专利名称：一种杀菌制剂和杀菌湿巾及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种杀菌制剂和杀菌材料，尤其涉及一种杀灭引起奶牛乳腺感染的细菌的制剂和杀菌湿巾。
背景技术：
奶牛乳腺感染主要由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌、绿脓杆菌等引起，畜群调查表明，美国30％到70％的母牛至少有一个被感染的乳区。奶牛乳腺感染引发的乳腺炎，使奶牛每天产奶量损失0.5千克，减少的产奶量被估计为乳腺炎总损失的69％-80％。美国奶牛业每年因乳腺炎引起的直接损失超过20亿美元。可见，乳腺炎对乳业的经济影响是巨大的。
国内外常以大剂量的抗生素(如青霉素、链霉素、庆大霉素、氯霉素、新霉素等)治疗奶牛乳腺感染，抗生素虽有一定的疗效，但由于上述致病菌大都产生了耐药性菌株，因此，疗效并不明显。反而造成牛奶中抗生素残留，将这些牛所产生的奶混入食用牛奶造成的后果是严重的。联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)都建议，在奶牛接受抗生素治疗停药后至少3天内挤出的奶汁，不直接作为食用的奶原料(最好要停药5-7天)。而目前世界上对付乳腺炎除了使用抗生素别无它药。
美国专利US 5762948公开了一种预防和治疗奶牛乳腺感染的湿巾，其成分以一种抗菌肽nisin为主，辅以酒精等其他抗菌成分。该湿巾能去除引起乳腺感染的各种致病菌，但对耐药性金黄色葡萄球菌的效果不明显，同时由于抗菌肽的合成工艺复杂，生产成本高，难以推广应用。
发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是提供一种杀灭引起奶牛乳腺感染的细菌的制剂，以克服现有技术存在的上述缺陷；本发明需要解决的技术问题之二是提供一种杀灭引起奶牛乳腺感染的细菌的杀菌湿巾。
本发明需要解决的技术问题之三是提供一种杀菌湿巾的制备方法。
本发明需要解决的另一个技术问题公开所述杀菌湿巾的应用。
本发明的发明构思是这样的溶葡萄球菌酶(1ysostaphin)是一种含锌的金属蛋白酶，专一降解细胞壁的甘氨酸肽键，能裂解金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌的细胞壁，从而起到彻底杀死细菌的目的，不易产生耐药性，尤其对耐药性金黄色葡萄球菌等难以根除的致病菌的效果非常好。但溶葡萄球菌酶只对革兰氏阳性菌有效，而引起奶牛乳腺感染的细菌除革兰氏阳性菌外，革兰氏阴性菌也占了一定的比例，如大肠杆菌等，所以发明人将溶菌酶和溶葡萄球菌酶进行复配，溶菌酶能裂解细菌胞壁的β-1，4糖苷键，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有杀灭作用，同时溶菌酶除了拓宽了杀菌谱之外，还能加强溶葡球菌酶的杀菌作用。两种酶都属于蛋白质，没有刺激也不会产生任何毒副作用，同时由于生产成本低，价格不贵。
消除和控制奶牛乳腺感染较有效的办法是杀灭引起感染的各种细菌，特别是乳区的各种致病菌，不但引起自身的乳腺感染，同时还会传染给其它的奶牛。发明人经过多次试验，将溶葡萄球菌酶和溶菌酶按一定比例复配，并以此为原料制成的杀菌湿巾，可以简便有效的杀灭奶牛乳区的各种致病菌，消除感染，同时还能起到防止复发和预防的作用。
本发明的技术方案是这样的一种杀菌制剂，包括溶葡萄球菌酶0.0001～0.1wt％，溶菌酶10～50wt％，稳定剂1～15wt％，表面活性剂0.1～0.5wt％，水余量。
所述及的稳定剂包括聚乙二醇或壳聚糖中的一种，其主要作用是保持酶在水溶液状态下的稳定性，即保持酶的活性。
所述及的表面活性剂包括非离子表面活性剂或两性离子表面活性剂，优选的为20≥HLB≥6，如聚山梨醇酯系列，包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80等以及甜菜碱等，其主要作用是去除奶牛乳区的污垢，使制剂中的活性成分充分作用于皮肤表面，有利于吸收。
可将上述的杀菌制剂负载于载体上，制成一种杀菌湿巾，载体包括无纺材料或棉纱布。
所述及的杀菌湿巾的制备方法包括如下步骤1、按上述比例称取溶葡萄球菌酶、溶菌酶，稳定剂和表面活性剂与水混合；2、将配制好的溶液喷涂于所需规格的载体上或将载体浸渍于溶液中，取出，即获得本发明的杀菌湿巾。
本发明的制剂和杀菌湿巾用于杀灭引起奶牛乳腺感染的各种细菌，包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。特别是大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和化脓棒状杆菌。可以治疗由这些细菌引起的各种乳腺炎，也可以预防乳腺炎的发生。
可将本发明的制剂和湿巾在产奶前、后通过涂抹或擦拭奶牛乳区，进行消毒，保证乳区的清洁，减少感染的可能性。
可将本发明的制剂或杀菌湿巾涂抹或覆盖于奶牛的发生感染的乳区，其剂量可根据奶牛的年龄、病情决定，一般为每日两次。
杀菌湿巾通过体外杀菌试验，证明它对引起奶牛乳腺感染的主要病原菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、化脓棒状杆菌的杀菌效果十分理想，杀灭率均超过99％。
杀菌湿巾对昆明小白鼠的急性毒性试验结果表明，动物经肌注7天后，无异常反应，活动正常。经7天观察，60只小白鼠全部存活。证明无毒性作用。
杀菌湿巾对SD大鼠阴道黏膜刺激试验，参照消毒技术规范(第三版)1999.11中皮肤刺激反应强度的评分标准评分及皮肤刺激强度分级，进行对阴道黏膜刺激强度的评定。结果表明，杀菌湿巾对大鼠阴道黏膜刺激反应最高总积分均值为0，属无刺激性。
杀菌湿巾对乳区急性感染的治疗试验，并用青霉素G钾和链霉素作为对照，给药7天后，结果表明，杀菌湿巾能有效杀灭引起乳腺感染的各种病原菌，尤其对金黄色葡萄球菌特别有效，而两种抗生素则不能有效的去除乳区的病原菌。
杀菌湿巾预防乳腺感染的试验，可以看出，杀菌湿巾能有效的预防奶牛乳区受到细菌感染，可以保持乳区的清洁。
具体实施例方式
实施例1杀菌湿巾的制备1.配制100g用于杀菌湿巾的溶液，其中溶葡萄球菌酶含量0.001g(0.001wt％)，溶菌酶含量20g(20wt％)，聚乙二醇含量3g(3％)，聚梨山醇酯20含量0.2g(0.2wt％)。
2.对桌面、仪器、器皿、配料桶消毒。
3.在电子天平上准确称取溶葡萄球菌酶、溶菌酶、聚乙二醇和聚梨山醇酯20，置于配料桶中，按比例加水76.80g，搅拌均匀，并加热至60℃溶解，即为所需溶液。
4.将无纺布剪裁成8cm×8cm，经过紫外光消毒20分钟后，浸入上述溶液中，待浸透后捞出，滴去多余溶液，即可使用。
实施例2杀菌湿巾体外杀菌试验1、试验样品的制备(1)杀菌湿巾样品按实施例1的方法制备，其中溶葡萄球菌酶含量0.001wt％，溶菌酶含量20wt％，聚乙二醇含量3％，聚梨山醇酯20含量0.2wt％。
(2)对照湿巾其中聚乙二醇含量3％，聚梨山醇酯20含量0.2wt％。
2、试验菌株金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、大肠杆菌和化脓棒状杆菌(以上菌株来自于沈阳军区军马防治研究所)。
3、试验步骤(1)将培养好的试验菌株用1％蛋白胨PBS洗下新鲜斜面，并稀释到适宜浓度，在107～108cfu/ml。
(2)将样品湿巾和对照湿巾制成1×3cm大小，并放置在无菌平皿中。
(3)取20ul菌液滴加到湿巾上，涂抹均匀同时开始计时。
(4)作用到预定时间后用无菌镊子将湿巾投入含5ml中和剂的试管中，充分振荡混匀。
(5)对照湿巾投入中和剂试管，充分振荡后做适当稀释。
(6)取终液0.5ml进行倾注平板，37恒温倒置培养48小时。
(7)计算对照回收菌量及样品回收菌量，得出杀灭率。
4、试验结果表1杀菌湿巾体外杀菌试验杀灭率结果试验菌株杀菌湿巾对照湿巾大肠杆菌 99.92％ 0金黄色葡萄球菌 99.98％ 0无乳链球菌 99.92％ 0停乳链球菌 99.97％ 0乳房链球菌 99.56％ 0化脓棒状杆菌 99.46％ 0实施例3杀菌湿巾体外杀菌试验1、试验样品的制备(1)杀菌湿巾样品按实施例1的方法制备，其中溶葡萄球菌酶含量0.001wt％，溶菌酶含量20wt％，聚乙二醇含量3％，甜菜碱含量0.2wt％。
(2)对照湿巾其中聚乙二醇含量3％，甜菜碱含量0.2wt％。
2、试验菌株金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、大肠杆菌和化脓棒状杆菌(以上菌株来自于沈阳军区军马防治研究所)。
3、试验步骤按实施例2进行。
4、试验结果表2杀菌湿巾体外杀菌试验杀灭率结果试验菌株杀菌湿巾对照湿巾大肠杆菌99.95％0金黄色葡萄球菌 99.97％0无乳链球菌 99.95％0停乳链球菌 99.98％0乳房链球菌 99.62％0化脓棒状杆菌99.67％0实施例4动物体内急性毒性试验1、样品的制备按实施例1中的方法配制杀菌湿巾所需的溶液，其中其中溶葡萄球菌酶含量0.01wt％，溶菌酶含量30wt％，聚乙二醇含量5％，聚梨山醇酯20含量0.3wt％。
2、试验动物采用昆明小白鼠60只，雌雄各半，体重33.5±0.25g，由复旦大学实验动物部提供。
3、试验方法每日一次连续7天经肌注小白鼠，观察动物在最大剂量下毒性反应。实验结果表明，动物经肌注7天后，无异常反应，活动正常。经7天观察，60只小白鼠全部存活。证明无毒性作用。
实施例5杀菌湿巾对试验动物阴道黏膜刺激试验1、样品制备杀菌湿巾的制备方法参照实施例1，其中其中溶葡萄球菌酶含量0.001wt％，溶菌酶含量20wt％，聚乙二醇含量3％，聚梨山醇酯20含量0.2wt％。
2、试验动物SD大鼠，雌性，普通级，18只，体重230克-250克，随机分三组，杀菌湿巾组、赋形剂组和空白对照组，每组6只，由复旦大学实验动物部提供。
3、试验方法参照消毒技术规范(第三版)1999.11中的3.8条。将杀菌湿巾置动物阴道内，与阴道黏膜接触4小时。赋形剂组用棉条0.01克浸以灭菌生理盐水作同样的试验。空白对照组不做任何处理。于24小时处死动物，取出局部阴道组织，观察有无充血、水肿现象。参照消毒技术规范(第三版)1999.11中皮肤刺激反应强度的评分标准评分及皮肤刺激强度分级，进行对阴道黏膜刺激强度的评定。
4、试验结果表3杀菌湿巾对试验动物阴道黏膜刺激试验刺激反应评分组别 动物数(只)红斑 水肿 总分杀菌湿巾组 6 0 0 0赋形剂组 6 0 0 0空白对照组 6 0 0 0
杀菌湿巾对大鼠阴道黏膜刺激反应最高总积分均值为0，属无刺激性。
实施例6杀菌湿巾对乳区急性感染的治疗试验1、样品准备5.杀菌湿巾的制备制备方法按实施例1，其中其中溶葡萄球菌酶含量0.008wt％，溶菌酶含量20wt％，聚乙二醇含量2％，聚梨山醇酯20含量0.3wt％。
青霉素G钾80万单位，华北制药厂硫酸链霉素100万单位，华北制药厂2、试验动物的准备选择泌乳期的4-8岁青、壮年高产、黑白花奶牛，共20头，急性乳腺感染引发炎症，，其症状为乳房肿胀，牛奶异常有凝块，絮片或者以后有絮片。但是没有疼痛，没有其它症状。随机分为4小组，1小组为杀菌湿巾治疗组，2小组为青霉素G钾治疗组，3小组为链霉素治疗组，4小组为空白对照组。
3、试验方案1小组每天早晚各一次于挤干乳后，用杀菌湿巾反复擦拭并覆盖于感染乳区，直至皮肤吸收。2、3小组每天早晚各一次，于挤干乳后，按青霉素10万单位，链霉素10万单位乳房内注射给药。4小组对照组，不进行任何治疗，给药7天。
4、观察指标(1)痊愈临床乳腺炎的症状全部消失，乳房组织柔软，牛奶里没有凝块，牛奶的颜色和平时一样白。
有效临床乳腺炎症状减轻，或者不再恶化，牛奶正常，但乳房肿胀没有完全消失。
(2)细菌学检测对治疗前、后感染乳区的病原菌进行分离、培养、鉴定，其中因为奶牛乳腺感染以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、化脓棒状杆菌六种细菌为主，故本检测试验以上述六种细菌为主。具体操作步骤如下A、采样同常规无菌采样进行，用10ml试管，每头牛每个乳区采集5-7ml鲜乳，注意的是前2-3把乳弃之不要，作好标记，尽可能快的放入4℃冰箱中保存。
B、培养、分离培养同常规进行，温度37℃，相对温度在50％以上。所用培养基主要有7％绵羊血琼脂；加入1％七叶甙的绵羊汤琼脂；却浦曼琼脂；叠氮钠结晶紫血琼脂；肉流培养基等。(以上培养基来自沈阳军区军马防治研究所)C、鉴定金黄色葡萄球菌的鉴定采用试管法和玻片法进行，利用枸橼酸兔血浆凝固实验进行测定。
链球菌的鉴定采用Camp试验进行，Camp试验阳性而七叶甙为阴性者即是无乳链球菌，Camp试验阳性而七叶甙为阳性者即是乳房链球菌，Camp试验阴性七叶甙也为阴性者即是停乳链球菌，。
大肠杆菌的鉴定采用伊红美兰培养基分离培养以及进行V、P试验和M、R试验，V、P试验阴性，M、R试验阳性者为大肠杆菌。
化脓棒状杆菌的鉴定采用血琼脂培养基培养，36小时后，如见有直径约1-2cm，图形、凸起、乳白色、表面光滑有光泽，并出现β琼血圈的小菌落者，即为化脓棒状杆菌。
5、试验结果表4杀菌湿巾对乳区急性感染的治疗试验结果杀菌湿巾组 青霉素G钾组链霉素组空白对照组临床 痊愈(头数) 4 2 1 0表现 有效(头数) 1 2 2 0大肠杆菌 99.7 97.2 92.30病原 金黄色葡萄球菌 99.8 65.3 41.20菌杀 无乳链球菌 99.5 86.2 85.30灭率 停乳链球菌 99.3 78.2 86.40(％) 乳房链球菌 99.1 89.6 91.30化脓棒状杆菌 99.4 78.5 87.90从上表中可以看出，杀菌湿巾能有效杀灭引起乳腺感染的各种病原菌，尤其对金黄色葡萄球菌特别有效，而两种抗生素则不能有效的去除乳区的病原菌。
实施例7杀菌湿巾预防乳腺感染的试验1、样品准备杀菌湿巾的制备制备方法按实施例1，其中其中溶葡萄球菌酶含量0.001wt％，溶菌酶含量20wt％，聚乙二醇含量3％，聚梨山醇酯20含量0.2wt％。
碘消灵溶液100ml，浙江农业大学。
采样液1％蛋白胨，0.5％硫代硫酸钠，2％吐温-80，0.5％卵磷脂的PBS，每管10ml。
2、试验动物的准备选择泌乳期的4-8岁青、壮年高产、黑白花奶牛，正常无任何感染症状，共3头，1小组为杀菌湿巾预防组，2小组为碘消灵组，3小组为空白对照组。
3、试验方法将一支无菌棉拭沾湿采样液采乳区，检测乳区每个采样样本的自然菌落数。1小组用杀菌湿巾擦拭原采样的邻近部位后，1分钟，30分钟，2小时，各采一次样；2小组方法同1小组，检测作用后残留的自然菌数，计算作用前后的自然菌杀灭率。
4、试验结果表5杀菌湿巾预防乳区感染的试验结果杀灭率(％) 杀菌湿巾组碘消灵组空白对照组1分钟后 99.9 94.2 13.530分钟后99.2 92.1 15.22小时后 98.4 62.3 14.6从上述试验可以看出，杀菌湿巾能有效的预防奶牛乳区受到细菌感染，可以保持乳区的清洁。
权利要求
1.一种杀菌制剂，其特征在于包括溶葡萄球菌酶0.0001～0.1wt％，溶菌酶10～50wt％，稳定剂1～15wt％，表面活性剂0.1～0.5wt％，水余量。
2.根据权利要求1所述的杀菌制剂，其特征在于所述及的稳定剂是聚乙二醇或壳聚糖中的一种。
3.根据权利要求1所述的杀菌制剂，其特征在于所述及的表面活性剂是非离子表面活性剂或两性离子表面活性剂。
4.根据权利要求3所述的杀菌制剂，其特征在于所述及的非离子表面活性剂是20≥亲水亲油平衡值≥6的非离子表面活性剂。
5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于非离子表面活性剂为聚山梨醇酯系列。
6.根据权利要求3所述的杀菌制剂，其特征在于所述及的两性离子表面活性剂是甜菜碱。
7.一种杀菌湿巾，其特征在于由载体和负载于其上的权利要求1～6任一所述的杀菌剂组成。
8.根据权利要求7的述的杀菌湿巾，其特征在于所述载体包括无纺材料或棉纱布。
9.根据权利要求7所述的杀菌湿巾的制备方法，其特征在于包括根据下步骤(1)按比例称取溶葡萄球菌酶、溶菌酶，稳定剂和表面活性剂与水混合；(2)将配制好的溶液喷涂于所需规格的载体上或将载体浸渍于溶液中，取出，即获得本发明的杀菌湿巾。
10.权利要求7或8所述的杀菌湿巾在杀灭引起奶牛乳腺感染的细菌中的应用。
11.根据权利要求10所述的杀菌湿巾的应用，其特征在于所述的细菌是革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。
12.根据权利要求11所述的杀菌湿巾的应用，其特征在于所述的细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和化脓棒状杆菌。
13.根据权利要求9-11任一所述的杀菌湿巾的应用，其特征在于于产奶前、后擦拭奶牛乳区。
14.根据权利要求9-11任一所述的杀菌湿巾的应用，其特征在于擦拭或覆盖于奶牛的发生感染的乳区。
全文摘要
本发明公开一种杀菌制剂，含有溶葡萄球菌酶0.0001～0.1wt％，溶菌酶10～50wt％，稳定剂1～15wt％，表面活性剂0.1～0.5wt％，水余量。本发明还公开了一种杀菌湿巾及其制备方法和在治疗和预防奶牛乳腺感染中的应用，将上述杀菌制剂负载于载体上，即可获得一种杀菌湿巾。本发明提供的杀菌湿巾用于杀灭引起奶牛乳腺感染的各种细菌，可取得十分显著的效果，尤其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、化脓棒状杆菌的杀灭率均超过99％。
文档编号A61L2/16GK1484959SQ0213724
公开日2004年3月31日 申请日期2002年9月28日 优先权日2002年9月28日
发明者黄青山, 陆婉英 申请人:上海高科联合生物技术研发有限公司