专利名称：人截短型重组可溶性trail－170蛋白及其在制备肿瘤治疗药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白及其在制备肿瘤治疗药物中的应用。
背景技术：
TRAIL(TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand)/Apo-2L是1995年发现的能诱导多种肿瘤细胞发生凋亡的细胞因子，属TNF超家族成员之一。人的TRAIL蛋白属于II型跨膜蛋白，它的一级结构由281个氨基酸组成，分子量为32kDa，其中胞浆区有17个氨基酸，跨膜区有21个氨基酸，胞外区则有243个氨基酸。
TRAIL蛋白的分布非常广泛，在心肌细胞、淋巴细胞、脾细胞、胸腺细胞、前列腺细胞、卵巢和小肠细胞上均有表达，但在正常的肝细胞、脑细胞和睾丸细胞上则不表达。TRAIL的胞外区可被金属蛋白酶割裂下来而成为可溶性的细胞因子，生物学功能研究证实，可溶性TRAIL蛋白可诱导不同来源的肿瘤细胞及病毒转化的细胞发生凋亡，包括肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、肾癌、中枢神经系统肿瘤、白血病、皮肤癌和多发性骨髓瘤细胞等。动物全身使用重组的可溶性TRAIL，可诱导所接种的肿瘤细胞发生凋亡、肿瘤生长受抑、提高荷瘤动物的存活期，而且在啮齿类和其它灵长类动物的体内实验中没有发现任何毒副作用。
目前国际上普遍使用的重组可溶性TRAIL包含一个氨基酸95～281的片段。该蛋白质分子量大、杀肿瘤细胞活性低，诱导50％细胞凋亡率的蛋白质浓度在200ng/ml以上。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有分子量小、活性高的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白；本发明的另一目的在于该人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白在制备肿瘤治疗药物中的应用。
本发明的技术方案如下本发明提供的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白是一个包含氨基酸112～281TRAIL蛋白的一个片段，在蛋白质一级结构中，N末端为脯氨酸，C末端为甘氨酸，含有11个精氨酸、6个组氨酸、11个赖氨酸、一个半胱氨酸，等电点PI＝9.27，为一碱性蛋白；人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白的二级结构中包含两个反向平行的β片层；该蛋白的cDNA序列有510个核苷酸组成，编码170个氨基酸。
该人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白的cDNA序列为序列1；该人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白的氨基酸序列为序列2。
本发明提供的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白在制备肿瘤治疗药物中的应用，即可用于制备肿瘤治疗药物。
本发明提供的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白能显著诱导肿瘤细胞凋亡，杀死或/和抑制动物体内肿瘤细胞的生长；与国际上普遍使用的TRAIL95～281片段比较，TRAIL112～281具有分子量小、杀肿瘤细胞活性高(诱导50％细胞凋亡率的蛋白质浓度在10ng/ml左右)的特点，比TRAIL95～281蛋白的杀肿瘤细胞活性高20倍，是一个值得开发的潜在的抗肿瘤药物。
本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白的制备如下1.构建pGEX-4T-TRAIL-170质粒载体根据已知的人TRAIL cDNA序列，设计了上游和下游两条寡聚核苷酸引物，上游引物为CGG AAT TCC CCT AGT GAG AGA AAG AGG；下游引物为CGG AAT TCTTAA CCA ACT AAA AAG GCC CC；以pSectagA-TRAIL为模板，用PCR方法扩增长度为510bp的TRAIL cDNA片段；将PCR产物进行回收、纯化，用T4 DNA Ligase连接过夜，克隆至pGEX-4T载体中，构建成pGEX-4T-TRAIL170质粒载体(图1，图1为pGEX-4T-TRAIL170质粒载体的构建示意图)；2.将该质粒转化DH5α菌，筛选阳性克隆，得到表达人截短型重组可溶性TRAIL-170质粒的菌株，从菌株中提取质粒，将得到的质粒在3100测序仪上进行测序及DNA序列分析，结果证明该质粒的cDNA序列与Gene Bank登录的TRAILcDNA全长序列中的421～930碱基序列完全相同；将pGEX-4T-TRAIL-170质粒转化BL21大肠杆菌，加入IPTG(50μM)，在30℃振荡培养4小时，6000rpm离心10min，弃上清，PBS混悬细菌沉淀，加入溶菌酶(100μg/ml)，冰浴后超声波裂解菌体，16000rpm离心30min，收集上清，过谷胱甘肽-Sepharose-4B柱，再经凝血酶酶切，收集切割下来的蛋白溶液；该蛋白溶液即为本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白；经SDS-PAGE电泳显示，所得的TRAIL-170蛋白纯度为85％以上，见图2，图2为本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白在大肠杆菌的表达和纯化的电泳图，图2中，1为未诱导的BL21菌株，2为诱导的BL21菌株，3为包涵体，4为纯化的TRAIL-170蛋白，5为GST蛋白，6为中分子量蛋白标准，由图2可知，本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白纯度为85％以上；经测定，本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白的生物学特性为本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白是一个包含氨基酸112-281 TRAIL蛋白的一个片段，在蛋白质一级结构中，N末端为脯氨酸，C末端为甘氨酸，含有11个精氨酸、6个组氨酸、11个赖氨酸、一个半胱氨酸，等电点PI＝9.27，为一碱性蛋白；该蛋白的二级结构中包含两个反向平行的β片层；该人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白的cDNA序列由510个核苷酸组成，编码170个氨基酸；本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白的cDNA序列为序列1；本发明人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白的氨基酸序列为序列2。
附图1为pGEX-4T-TRAIL-170质粒载体的构建示意图；附图2为本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白在大肠杆菌的表达和纯化的电泳图；1为未诱导的BL21菌株 2为诱导的BL21菌株3为包涵体5为GST蛋白4为纯化的本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白6为中分子量蛋白标准附图3-1至图3-8为本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白诱导Jurkat细胞凋亡的流式细胞术检测示意图，呈现剂量依赖性关系；本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白处理组可显著诱导肿瘤细胞的凋亡；其中附图3-1未用TRAIL-170蛋白处理的Jurkat细胞对照组，细胞的凋亡率为21.5％；附图3-2100ng/ml TRAIL-170蛋白处理的Jurkat细胞凋亡，细胞凋亡率为89.55％；附图3-350ng/ml TRAIL-170蛋白处理的Jurkat细胞凋亡，细胞凋亡率为86.55％；附图3-4..25ng/ml TRAIL-170蛋白处理的Jurkat细胞凋亡，细胞凋亡率为82.53％；附图3-512.5ng/ml TRAIL-170蛋白处理的Jurkat细胞凋亡，细胞凋亡率为79.53％；附图3-66.25ng/ml TRAIL-170蛋白处理的Jurkat细胞凋亡，细胞凋亡率为66.68％；附图3-73.125ng/ml TRAIL-170蛋白处理的Jurkat细胞凋亡，细胞凋亡率为57.19％；附图3-81.56ng/ml TRAIL-170蛋白处理的Jurkat细胞凋亡，细胞凋亡率为45.53％；附图4-1至图4-8为本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白诱导MCF7细胞凋亡的流式细胞检测示意图；本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白处理组可显著诱导肿瘤细胞的凋亡；附图4-1未用TRAIL-170蛋白处理的MCF7细胞对照组，细胞的凋亡率为6.36％；附图4-21000ng/ml TRAIL-170蛋白处理的MCF7细胞凋亡，细胞凋亡率为67.01％；附图4-3500ng/ml TRAIL-170蛋白处理的MCF7细胞凋亡，细胞凋亡率为55.29％；附图4-4250ng/ml TRAIL-170蛋白处理的MCF7细胞凋亡，细胞凋亡率为48.85％；附图4-5100ng/ml TRAIL-170蛋白处理的MCF7细胞凋亡，细胞凋亡率为44.35％；附图4-650ng/ml TRAIL-170蛋白处理的MCF7细胞凋亡，细胞凋亡率为40.13％；附图4-725ng/ml TRAIL-170蛋白处理的MCF7细胞凋亡，细胞凋亡率为23.05％；附图4-812.5ng/ml TRAIL-170蛋白处理的MCF7细胞凋亡，细胞凋亡率为17.81％；附图5为PBS组和本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白处理组的肿瘤重量比较示意图；本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白处理组可显著抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长，p＝0.049＜0.05；附图6为PBS组和本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白处理组的肿瘤大小比较示意图；本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白处理组可显著抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长，p＝0.023＜0.05。
具体实施例方式
实施例1，本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白具有杀伤肿瘤细胞作用的实验将纯化的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白处理各种不同的肿瘤细胞系，如Jurkat细胞系(人T淋巴细胞白血病细胞)、MCF-7细胞系(人乳腺癌细胞)、KU-8细胞系(人阴茎癌细胞)、U937细胞系(人髓样白血病细胞)、NCI-H929细胞系和IM-9细胞系(人骨髓瘤细胞)，以FITC-Annexin V和PI染色为细胞凋亡的检测指标，流式细胞术分析TRAIL-170诱导肿瘤细胞凋亡的情况，结果证明，TRAIL-170具有广泛的杀伤肿瘤细胞的作用，但不同类型的肿瘤细胞敏感程度不一样，其中，Jurkat细胞系和MCF-7细胞系对TRAIL-170的敏感性最高，诱导Jurkat细胞50％凋亡率的TRAIL170蛋白浓度在10ng/ml左右，见附图3-1至附图3-8和附图4-1至附图4-8；附图3-1至图3-8为本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白诱导Jurkat细胞凋亡的流式细胞术检测示意图，呈现剂量依赖性关系；其中附图3-1未用TRAIL-170蛋白处理的Jurkat细胞对照组，细胞的凋亡率为21.5％；附图3-2100ng/ml TRAIL-170蛋白处理的Jurkat细胞凋亡，细胞凋亡率为89.55％；附图3-350ng/ml TRAIL-170蛋白处理的Jurkat细胞凋亡，细胞凋亡率为86.55％；附图3-425ng/ml TRAIL-170蛋白处理的Jurkat细胞凋亡，细胞凋亡率为82.53％；附图3-512.5ng/ml TRAIL-170蛋白处理的Jurkat细胞凋亡，细胞凋亡率为79.53％；附图3-66.25ng/ml TRAIL-170蛋白处理的Jurkat细胞凋亡，细胞凋亡率为66.68％；附图3-73.125ng/ml TRAIL-170蛋白处理的Jurkat细胞凋亡，细胞凋亡率为57.19％；附图3-81.56ng/ml TRAIL-170蛋白处理的Jurkat细胞凋亡，细胞凋亡率为45.53％；本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白处理组可显著诱导肿瘤细胞的凋亡；附图4-1至图4-8为本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白诱导MCF7细胞凋亡的流式细胞检测示意图；其中附图4-1未用TRAIL-170蛋白处理的MCF7细胞对照组，细胞的凋亡率为6.36％；附图4-21000ng/ml TRAIL-170蛋白处理的MCF7细胞凋亡，细胞凋亡率为67.01％；附图4-3；500ng/ml TRAIL-170蛋白处理的MCF7细胞凋亡，细胞凋亡率为55.29％附图4-4250ng/ml TRAIL-170蛋白处理的MCF7细胞凋亡，细胞凋亡率为48.85％；附图4-5100ng/ml TRAIL-170蛋白处理的MCF7细胞凋亡，细胞凋亡率为44.35％；附图4-650ng/ml TRAIL-170蛋白处理的MCF7细胞凋亡，细胞凋亡率为40.13％；附图4-725ng/ml TRAIL-170蛋白处理的MCF7细胞凋亡，细胞凋亡率为23.05％；附图4-812.5ng/ml TRAIL-170蛋白处理的MCF7细胞凋亡，细胞凋亡率为17.81％；本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白处理组可显著诱导肿瘤细胞的凋亡；实施例2，本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白具有杀伤小鼠体内肿瘤细胞的作用的实验实验用动物Balb/C小鼠，共10只，分成两组，每组5只，一组为PBS阴性对照，另一组为TRAIL-170蛋白处理组；将体外培养的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0细胞，4×106/只)连同TRAIL-170蛋白(100μg/只)或PBS，注射于小鼠背部皮下，5天后同剂量TRAIL-170蛋白或PBS加强注射，21天后处死小鼠，测量形成肿瘤的大小和重量，结果显示，PBS组小鼠背部均有肿瘤生长，且大小均匀，而TRAIL-170蛋白处理的小鼠有两只背部未长肿瘤，一只肿瘤较小，两只肿瘤的大小同PBS组，将两组的数据进行t检验，证明二者有显著性差异，见附图5和附图6，附图5为PBS组和本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白处理组的肿瘤重量比较示意图；本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白处理组可显著抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长，p＝0.049＜0.05；附图6为PBS组和本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白处理组的肿瘤大小比较示意图；本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白处理组可显著抑制小鼠体内肿瘤细胞的生长，p＝0.023＜0.05；说明TRAIL-170蛋白在体内可以发挥杀肿瘤细胞作用，抑制肿瘤的生长。
本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白的cDNA序列为序列1cccctagtga gagaaagagg tcctcagaga gtagcagctc acataactgggaccagagga agaagcaaca cattgtcttc tccaaactcc aagaatgaaaaggctctggg ccgcaaaata aactcctggg aatcatcaag gagtgggcattcattcctga gcaacttgca cttgaggaat ggtgaactgg tcatccatgaaaaagggttt tactacatct attcccaaac atactttcga tttcaggaggaaataaaaga aaacacaaag aacgacaaac aaatggtcca atatatttacaaatacacaa gttatcctga ccctatattg ttgatgaaaa gtgctagaaatagttgttgg tctaaagatg cagaatatgg actctattcc atctatcaagggggaatatt tgagcttaag gaaaatgaca gaatttttgt ttctgtaacaaatgagcact tgatagacat ggaccatgaa gccagttttt tcggggcctttttagttggc本发明的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白的氨基酸序列为序列2Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His IleThr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn SerLys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu SerSer Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg AsnGly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr SerGln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr LysAsn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser TyrPro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys TrpSer Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly GlyIle Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val ThrAsn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe GlyAla Phe Leu Val Gly
权利要求
1.一种人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白，其特征在于，该蛋白包含氨基酸112-281 TRAIL蛋白的一个片段，在蛋白质一级结构中，N末端为脯氨酸，C末端为甘氨酸，含有11个精氨酸、6个组氨酸、11个赖氨酸、一个半胱氨酸，等电点PI＝9.27，为一碱性蛋白；该蛋白质的二级结构中包含两个反向平行的β片层；TRAIL-170蛋白的cDNA序列由510个核苷酸组成，编码170个氨基酸。
2.按权利要求1所述的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白，其特征在于，该人截短型重组可溶性TRAIL-170的cDNA序列为cccctagtga gagaaagagg tcctcagaga gtagcagctc acataactgggaccagagga agaagcaaca cattgtcttc tccaaactcc aagaatgaaaaggctctggg ccgcaaaata aactcctggg aatcatcaag gagtgggcattcattcctga gcaacttgca cttgaggaat ggtgaactgg tcatccatgaaaaagggttt tactacatct attcccaaac atactttcga tttcaggaggaaataaaaga aaacacaaag aacgacaaac aaatggtcca atatatttacaaatacacaa gttatcctga ccctatattg ttgatgaaaa gtgctagaaatagttgttgg tctaaagatg cagaatatgg actctattcc atctatcaagggggaatatt tgagcttaag gaaaatgaca gaatttttgt ttctgtaacaaatgagcact tgatagacat ggaccatgaa gccagttttt tcggggcctttttagttggc该人截短型重组可溶性TRAIL-170的氨基酸序列为Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His IleThr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn SerLys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu SerSer Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg AsnGly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr SerGln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr LysAsn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser TyrPro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys TrpSer Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly GlyIle Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val ThrAsn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe GlyAla Phe Leu Val Gly
3一种权利要求1所述的人截短型重组可溶性TRAIL-170蛋白在制备肿瘤治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明的人截短型重组可溶性TRAIL－170蛋白是一个包含氨基酸112－281 TRAIL蛋白的一个片段，在蛋白质一级结构中，N末端为脯氨酸，C末端为甘氨酸，含有11个精氨酸、6个组氨酸、11个赖氨酸、一个半胱氨酸，等电点PI＝9.27，为一碱性蛋白；该蛋白质的二级结构中包含两个反向平行的β片层；该蛋白的cDNA序列由510个核苷酸组成，编码170个氨基酸；该蛋白能够显著诱导肿瘤细胞的凋亡，杀死或/和抑制动物体内肿瘤细胞的生长，与国际上普遍使用的TRAIL
文档编号A61P35/00GK1448405SQ0211626
公开日2003年10月15日 申请日期2002年3月28日 优先权日2002年3月28日
发明者陈佺, 陈英玉, 马大龙, 韩文玲, 金海京, 王晓慧, 李现亭, 史须 申请人:中国科学院动物研究所, 北京大学