专利名称：一类缩聚氨基酸配位的sod模拟物的制作方法
人们就天然超氧化物歧化酶(SOD)已经做了大量的研究，它可以专一地清除生物体内的超氧阴离子自由基(O2·-) ，使其迅速转变为无毒的物质，从而可预防活性氧中毒、抗衰老和减少癌症等疾病的发生。但是，由于天然SOD自身分子量大、不易透过细胞膜、在生物体内半衰期短及其有异体抗原性、价格昂贵等缺点，在实际应用过程中受到很大限制。
从SOD的活性中心出发，用各种氨基酸、Schiff碱等各类配体与Cu、Fe、Mn等金属离子形成配合物来模拟SOD是当前研究的热点。在模拟SOD的工作中已从简单模拟SOD活性中心发展到整体模拟，整体模拟的优点在于能够提供类似于酶的疏水微环境，以此来提高SOD的活性。将氨基酸分子修饰，如在氨基酸分子氮原子上引入疏水长链基团十二酰基再与金属离子配合，得到了有较高活性的SOD模拟物质。大量的SOD模拟物的研究工作，已经筛选出了许多在实验室及临床试验阶段具有SOD样活性的物质。
然而，目前SOD模拟物还没有真正地应用于实际之中。其原因主要是所制备的模拟物距离实际应用相差较远，比如模拟物的毒性检验、致癌、致畸、致突变实验以及药物代谢动力学等工作都需要有进行，只有具备这些可靠的数据，才能够逐步进入应用阶段。另外，SOD模拟物的溶解性、稳定性也限制了其应用范围。
在众多SOD模拟物的研究过程中表明，铜离子与各类配体形成的化合物，其SOD样活性一般都高于铁、锰、锌离子与配体形成的模拟物质。最近我们通过动物急性毒性实验发现，甘氨酸铜、谷氨酸铜、以及氯灭酸铜和双氯芬酸铜配合物，其小白鼠一次性口服半致死量(LD50)都小于500mg/Kg，属于低毒和中等毒性物质。氨基酸为无毒物质，引入铜离子以后明显表现出毒性，而氯灭酸和双氯芬酸为抗炎镇痛药物，和铜离子配合以后也表现出与氨基酸铜配合物类似大小的毒性。这说明尽管配体无毒或微毒，但引入铜离子后的毒性是不可忽视的。由此可见，虽然铜是人的生命元素之一，但是过量摄入铜离子也会对机体造成损伤。以铜为中心离子的SOD模拟物有一定的应用价值，但如果作为人体内服或者外用的药用酶必然要受到毒性大小的限制。
铁、锰、锌与氨基酸形成配合物后基本属于无毒，通过动物急性毒性实验表明其LD50都较大，例如半胱氨酸铁、酪氨酸铁配合物的数值都在5000mg/Kg以上。慢性动物毒性实验也表明，低剂量的氨基酸铁配合物对动物机体没有损伤。通过动物药物代谢动力学实验还可以看到，这类物质可以被动物机体吸收，并且可以增加其体内的SOD含量水平，所以这类铁氨基酸配合物具有较好的应用价值。然而由这些配体制备的SOD模拟物也有明显水溶性较差的不足之处，有的物质甚至脂溶性也不好，这就造成了实际应用的局限性。如果采用乙醇等有机溶剂作为辅助溶剂来增加其水溶性，可以克服这方面的不足，但是乙醇、丙酮等有机溶剂都有明显降低其SOD样活性的作用，使其清除O2·-的能力降低，而且与其使用量呈正相关。中国专利CN1138587A、CN1225631A以小分子为模型的SOD模拟物，其结构与天然SOD相差较远为出发点，公布了用富咪唑氮配位和含氮大环配位体形成的铜、铁、锰合物，这些配合物有一定的SOD样活性，但也存在上述的不足之处。因此筛选无毒、高活性、水溶性好且与天然SOD结构接近的模拟物是最佳的选择。
本发明的特征在于，制备的缩聚天冬氨酸金属SOD模拟物具有水溶性好、无毒、分子量适中等特点，有广阔的应用前景。
缩聚天冬氨酸无毒、可生物降解，通过聚合过程的控制其平均分子量可在不同的范围进行选择。缩聚天冬氨酸是新型的水溶性高分子，目前可以大量生产，已作为絮凝剂等应用于不同的领域之中。
作为配体，我们使用的天冬氨酸缩聚物不溶于水和其他常用有机溶剂，可溶于碱性水溶液(pH≥8.5)。为避免在制备过程中引入外来金属阳离子而给后来的分离提纯造成麻烦，我们采用1mol/L的氨水作为溶剂，在碱性条件下天冬氨酸缩聚物溶解后发生水解，水解后缩聚物的环状链节被打开成链状链节，溶液呈深红色，pH为9.5。为避免其与金属离子配合时有氢氧化物生成，配合前用盐酸溶液将该溶液调至pH＜7，缩聚天冬氨酸仍为酸的形式。天冬氨酸缩合物的碱性水解过程可以表示为 我们使用平均分子量为3000的缩聚天冬氨酸为配体与金属离子反应，在不考虑缩聚物聚合度大小的情况下，认为一个二价金属离子可以和两个缩聚物的链节结合。在投料时选取二价金属与缩聚物的链节摩尔比为1∶2～1.5∶2，增大金属盐的比例可增加产率同时也有利于反应后的分离提纯。
为防止亚铁离子氧化，可以在氮气保护的条件下进行反应。使用氮气为保护剂，有时会在实际生产过程中产生麻烦。我们采取在酸性条件下加入与硫酸亚铁等摩尔的盐酸羟胺为保护剂，也获得了较好的效果。
升高反应温度可增加反应速度，我们采取反应可在60～100℃的温度下进行。增加反应时间可以提高产率，从经济等各因素考虑，反应时间选取6～8小时为宜。
随着反应的进行，产物逐渐增加，但是缩聚天冬氨酸金属配合物在水溶液中有很好的溶解性，整个反应过程中体系没有明显的相变化。反应体系温度降到室温以后也没有发现反应物和产物的溶解度有较大的差异。将反应体系于4℃的条件下隔夜后有沉淀析出，经差热分析沉淀物不同于反应物。
在pH为7.8的条件下，用改进的氮蓝四唑(NBT)光照法测定了本发明的SOD模拟物催化O2·-歧化反应的活性。不同浓度的天然SOD和缩聚天冬氨酸金属配合物对O2·-抑制率见表1。天然SOD或模拟物对O2·抑制率越大，则说明其SOD样活性越高。从表1可以看出，天然SOD和模拟物在以g/L的浓度计量时，缩聚天冬氨酸亚铁的活性比天然SOD的活性略低，缩聚天冬氨酸锰的活性与天然相当，而且都是随其浓度降低而减小，这说明其有类似的SOD样活性。
表1.不同浓度天然SOD和聚天冬氨酸金属配合物对O2·-的抑制率浓度(g/mL)天然SOD缩聚天冬氨酸亚铁缩聚天冬氨酸锰10-584.5 74.484.310-676.8 53.871.710-748.9 35.458.710-832.2 12.136.310-916.0 7.2 14.5用PE-240C元素分析仪对缩聚天冬氨酸金属配合物的碳、氢、氮元素含量进行了分析，结果显示两种配合物的测定结果与其理论值基本相符(结果见表2)，这表明其分子组成与预期设想的基本一致。
表2.缩聚天冬氨亚铁的元素分析结果缩聚天冬氨酸亚铁 缩聚天冬氨酸锰分子式(C8H8O6N2Fe)n 链节量284 分子式(C8H8O6N2Mn)n 链节量283实测值 理论值 实测值 理论值C/％ 33.10 33.8033.25 33.92H/％ 3.04 2.83 2.97 2.83N/％ 10.15 9.86 9.45 9.90经红外光谱测定，天冬氨酸聚合物亚铁的红外吸收为3344cm-1强吸收(-NH伸缩振动)；1665cm-1(-COO-)；1544cm-1(-NH弯曲振动)；1414cm-1；586cm-1。缩聚天冬氨酸锰的红外吸收为3278cm-1(-NH伸缩振动)；1667cm-1(-COO-)；1443cm-1；1140cm-1；1082cm-1。
与缩聚天冬氨酸钠盐相比原来3300cm-1附近的-NH伸缩峰和-COO-峰的位置基本没有变化，聚天冬氨酸锰的-NH弯曲振动峰消失，聚天冬氨酸亚铁中-NH弯曲振动峰也有所减弱，这说明金属离子(M)与-NH上的N可能有配位作用。再结合元素分析，初步推断这两种物质可能为内配盐结构 本发明所涉及的缩聚氨基酸配合物有望进一步通过一系列的药理、毒理和三致实验的检测，从而取代天然SOD在医药、化妆品、食品、保健品以及饲料等多方面添加剂的应用。
发明实施例1称取平均分子量为3000的天冬氨酸缩聚物2.0g溶于15mL 1mol/L的氨水中，溶液呈深红色透明溶液，用10mol/L的盐酸溶液调节pH值为4。另称取硫酸亚铁1.5g和等摩尔的盐酸羟胺溶于15mL蒸馏水中。将两种溶液混合于250mL磨口三角瓶中，混合后体系仍为深红色透明溶液，将反应体系置于恒温水浴锅中，逐渐升温至80℃，磁力搅拌6小时后取出，体系仍为深红色透明溶液，冷却至室温。在4℃条件过夜后有絮状悬浮物出现，抽滤后的沉淀物用蒸馏水洗两次，自然风干后得淡橘色粉末，产率约50％。
发明实施例2称取天冬氨酸聚合物2.0g溶于15mL 1mol/L的氨水中，用10mol/L的盐酸溶液调节pH值为7。另称取硫酸锰1.7g溶于15mL蒸馏水中。将两种溶液混合于250mL磨口三角瓶中，混合后体系为深红色透明溶液，磁力搅拌回流6小时后取出，体系仍为深红色透明溶液，冷却至室温。在4℃条件过夜后有絮状悬浮物出现，抽滤后的沉淀物用蒸馏水洗两次，自然风干得白色粉末。产率约60％。
权利要求
1.一类超氧化物歧化酶(SOD)模拟物的制备，其特征在于用氨基酸缩聚物为配体在水溶液中与金属离子配合反应而得。首先用碱性水溶液溶解氨基酸缩聚物，用酸中和到中性后再加入金属盐溶液回流反应，反应时间4～8小时，反应温度60～100℃，金属离子与缩聚氨基酸链节的摩尔比为1∶2～1.5∶2。
2.根据权利要求1所述的SOD模拟物的制备，其特征在于缩聚氨基酸采用缩聚天冬氨酸。
3.根据权利要求1、2所述SOD模拟物的制备，其特征在于缩聚氨基酸溶解于氨的碱性水溶液中，用酸中和后再与金属离子反应。
4.根据权利要求1、2、3所述的SOD模拟物的制备，其特征在于金属离子采用二价铁、二价锰的可溶性盐。
5.根据权利要求1、2、3、4所述的SOD模拟物的制备，其特征在于酸性条件下采用盐酸羟胺保护亚铁离子不被氧化。
全文摘要
用氨基酸缩合物作为配体与不同二价金属离子在水溶液中制备了一类缩聚氨基酸金属配合物——缩聚天冬氨酸亚铁配合物和缩聚天冬氨酸锰配合物。首先将缩聚天冬氨酸溶解于氨水中后，在调节pH为中性条件加入硫酸锰溶液回流反应得到缩聚天冬氨酸锰配合物；在酸性的条件下加入硫酸硫酸亚铁和硫酸亚铁等摩尔的盐酸羟胺，回流反应得到缩聚天冬氨酸亚铁配合物。通过元素分析、红外光谱对配合物进行了化学组成与结构表征，并利用改进的氮蓝四唑(NBT)光照法测定了其催化O
文档编号A61K38/44GK1465697SQ0212498
公开日2004年1月7日 申请日期2002年6月29日 优先权日2002年6月29日
发明者李金 , 刘京萍, 巫丽坤, 李 金 申请人:北京联合大学职业技术师范学院