0.4*11.3±2.5*实验2组(低量) 4.6±0.8*11.4±1.3*对照组 5.8±1.113.4±3.8x±s，n＝12，*P＞0.05表3本发明生物制剂对小鼠烧伤后体重的影响x±s，n＝12，克组别给药前给药后4天 8天 12天空白对照组 24.4±0.5 22.6±0.624.1±0.827.2±1.3实验1组(高量) 24.5±0.6 25.8±0.9**25.7±1.4**27.2±1.4实验2组(低量) 24.3±0.3 25.8±0.5**25.8±0.5**27.4±0.8对照组 24.4±0.4 24.6±0.925.2±1.0*27.4±1.4*P＞0.05**P＜0.01实验表明实验组能缓解烫伤动物因疼痛而引起的嘶叫、跳跃、颤抖等现象，实验组的动物连续用药后烫伤创面干燥、无感染，长出痂皮的时间及脱掉痂皮的时间均早于对照组，与对照组比较具有显著性差异。从实验中还可以观察到，小鼠烫伤后，因剧痛而引起活动及摄食量的减少，使体重下降，给药后，实验组无论是高量组(生物制剂每毫升含球状颗粒总数为20亿)还是低量组(生物制剂每毫升含球状颗粒总数为10亿)，动物摄食及活动都很快恢复了正常，体重在给药4天即明显得到提高，与对照组相比较，具有显著性差异。
2.2体外抑菌试验抑菌试验方法按照卫生部《药品卫生检验方法》进行。
试验结果见表4。
表4发本明生物制剂对致病菌的影响金黄色 白色时间(分)大肠杆菌绿脓杆菌对照葡萄球菌念珠菌0 卅 卅 卅 卅 卅2 艹 艹 - 艹 卅4 + + - 艹 卅6 - - - +卅8 - - - +卅10 - - -卅实验表明，本发明的生物制剂10分钟即可对烧伤创面感染率较高的5种致病菌产生显著的抑制作用。
本生物制剂经皮肤用药毒性实验表明使用本发明生物制剂的各组动物，在用药观察期间，各组动物进食、排泄及活动均无异常，呼吸及四肢活动正常，体重各组之间无明显变化，无死亡发生。
本生物制剂经皮肤用药刺激实验表明完整皮肤及破损皮肤组均未见红斑和水肿等刺激反应。
本发明生物制剂其临床研究取得良好的效果，临床研究报告如下。
临床观察方法及项目1、观察单位河北医学院第三医院、中国人民解放军第二五六医院、石家庄市长安区医院、石家庄市佩英烧伤生物医学开发研究所等。
2、观察项目抗渗出、止痛、抗感染、止痒、生肌、终止烧伤后的组织反应等。对不同烧伤因素、程度及就诊时间迟早，观察其痊愈时间及有无疤痕等。
3、用药方法I°烧伤，创面间断喷洒本发明生物制剂至疼痛消失。II°烧伤的创面清洁、无污物，未用其它药物者，可直接喷洒该药，每日2-6次，如有水泡可低位剪口排空。疼痛创面每隔5分钟喷药一次，疼止后改为正常用量。喷药量以均匀不流动为宜。一般160cm2的面积，耗液1ml。如创面有污物或敷有其它药物应先用生理盐水冲洗干净，然后用同样的方法喷洒该药。一般采取暴露疗法。对易摩擦的创面及低温环境可采用湿敷包扎法。对感染创面将积脓或坏死组织清除，用湿敷法，创面干净后改为喷洒。
临床观察1、一般临床资料从1987年至1993年10月共治疗烧伤患者787例，男388例，占49.3％；女399例，占50.7％。最小年龄8个月，最大年龄65岁。烧伤面积在1～37％。II°烧伤756例，占96.06％，深II°烧伤31例，占3.94％。其中治疗烧伤灼伤3例。烧伤部位有头、面、颈、鼻、口、耳、前胸、后背、四肢、臀部、外生殖器、阴囊等。
2、治疗效果II°烧伤84.5％的在5-10天痊愈；15.6％在10-15天痊愈，其中有3％的继发感染(多为误伤痂皮)。深II°面积10％以内烧伤的患者，80.5％在15-20天痊愈，19.4％在15-30天痊愈。不经植皮也能进行无疤痕愈合。
本发明的生物制剂对不同烧伤因素、用药时间、止痛与痊愈的观察见表5。
表5 本发明生物制剂对烧伤的用药观察痛止痊愈烧伤烧伤 致伤至用 烧伤％时间时间备注因素部位 药时间例数(分)(天)沸液 四肢、前胸及时 200 25.4 5-10 2-5 脱痂、无疤痕蒸汽 后背、面等同上 同上 14～30分 105 13.3 5～155～10 同上同上 同上 1-7天 456 57.9 5～155～20 同上同上 同上 半月以上 6 0.8 10～20 15～30 同上赤铁 手、臀 及时 2 0.3 5～152～9同上火焰 面、背部 15分 5 0.6 40～45 2～4同上硝酸 眼、手 10～15分 2 0.3 10～15 2～620分钟消肿烧碱 阴囊 3天1 0.1 立即 8 脱薄皮一层同上 臀部 半月 1 0.1 立即 29 无疤痕电弧 手背、面 20分-1天 3 0.6 15 2～4无疤痕硫酸 脚面、上肢 6分-1天3 0.6 立即 3～6无疤痕沥青 手、足 1-4天 3 0.6 30 10 无疤痕从观察结果可以看出，烧伤创面用本发明生物制剂后10-20分钟止痛(火焰烧伤45分钟止痛)。痊愈与用药早晚有关，用药越早痊愈得越快。
对II°烧伤，就诊在烧伤后30分钟以内者，一般可在5-10天痊愈，脱薄皮一层，不留痕迹；烧伤已达6-48小时，创面形成水泡，有部分皮损者，治疗5-12天痊愈；烧伤已超过一周，经其它药物治疗效果不佳者，改用本发明生物制剂治疗，40％在10天内痊愈，45％在20天内痊愈，15％的(属残余创面)在30天内痊愈，且均无疤痕组织。
对化学灼伤、电弧伤的治疗，由于灼伤程度及就诊时间不同，治疗一般在2-30天痊愈，不留疤痕。
抗渗出的观察烧伤创面喷涂本发明生物制剂在半小时内，可见皮损创面浆液渗出减少，1小时左右排除浆液的水泡不再鼓起，二小时可看到I°创面红肿明显消失。用药后，创面无加深现象，表明本发明生物制剂有抗组织反应作用。
本发明生物制剂适用于开水、沸油、蒸汽、高温物体、火焰、火药、光电、强酸、强碱等各种理化因素引起的皮肉损伤。
本发明生物制剂的使用方法为1、清创(1)创面未感染化脓，并且未曾使用任何药物者，如属新鲜创面，可直接使用该药；如不属新鲜创面，可用生理盐水冲洗后使用该药。
(2)创面感染化脓者，先用少量3％双氧水清洗干净后再使用该药。
(3)创面已使用其他药物者，务必彻底清除后，方可使用该药。
2、处理水泡完整水泡采用低位剪口排除渗液，但要保护好水泡皮。较大的水泡可多剪几个口，将渗液加压排除，使泡皮紧贴创面。皱缩或污染的泡皮要剪除。
3、用药(1)涂布法用脱脂棉浸透药液，轻柔均匀地涂于创面，每日3-4次。该法适用于清洁、污染及结痂面。
(2)喷洒法用喷雾装置将药液均匀地喷洒于创面，以不流动为宜，每日3-6次。该法适用于清洁及结痂的创面。
实施例1
制备小叶杨叶粉、洋槐叶粉选用5至10月份小叶杨的树叶(带叶柄)，洋槐叶(带叶柄)，晒干，用小钢磨磨成40-60目粉，备用。
称取小叶杨粉3kg、洋槐叶粉2kg、玉米粉10kg、黄豆粉2kg、碳酸钠1kg置于容器中，加水适量，搅成膏状，放置半小时，加水1000kg，用5N NaOH调PH值达8.0，在充分搅拌下分装于玻罐中，容量350ml，接入原种35ml，30℃培养三天，白色菌膜形成，菌液清亮透明，菌体长链形成芽孢，用特异性颗粒计数法进行计数，数量达20亿/毫升，即制成CGMCC0601发酵液。按发酵液总量的1％加入苯酚，充分搅拌混合，以混合液总量为基数加入1％硅藻土作为助滤剂，搅拌1分钟，用7#帆布常压吊滤，收集清亮透明液体即为成品。
实施例2制备杨叶粉、槐叶粉选用5至10月份的杨树叶、槐树叶，晒干，用小钢磨磨成40-60目粉，备用。
称取杨叶粉2.5kg、槐叶粉3kg、玉米粉8kg、黄豆粉3kg、碳酸钠1kg，置于容器中，加水适量，搅成膏状，放置半小时，加水800kg，用5N NaOH调PH值达8.0，在充分搅拌下分装于玻罐中，容量350ml，接入原种30ml，30℃培养三天，白色菌膜形成，菌液清亮透明，菌体长链形成芽孢，用特异性颗粒计数法进行计数，数量达15亿/毫升，即制成CGMCC0601发酵液。按发酵液总量的0.5％加入苯酚，充分搅拌混合，以混合液总量为基数加入1％硅藻土作为助滤剂，搅拌1分钟，用7#帆布常压吊滤，收集清亮透明液体即为成品。
权利要求
1.一种用于治疗烧伤的生物制剂，其特征在于它含有蜡状芽孢杆菌CGMCC0601发酵液。
2.根据权利要求1所述的用于治疗烧伤的生物制剂，其特征在于所说的发酵液中加有0.5-1.0％的苯酚。
3.根据权利要求1所述的用于治疗烧伤的生物制剂，其特征在于所说的生物制剂与草酸钾反应生成等大、均匀、分散、有折光性的球状颗粒。
4.根据权利要求3所述的用于治疗烧伤的生物制剂，其特征在于所述的生物制剂每毫升含球状颗粒总数为10-20亿。
5.一种根据权利要求2所述的用于治疗烧伤的生物制剂的制备方法，其特征在于它包括有下列步骤a、制备培养基培养基含有杨叶粉25-35份，槐叶粉20-30份，玉米粉80-120份，黄豆粉20-30份，碳酸钠8-10份，加水至膏状，放置0.5-1小时，加水8000--10000份，用氢氧化钠调PH值为8.0-8.5，搅拌、封口，15P 20-30分钟灭菌；b、培养基温度降至28-32℃，按培养基容量的5-12％接入CGMCC0601菌种；30±1℃培养2-3天，至白色菌膜形成；c、加入0.5-1％的苯酚，搅拌，加入0.5--1％的助滤剂，过滤，收集清亮透明液体。
6.根据权利要求5所述的用于治疗烧伤的生物制剂的制备方法，其特征在于所说的杨叶粉是小叶杨叶粉。
7.根据权利要求5所述的用于治疗烧伤的生物制剂的制备方法，其特征在于所说的槐叶粉是洋槐叶粉。
全文摘要
本发明公开了一种治疗烧伤的生物制剂和生产该制剂的方法，该制剂含有蜡状芽孢杆菌CGMCC0601发酵液。它对烧伤创面的疼痛、渗出、感染、积浓、烧伤组织的进行性坏死以及深II°创面的疤痕性愈合有良好的疗效，使用本发明生物制剂可使烫伤表面干燥，渗出减少，能加快新生肉芽组织生长，促进烫伤组织愈合，同时具有刺激性小、止痛快、可有效控制感染、疗程短、不留疤痕等优点。
文档编号A61K35/74GK1399971SQ0112358
公开日2003年3月5日 申请日期2001年8月3日 优先权日2001年8月3日
发明者卢佩英 申请人:卢佩英