专利名称：包含白屈菜碱或其衍生物的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含白屈菜碱或其衍生物和药学可接受的载体的组合物。
背景技术：
心律失常是心脏介律异常，并导致心脏的抽吸效率降低。此时，心肌局部区域的电生化性质由于多种原因而发生变化，从而发生异常的心脏冲动形成或冲动传播(www.americanheart.org/heart and stroke)。
心脏动作电位的形状和持续时间随记录的心脏区域而变。这些区域差异一部分是由心肌内K+通道基因的差异表达造成的(Sanguinetti和Keating.Role of delayed rectifier potassium Channels in cardiacrepolarization and arrhythmias.News Physiol Sci 1997，12152-157)。
所有抗心律失常药均影响心肌内的离子运动，从而表现出抗心律失常作用。因此，通常根据运动离子的种类将抗心律失常药分成以下类别I(钠通道阻滞剂)、II(β-肾上腺素能受体阻滞剂)、III(钾通道阻滞剂)、IV(钙通道阻滞剂)等(Katz AM.Selectivity and toxicity ofantiarrhythmic drugsmolecular interactions with ion channels.AM JMed 1998，104179-195)。广泛使用药物来控制心律失常的主要障碍是相对高的心外副作用发生率。随着高度发展的药物开发，可能开发由于改善的组织特异性而表现出显著降低的心外副作用的药物。但是，非常难以防止通常作为药物的抗心律失常机理的直接结果的心脏副作用。抗心律失常药的常见的心脏副作用包括抑制收缩性能、心动过缓、改变起搏效力和去纤颤装置，以及发生新的心律失常或增加心律失常的发生(致心律失常)(Roden DM.Mechanism and managementof proarrhythmia.Am J Cardiol 1998，82491-571)。
已经研制出调节动作电位持续时间的抗心律失常药，它在控制心率方面是重要的。但是，这些药物还产生上述各种副作用，这限制了它们的临床应用。
因此，具有较小副作用的理想的抗心律失常药必须仅作用于表现异常兴奋性的心肌细胞(或具有异常心率的细胞)，或者发生心律失常的组织(例如心房肌细胞、心室肌细胞、蒲肯野纤维等)。但是，仍未开发出满足以上要求的药物。为了开发几乎没有或完全没有副作用的新药物，必须兼有关于抗心律失常药的靶(如离子通道)的分子生物学知识。例如，选择性地在致心律失常组织中表达的离子通道是理想的抗心律失常药的靶之一。因此，将分子生物学克隆技术和电-药理学技术结合的方法将可能开发出新的理想的抗心律失常药。
已知各种K+通道调节动作电位持续时间，而K+通道基因的差异表达取决于心脏的区域。
K+通道代表心脏中最多样的离子通道种类。心肌中的K+电流可以分成两类1)内向K+电流如IK1(内向整流K+电流)、IKach(乙酰胆碱激活的K+电流)和IKATP(ATP-敏感性K+电流)；和2)电压门控K+(Kv)电流。内向K+电流调节静息膜电位，而Kv电流控制动作电位持续时间。
心脏Kv电流根据它们的电生理学特征分为Ito、IKP、IKR、IKUR和IKS。Ito电流，一种瞬间外向K+电流，在膜去极化后立即激活，然后迅速失活。因此，Ito在动作电位的1相中是重要的。IKP电流，一种平台期K+电流，仅在膜去极化期间激活，并且是一种具有中等激活速度的延时外向K+电流。IKR电流，一种快速激活的延时整流器K+电流，在动作电位的2相中是重要的。IKUR电流，一种超快速激活的延时整流器K+电流，在动作电位的2相中也是重要的。IKS电流，一种缓慢激活的延时整流器K+电流，在几秒钟内完全激活，并且在动作电位的3相的最后复极中是重要的(Roden和George，The cardiacion channelsrelevance to management of arrhythmias.Annu Rev Med1999，47138-148)。这些Kv通道有助于细胞复极，并调节动作电位持续时间。临床上，已知受损组织中的复极障碍导致心律失常。因此，Kv通道成为治疗心律失常的主要的靶。在实际应用中，已知抗心律失常药如奎尼丁、异搏定、硝苯吡啶、索他洛尔、胺碘酮、氟卡尼和cropyrium与Kv通道相互作用(Katz AM.Selectivity and toxicityof antiarrhythmic drugsmolecular interactions with ion channel.Am JMed 1998，104174-195)。但是，已知这些药物由于它们缺乏离子通道选择性而具有各种副作用。因此，仍需要开发特异性地作用于特殊的超兴奋组织的离子通道的新药物。
使用果蝇遗传学和DNA操作技术获得了第一个克隆的K+通道基因，Shaker。迄今所报道的哺乳动物Kv通道的cDNAs分成九个亚族，Kv1～Kv9。其中，Kv1亚族是最具多样性的一种，并且包括至少八个亚类，Kv1.1～Kv1.8(Grissner S.Potassium channels still hot，TiPS1997，18347-350)。已经从心脏组织中克隆出Kv通道基因的Kv1.1、Kv1.2、Kv1.4、Kv1.5、Kv2.1、Kv4.2和Kv4.3(Deal等人，Molecularphysiology of cardiac potassium channels.Physiol Rev 1996，7649-67)。在人心脏中表达的主要Kv通道基因为hKv1.4、hKv1.5、hKv4.3和HERG基因。所有这些基因在心房和心室中都高度表达，特别地，hKv1.5基因优先在人心房中表达。已知hKv1.5具有与IKUR，一种人心房中的特异性电流相同的电生理学和药理学性质(Fedid等人，The1997 Stevenson Award Lecture，Cardiac K+channel gatingcloneddelayed rectifier mechanisms and drug modulation.Can J PhysiolPharmacol 1998，7677-89)。开发hKv 1.5通道的高选择性阻滞剂将导致用于治疗心房纤颤的理想药物。
本发明的发明人已经认真而深入地研究开发优先在人心房中表达的选择性hKv1.5通道阻滞剂，结果发现，白屈菜碱及其衍生物抑制人心房肌细胞中的hKv1.5通道电流和IKuR电流。此外，他们还发现，动作电位持续时间的延长作用与心率成比例。
因此，本发明的目的是提供包含表现出极好的K+通道阻滞作用和抗心律失常作用的白屈菜碱或其衍生物和药学可接受的载体的组合物。
发明内容
本发明涉及包含由下式1代表的白屈菜碱或其衍生物和药学可接受的载体的组合物式1
其中，R1选自氢、羟基、具有1-5个碳原子的低级烷氧基、苄氧基、具有1-5个碳原子的低级烷基羰氧基、苯甲酰氧基、具有1-5个碳原子的低级烷基磺酰氧基、芳基磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和-OCONH2；R2为氢或甲基；而R3、R4和R5各自独立地为氢；或者R1与R2或R4形成双键；或者R2与R3形成双键；或者R5与相邻的N原子形成双键。
根据本发明优选的组合物包含白屈菜碱或其衍生物
其中，R1选自氢、羟基、甲氧基、苄氧基、乙酰氧基、苯甲酰氧基、甲基磺酰氧基、4-甲基-苯磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和-OCONH2；R2为氢或甲基；而R3、R4和R5各自独立地为氢；或者R1与R2或R4形成双键；或者R2与R3形成双键；或者R5与相邻的N原子形成双键。
根据本发明更优选的组合物包含一种选自以下的化合物[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并(benzodioxolo)[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-醇；[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-6-甲氧基-13-甲基[1，3]-苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-6-苄氧基-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-乙酸酯；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-苯甲酸酯；(12bR)-13，14-二氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；(12bR)-7，12b，13，14-四氢-13-甲基[1，3]-苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-二苯基磷酸酯；
{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-甲磺酸酯；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-4-甲基苯磺酸酯；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-氨基甲酸酯；[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-5b，13-二甲基[1，3]-苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-醇；和13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶鎓。
上述化合物的结构式如以下表1所示表1
在本发明中用作有效成分的化合物1白屈菜碱主要存在于植物中。白屈菜碱几乎没有安全性和毒性问题。已知白屈菜碱表现出抗痉挛作用、对中枢多巴胺的抑制作用、镇痛作用、解热作用、抗癌作用和对氧化一氮、鸡眼和疣的抑制作用。
本发明的组合物中包含的化合物8、9、11和12是新化合物。另一方面，除这些化合物之外的化合物已经公开在以下文献中。
化合物1-Simanek，V.Benzophenanthridine alkaloids.InThe Alkaloids.Academic Press.1985，Vo1.4，185-240；化合物2-Nowicky，Wassili.Carcinostatic agents and their use.Patent1,191,837，1985，8，13，Canada；化合物3-Grynkiewicz，Grzegorz；Chojecka-Koryn，Ewa，Gadzikowska，Maria；Chodkowska，Anna，Jagiello-Wojtowicz，Ewa，Synthesis andbiological activity of O-acyl和O-alkyl chelidonine derivatives.Eur JMed Chem.2001，36951-960；化合物4-Grynkiewicz，Grzegorz；Chojecka-Koryn，Ewa，Gadzikowska，Maria；Chodkowska，Anna，Jagiello-Wojtowicz，Ewa，Synthesis andbiological activity of O-acyl and O-alkyl chelidonine derivatives.Eur JMed Chem.2001，36951-960；化合物5-Grynkiewicz，Grzegorz；Chojecka-Koryn，Ewa，Gadzikowska，Maria；Chodkowska，Anna，Jagiello-Wojtowicz，Ewa，Synthesis andbiological activity of O-acyl and O-alkyl chelidonine derivatives.Eur JMed Chem 2001，36951-960；
化合物6-Hanaoka，Miyoji；Yoshida，Shuji；Annen，Masami；Mukai，Chisato.，A novel and biomimetic synthesis of(±)-chelamine，(±)-chelidonine，sanguinarine，and dihydrosanguinarine from coptisinevia a common intermediate.Chem Lett.1986，5739-742；化合物7-Snatzke，Guenther；Hrbek，Jaroslav，Jr.；Hruben，Ladislav；Horeau，Alain；Santavy，Frantisek，Circular dichroism.XLII.Isolationand chemistry of the alkaloids from some plants of the genus Papaver.L.III.Absolute configuration and chiroptical properties of chelidonine andtetrahedroberberine alkaloids.Tetrahedron 1970，26(21)5013-5028；化合物10-Grynkiewicz，Grzegorz；Chojecka-Koryn，Ewa，Gadzikowska，Maria；Chodkowska，Anna，Jagiello-Wojtowicz，Ewa，Synthesis andbiological activity of O-acyl and O-alkyl chelidonine derivatives.Eur JMed Chem.2001，36951-960；化合物13Takao，Narao A.Alkaloids of Papaveraceae.VI.Alkaloids ofCorydalis incisa.5.The structure of corynoline.Chem Pharm Bull.1963，11(10)1306-1312；化合物14Lenfield，J.Karoutil，M.Marsalek，E.Slavik，J.Preininger V.和Simanek.V.J Med Plant Res.1981，43161-165。
但是，没有文献教导或提示这些基于白屈菜碱的化合物具有K+通道阻滞作用和抗心律失常作用。
用于本发明的白屈菜碱或其衍生物可以商购或由以下方法制备。
根据Bary，D.K.等人的方法(The benzophenanthridine alkaloids.JNat Prod 1984，471-43)，用甲醇提取白屈菜(Chelidonium majus var.asiaticum)。然后用己烷、二氯甲烷、丁醇和水对提取物进行溶剂分馏。选择己烷馏分作为活性馏分，并用硅胶柱色谱法纯化(洗脱剂二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇)制备白屈菜碱或其衍生物。
另外，根据Takeo等人的方法(Chiroptische eigenschaften undabsolue konfiguration von (+)-14-epicorynolin，(+)-corynolin，(+)-chelidonine und verwandten verbindungen.Arch Pharm.(Weinheim)1984，317223-237)和Budabary等人的方法(The Merck Index，8th ed.Merck & Co.，1989，2038-2039)，使白屈菜碱与RCl反应(其中R代表烷基、苯基或被卤素或低级烷基取代的苯基)、RCOCl(R代表烷基、苯基或被卤素或低级烷基取代的苯基)和氯磺酰基异氰酸酯反应来制备白屈菜碱或其衍生物。
一些用于本发明的化合物还可以根据以下反应路线1-5制备。这些路线只是制备用于本发明的化合物的优选方法的例示。但是，这些路线是用于限制本发明的保护范围。
路线1
通过用Dess-Martin Periodinane氧化剂处理白屈菜碱，将仲醇脱氢并氧化以制备化合物6。
路线2
在三乙胺的存在下，用甲磺酰氯处理白屈菜碱，得到甲磺酸酯化合物10。使如此获得的化合物10与叔丁醇钾进行消除反应，得到化合物7。在钯催化剂的存在下，用氢还原化合物7中存在的双键，以制备化合物6和8的混合物。
路线3
在作为碱的1，5-二氮杂二环[4，3，0]壬-5-烯的存在下，用二苯基磷酰基叠氮化物处理白屈菜碱，制备磷酸酯化合物9。此时，从反应物中回收原料。
路线4
在作为碱的三乙胺的存在下，用对甲苯磺酰氯处理白屈菜碱，以制备砜酯化合物11。
路线5
在作为碱的碳酸钠的存在下，用氯磺酰基异氰酸酯处理白屈菜碱，然后水解，制备氨基甲酸酯化合物12。从反应物中回收原料。
根据本发明可以包含在该组合物中的药学可接受的载体的实例包括赋形剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、包衣剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、稳定剂、吸收剂、注射用水、等渗剂等。根据本发明该组合物可以包含选自这些载体的至少一种载体。
本发明的组合物可以以用于口服给药或注射的配方使用，优选用于口服给药的配方。用于口服给药的配方可以是颗粒剂、片剂、胶囊剂、溶液等的形式。
本发明的组合物的剂量可以随已知因素，如患者的年龄、性别和体重而变。每日剂量范围通常为10-5000mg，优选50-1000mg。
在对小鼠进行静脉内给药时，白屈菜碱的毒性为34.6±2.44mg/kg；而在对小鼠进行静脉内给药时，血根碱(化合物14)的毒性为15.9mg/kg，在进行皮下给药时为102.0mg/kg。
本发明的组合物可以用作K+通道阻滞剂和抗心律失常药，还用于治疗温血动物如小鼠、狗、兔、猫、家禽等。
图1a显示白屈菜碱(化合物1)对在Ltk-细胞中表达的hKv1.5电流的作用。用来自-80mV维持电位的+50mV去极化脉冲记录电流图；图1b显示血根碱(化合物14)对在Ltk-细胞中表达的hKv1.5电流的作用。在不存在或存在多种浓度的血根碱的情况下用来自-80mV维持电位的+50mV去极化步长记录电流图；图1c显示乙酰白屈菜碱(化合物4)对在Ltk-细胞中表达的hKv1.5电流的作用。在不存在和存在多种浓度的乙酰白屈菜碱的情况下，用来自-80mV维持电位的+50mV去极化步长记录电流图；图1d显示苯甲酰白屈菜碱(化合物5)对在Ltk-细胞中表达的hKv1.5电流的作用。在不存在和存在多种浓度的苯甲酰白屈菜碱的情况下，用来自-80mV维持电位的+50mV去极化步长记录电流图；图1e是分别由白屈菜碱(化合物1，○)、乙酰白屈菜碱(化合物4，▲)、苯甲酰白屈菜碱(化合物5，■)和血根碱(化合物14，●)导致的hKv1.5阻滞的浓度-反应关系。将在去极化脉冲末期所测的稳态电流相对于对照进行归一化，以建立浓度-反应曲线；图2显示由白屈菜碱(化合物1，10μM)导致的在Ltk-细胞中表达的hKv1.5的电压依赖性阻滞；图3显示由白屈菜碱(化合物1，10μM)导致的在Ltk-细胞中表达的hKv1.5的通道状态依赖性阻滞；图4a显示白屈菜碱(化合物1，10μM)对人心房肌细胞的K+通道电流的作用的代表性K+电流图。通过来自-80mV维持电位的+50mV去极化脉冲获得K+电流；图4b显示在七个细胞中脉冲末端测定的在图4a中获得的平均电流；图5a显示在不存在白屈菜碱(1μM)的情况下，在多种刺激频率下的代表性动作电位图；图5b显示在存在白屈菜碱(化合物1，1μM)的情况下，在多种刺激频率下的代表性动作电位图；和图5c显示在多种刺激频率下，分别由白屈菜碱(化合物1，○)、乙酰白屈菜碱(化合物4，▲)、苯甲酰白屈菜碱(化合物5，■)和血根碱(化合物14，●)导致的动作电位持续时间延长的平均APD90(90％复极时的动作电位持续时间)变化。
具体实施例方式
现在将更详细地参照以下实施例描述本发明。但是，这些实施例以例示方式提供，而不起限定作用。
实施例1制备(12bR)-13，14-二氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶(化合物6)将Dess-Martin Periodinane(25mg，0.059mmol)溶于无水二氯甲烷(0.2ml)，然后在室温下搅拌10分钟。将在无水二氯甲烷(0.1ml)中的白屈菜碱(20mg，0.054mmol)溶液滴加到反应溶液中。搅拌30分钟后，将二乙醚(0.9ml)加到反应溶液中。将反应溶液加到饱和碳酸钾水溶液(0.56ml)和硫代硫酸钠五水合物(0.1g)的混合物中，随后搅拌15分钟。用乙酸乙酯萃取反应溶液，洗涤，干燥并用柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝10∶1)纯化，制备6.6mg(37％)标题化合物(化合物6)。此时，回收9mg(45％)白屈菜碱。
Rf＝0.24(己烷∶乙酸乙酯＝10∶1)
1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.71(d，1H，J＝9.0Hz)，7.60(d，1H，J＝14Hz)，7.50(d，1H，J＝8.5Hz)，7.32(d，1H，J＝8.0Hz)，7.27(s，1H)，6.87(d，1H，J＝8.5Hz)，6.07(s，2H)，6.06(s，2H)，4.21(s，2H)，2.64(s，3H)。
实施例2制备(12bR)-7，12b，13，14-四氢-13-甲基[1，3]-苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶(化合物7)将在无水甲醇(0.3ml)中的化合物10(20mg，0.046mmol)的溶液于室温下搅拌10分钟，然后向其中加入叔丁醇钾(15mg，0.138mmol)。将反应溶液于室温下搅拌13小时。用乙酸乙酯萃取反应溶液，洗涤，干燥，并用柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝4∶1)纯化，制备10mg(64％)标题化合物(化合物7)。
Rf＝0.22(己烷∶乙酸乙酯＝4∶1)1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.16(d，1H，J＝6.0Hz)，7.16(d，1H，J＝8.0Hz)，6.74(d，1H，J＝8.0Hz)，6.60(s，1H)，6.50-6.48(m，1H)，5.97(d，2H，J＝10Hz)，5.93(d，2H，J＝10Hz)，4.56-4.53(m，1H)，4.43(d，2H，J＝16.5Hz)，3.92(d，2H，J＝16.5Hz)，3.59-3.41(m，2H)，1.99(s，3H)。
实施例3制备[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶(化合物8)将10％钯(1mg)加到在无水甲醇(0.3ml)中的化合物7(10mg，0.030mmol)中，并在室温下搅拌10分钟。加入氢，同时将反应溶液搅拌1小时。用C盐滤垫过滤反应溶液，减压浓缩，并用柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝6∶1)纯化，制备2mg(20％)标题化合物8和1.8mg(18％)化合物6的混合物。
Rf＝0.27(己烷∶乙酸乙酯＝6∶1)
1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ6.93(s，1H)，6.75(d，1H，J＝8.5Hz)，6.72(d，1H，J＝8.5Hz)，6.56(s，1H)，5.94(d，2H，J＝1 5Hz)，5.92(d，2H，J＝3Hz)，3.94(d，1H，J＝16.5Hz)，3.61(d，1H，J＝4.0Hz)，3.48(d，1H，J＝16Hz)，3.07-3.04(m，1H)，2.79-2.67(m，2H)，2.40(s，3H)，1.91-1.88(m，1H)。
实施例4制备{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-二苯基磷酸酯(化合物9)将1，5-二氮杂二环[4，3，0]壬-5-炔(30μl，0.243mmol)加到在无水氯仿(0.4ml)中的白屈菜碱(30mg，0.081mmol)的溶液中，并在室温下搅拌30分钟。将二苯基磷酰基叠氮化物(27μl，0.122mmol)加到溶液中，并搅拌12小时。用乙酸乙酯萃取所得的反应溶液，洗涤，干燥，并用柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)纯化，制备20mg(42％)标题化合物(化合物9)。此时，回收11mg(37％)白屈菜碱。
Rf＝0.31(己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.41-7.35(m，5H)，7.31-7.19(m，7H)，6.59(d，1H，J＝8.5Hz)，6.37(s，1H)，5.90(s，2H)，5.88(d，2H，J＝23Hz)，5.11-5.05(m，1H)，4.10(d，2H，J＝5.0Hz)，3.70(d，2H，J＝17.5Hz)，3.66(bs，1H)，3.44(d，2H，J＝17Hz)，2.99(1H，dd，J＝11，15Hz)，2.87(1H，dd，J＝5，15.5Hz)，2.53(s，3H)。
实施例5制备{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-甲磺酸酯(化合物10)将白屈菜碱(18mg，0.048mmol)溶于无水二氯甲烷(0.5ml)，然后在0℃下搅拌10分钟。将无水三乙胺(8μl，0.058mmol)和甲磺酰氯(6μl，0.073mmol)加到溶液中，并在室温下搅拌6小时。用乙酸乙酯萃取所得的反应溶液，洗涤，干燥，并用柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)纯化，制备16mg(77％)标题化合物(化合物10)。
Rf＝0.39(己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.21(d，1H，J＝8.0Hz)，7.18(s，1H)，6.69(d，1H，J＝8.5Hz)，6.42(s，1H)，5.90(d，2H，J＝5.0Hz)，5.88(d，2H，J＝15.5Hz)，5.18-5.16(m，1H)，4.13-4.11(m，1H)，3.75(s，1H)，3.73(d，2H，J＝12Hz)，3.45(d，2H，J＝17Hz)，3.14-3.08(m，1H)，3.05(s，3H)，2.94(1H，dd，J＝5.0，15Hz)，2.54(s，3H)。
实施例6制备{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-4-甲基苯磺酸酯(化合物11)将白屈菜碱(10mg，0.027mmol)在无水二氯甲烷(0.3ml)中的溶液于0℃下搅拌10分钟。将无水三乙胺(5μl，0.032mmol)和对甲苯磺酰氯(8μl，0.040mmol)加到溶液中，并在室温下搅拌12小时。用乙酸乙酯萃取所得的反应溶液，洗涤，干燥，并用柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)纯化，制备8.6mg(63％)标题化合物(化合物11)。
Rf＝0.36(己烷∶乙酸乙酯＝2∶1)1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.86(d，2H，J＝8.5Hz)，7.37(d，2H，J＝8.5Hz)，7.30-7.26(m，1H)，7.20(s，1H)，6.66(d，2H，J＝8.0Hz)，6.33(s，1H)，5.89(d，2H，J＝3.5Hz)，5.87(d，2H，J＝18Hz)，4.96-4.92(m，1H)，4.03(d，1H，J＝5.0Hz)，3.67(d，2H，J＝17.5Hz)，3.60(bs，1H)，3.42(d，2H，J＝17.5Hz)，2.98(1H，dd，J＝11.5，15Hz)，2.68(1H，dd，J＝5.0，15.5Hz)，2.51(s，3H)，2.47(s，3H)。
实施例7制备{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-氨基甲酸酯(化合物12)将碳酸钠(10mg，0.097mmol)和氯磺酰基异氰酸酯(6μl，0.065mmol)在无水二氯甲烷(0.4ml)中的溶液于-78℃下搅拌10分钟。将白屈菜碱(20mg，0.054mmol)在无水二氯甲烷(0.14ml)中的溶液滴加到反应溶液中。将所得的反应溶液搅拌1小时后并缓慢加热到0℃后，用水终止反应。用3N氢氧化钠水溶液使反应溶液变为pH＞7。然后用乙酸乙酯萃取反应溶液，洗涤，干燥并用柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)纯化，制备5.4mg(20％)标题化合物(化合物12)。此时，回收4mg(40％)白屈菜碱。
Rf＝0.31(己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.26(d，1H，J＝8.5Hz)，7.21(s，1H)，6.71(d，1H，J＝8.5Hz)，6.45(s，1H)，5.92(d，2H，J＝5.5Hz)，5.90(d，2H，J＝14.5Hz)，5.11-5.07(m，1H)，4.78(bs，2H)，4.15(bs，1H)，3.83(bs，1H)，3.75-3.80(m，1H)，3.50-3.43(m，1H)，3.09-3.08(m，1H)，3.02(dd，1H，J＝5.0，15Hz)，2.59(s，3H)。
实验例1白屈菜碱及其衍生物对hKv1.5通道电流的作用1)制备表达特定离子通道的细胞系根据在论文中所述的方法(Yang等人，Inhibition of cardiacpotassium currents by the vesnarinone analog OPC-18790comparisonwith quinidine and dofetilide.J Pharmacol Exp Ther.1997，2801170-1175；Kwak等人，Phosphorylation is required for alteration ofKv1.5K+channel function by the Kvbeta 1.3 subunit.J Biol Chem 1999，27425355-25361)制备选择性地表达特定心脏K+通道基因的细胞系。
首先，将人心脏K+通道基因，如hKv1.5和HERG的cDNAs亚克隆至pMSVneo，所述pMSVneo含有控制插入的cDNA转录的可地塞米松诱导的鼠乳房肿瘤病毒启动子和赋予由SV40早期启动子驱动的新霉素耐受性的基因。用lipofectamine将含有cDNA的表达载体转染到小鼠Ltk-细胞中。24小时后，用0.5μg/ml的G418进行细胞选择，持续2周或直至形成不连续的焦点。分离单个焦点，保持在0.25μg/ml G418中，并通过Norhtern分析和电生理分析进行筛选。在5％CO2下，在补充有10％马血清和0.25μg/ml的G418的极限必需培养基(Dulbeco′s modified Eagle medium，DMEM)中培养转染的细胞。与稳定细胞系不同的是，在仅补充有10％马血清的DMEM中培养瞬间转染的细胞。
2)电记录使用高阻抗封接膜片钳技术(Kwak等人，Phosphorylation isrequired for alteration of Kv1.5 K+channel function by the Kvbeta 1.3subunit.J Biol Chem 1999，27425355-25361)的全细胞结构记录人心房肌细胞和细胞系中的电流。首先，用膜片钳放大器(AxonInstruments，Axopatch-1D，Foster，USA)放大电信号。通过信号转换器(Digidata 1200，Axon Instruments)将电流数字化，并存贮在计算机硬盘上。用2步移液管拉出器(Narishige，PP-83)拉出电阻为1～2MΩ的微移液管(Kimax-51，1.5-1.8×10mm)用于电流记录。全细胞模式的细胞内移液管填充溶液含有100mM KCl、10mM HEPES、5mMK4BAPTA、5mM K2ATP和1mM MgCl2(pH7.2)。细胞外溶液含有130mM NaCl、4mM KCl、1.8mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM HEPES和10mM葡萄糖(pH7.35)。
用来自-80mV维持电位的+50mV去极化脉冲，然后用Ltk-细胞中的-50mV去极化脉冲记录电流图。为了观察由每种化合物导致的hKv1.5通道电流的浓度依赖性阻滞，将在+50mV去极化脉冲末端测得的稳态电流相对于不存在每种化合物时获得的对照进行归一化。
图1a-1d显示白屈菜碱(化合物1)、血根碱(化合物14)、乙酰白屈菜碱(化合物4)和苯甲酰白屈菜碱(化合物5)对在Ltk-细胞中表达的hKv1.5通道电流的浓度依赖性抑制作用。图1e是显示在去极化脉冲的末期获得的相对稳态电流对每种化合物浓度的浓度-反应曲线。数据用希尔方程拟合。
图1a-1e证实，这些化合物表现出对在Ltk-细胞中表达的hKv1.5通道电流的浓度依赖性抑制作用，而该抑制作用在一定程度上随衍生物的类型而变。具体而言，白屈菜碱(化合物1)和乙酰白屈菜碱(化合物4)主要阻滞开放离子通道。相反，血根碱(化合物14)减缓通道激活，而苯甲酰白屈菜碱(化合物5)表现出激励性阻滞作用。
测定化合物1～14对hKv1.5通道电流的IC50值(50％抑制浓度，μM)，并使用希尔方程由各化合物的浓度-反应曲线计算希尔值。这些结果列在表2中。
表2白屈菜碱及其衍生物的IC50和希尔值
实验例2白屈菜碱导致的在Ltk-细胞中表达的hKv1.5通道电流的电压依赖性阻滞作用于离子通道的药物的电压依赖性有时在药物的临床应用评价中非常有用。
为了对白屈菜碱(化合物1)的电压依赖性阻滞进行定量，将相对稳态电流，I白屈菜碱/I对照作为膜电位的函数制图(图2)。在250ms去极化脉冲末期得到稳态电流，同时以10mV的增幅将膜电压从-80增加到+60mV。点线表示在Ltk-细胞中表达的hKv1.5通道电流的激活曲线。
如图2所示，白屈菜碱(化合物1)在-30mV和0mV之间表现出强烈的电压依赖性，但在0mV和+60mV之间表现出弱电压依赖性。当用Woodhull方程计算时，0mV和+60mV之间的δ值为0.16+0.01(n＝7)。
实验例3由白屈菜碱导致的hKv1.5阻滞的通道状态依赖性我们测试了由白屈菜碱导致的hKv1.5阻滞的通道状态依赖性(图3)。
图3显示在对照条件下和在白屈菜碱(10μM)存在下，用来自-80mV维持电位的+50mV去极化脉冲，然后用-50mV去极化脉冲获得的尾电流的叠加。
在对照条件下，尾电流快速失活。在白屈菜碱的存在下，最初的尾电流振幅降低，但随后的尾电流衰减比在对照条件下的缓慢，从而导致“交叉”现象。这表明白屈菜碱作为一种开放通道阻滞剂作用于hKv1.5通道。也就是说，白屈菜碱对开放状态的hKv1.5通道比对关闭状态的表现出更强的抑制作用。
实验例4白屈菜碱对人心房肌细胞K+电流的作用用Wang等人的方法(Effects of flecainide，quinidine，and4-aminopyridine on transient outward and ultrarapid delayed rectifiercurrents in human myocytes.J Pharmacol Exp Ther 1995，272184-196)进行人心房肌细胞的分离。从经历心肺转流手术的患者的心脏获得人右心房旁支样本。用于获得组织的方法得到患者的允许。将所得的样品快速浸泡在不含Ca2+的Krebs Henseleit (KH)溶液中。切割心肌样本，并将其放置在含有10ml无Ca2+的KH溶液的三角烧瓶中，然后搅拌5分钟。除去上清液后，将组织再悬浮在10ml含有200U/ml胶原酶和4U/ml蛋白酶的溶液中，并培养45分钟。除去上清液后，将组织再悬浮在10ml含酶溶液(在三角烧瓶中)中。为了测定分离的细胞的数量和质量，在倒置显微镜下每隔15分钟检查培养基。培养组织直至产量似乎最大。在培养之后，将组织转染到储备溶液中。用移液管分离细胞，并在250g下离心5分钟。将沉淀再悬浮在储备溶液中[组成20mM KCl、10mM KH2PO4、10mM葡萄糖、70mM谷氨酸、10mM β-羟基丁酸、10mM牛磺酸、10mM EGTA和0.1％清蛋白，用KOH将pH调节到7.4，并保存用于电流记录。
我们研究了白屈菜碱对hKv1.5通道电流的抑制作用是否也类似地显示于人心房肌细胞的K+通道电流，已知人心房肌细胞高度表达hKv1.5通道。从经历心肺转流手术的不患有任何类型的心律失常的患者的心脏分离人心房肌细胞。图4a显示由来自-80mV维持电位的+50mV去极化脉冲，然后复极至-50mV引起的电流图。图4b表示在去极化脉冲末端获得的平均稳态电流。
人心房肌细胞中的外向整流K+电流由快速激活和快速失活电流和延时整流电流组成，如图4a所示。白屈菜碱(化合物1，10μM)降低人心房肌细胞中外向K+电流的峰振幅并加速失活过程，导致稳态电流降低。图4b显示与对照相比，10μM白屈菜碱在+50mV去极化脉冲末期将稳态电流抑制41±5％(n＝7)。因此，证实了白屈菜碱对在Ltk-细胞中表达的hKv1.5的抑制作用也显示于人心房肌细胞中。
实验例5白屈菜碱及其衍生物对兔心房组织的动作电位的频率依赖性作用根据Kwak等人的论文所述的方法(A newly synthesizedbenzopyran derivatives，activates the cardiac ATP-sensitive K+channel.J Pharmacol Exp Ther 1995，275807-812)记录兔心房组织中的动作电位。
击打重约2kg的雄性新西兰白兔的头部使其晕倒，快速切除心脏，并转移到填充了用97％O2和3％CO2气体混合物饱和的Tyrode溶液的解剖浴中，将每个切除的组织水平地包埋在组织室的狭窄通道中，并在37℃下连续地用Tyrode溶液倾注。通过刺激器用矩形脉冲(1～5Hz，1-ms持续时间，20-30％以上阈电压)刺激心房细胞而引起动作电位。用与放大器(KS-700，WPI，Sarasota，FL，USA)连接的填充3M KCl的微电极(10-20兆欧)记录动作电位，并显示在示波器(Dual beam storage 5113，Tektronix，Beaverton，OR，USA)上。在35-mm胶片上将示波器屏幕上的图照相，并记录在生理仪(RS 3400，Gould，Cleveland，OH)上。将APD90用于比较动作电位持续时间。APD90代表相对于最大100％去极化时的动作电位持续时间，在90％复极时的动作电位持续时间。用Polaroid照相机拍摄示波器上的图像。
我们测试了白屈菜碱对兔心房肌细胞的动作电位的作用是否是频率依赖性的。
图5a(对照)和5b分别显示在多种频率下，在不存在(图5a)或存在(图5b)白屈菜碱(化合物1)的情况下的代表性动作电位图。图5c显示分别由白屈菜碱(化合物1，○)、乙酰白屈菜碱(化合物4，▲)、苯甲酰白屈菜碱(化合物5，■)和血根碱(化合物14，●)导致的动作电位持续时间延长的平均APD90(在90％复极时的动作电位持续时间)随刺激频率的变化。将在不存在白屈菜碱的条件下，在各种频率下的相对动作电位持续时间归一化为APD90值。在刺激频率为1、2、3、4和5Hz下，1μM白屈菜碱将各频率下的不存在白屈菜碱的对照的APD90增加13.0±8.1％(n＝5)、14.5±7.9％(n＝5)、16.5±2.2％(n＝5)、28.2±0.4％(n＝5)或33.0±0.31％(n＝5)。乙酰白屈菜碱(化合物4)、苯甲酰白屈菜碱(化合物5)和血根碱(化合物14)也以与白屈菜碱类似的方式增加动作电位持续时间，但与白屈菜碱相比程度较小(参见图5c)。
图5证实了白屈菜碱及其衍生物在低心率时表现出较小的抗心律失常活性，但在高心率时表现出较大的抗心律失常活性。因此，预期白屈菜碱及其衍生物用作具有较小副作用的理想的抗心律失常药。
制备例1片剂根据常规方法将由以下组分组成的组合物配方成片剂。
片剂组成白屈菜碱 500.0mg乳糖 500.0mg滑石 5.0mg硬脂酸镁 1.0mg制备例2胶囊剂根据以下方法将由以下组分组成的组合物配方成胶囊剂首先，将过筛的白屈菜碱与赋形剂混合。通过用该混合物填充明胶胶囊而制备胶囊剂。
胶囊组成白屈菜碱 500.0mg淀粉1500 10.0mg硬脂酸镁 100.0mg
制备例3散剂根据常规方法混合以下组分。将混合物填充在被膜中，并密封制备散剂。
散剂组成白屈菜碱 50.0mg乳糖 100.0mg滑石 5.0mg制备例4注射剂根据常规方法将由以下组分组成的组合物配方成注射剂。例如，通过用该组合物填充2.0ml安瓿并将其消毒而制备注射剂。
注射剂组成白屈菜碱 50.0mg抗氧化剂 1.0mgTween801.0mg注射用蒸馏水 加至2.0ml工业实用性根据本发明的组合物几乎没有安全性和毒性问题。此外，本发明的组合物可以选择性地阻滞在人心房肌细胞中表达的K+通道，并在低心率下表现出较小的抗心律失常活性，但在高心率下表现出较大的活性。因此，本发明的组合物用作K+通道阻滞剂和抗心律失常药。
权利要求
1.包含由下式1代表的白屈菜碱或其衍生物和药学可接受的载体的组合物 其中，R1选自氢、羟基、具有1-5个碳原子的低级烷氧基、苄氧基、具有1-5个碳原子的低级烷基羰氧基、苯甲酰氧基、具有1-5个碳原子的低级烷基磺酰氧基、芳基磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和-OCONH2；R2为氢或甲基；而R3、R4和R5各自独立地为氢；或者R1与R2或R4形成双键；或者R2与R3形成双键；或者R5与相邻的N原子形成双键。
2.权利要求1的组合物，其中R1选自氢、羟基、甲氧基、苄氧基、乙酰氧基、苯甲酰氧基、甲基磺酰氧基、4-甲基-苯磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和-OCONH2；而R2为氢或甲基；且R3、R4和R5各自独立地为氢；或者R1与R2或R4形成双键；或者R2与R3形成双键；或者R5与相邻的N原子形成双键。
3.权利要求1的组合物，其中该白屈菜碱或其衍生物选自[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-醇；[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-6-甲氧基-13-甲基[1，3]-苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-6-苄氧基-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-乙酸酯；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-苯甲酸酯；(12bR)-13，14-二氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；(12bR)-7，12b，13，14-四氢-13-甲基[1，3]-苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-二苯基磷酸酯；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-甲磺酸酯；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-4-甲基苯磺酸酯；{[5bR-(5bα，6β，12bα)]-5b，6，7，12b，13，14-六氢-13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-基}-氨基甲酸酯；[5bR-(5bα，6β，12bα)-5b，6，7，12b，13，14-六氢-5b，13-二甲基[1，3]-苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶-6-醇；和13-甲基[1，3]苯并二噁茂并[5，6c]-1，3-二噁茂并[4，5-i]菲啶鎓。
4.权利要求1的组合物，其中该药学可接受的载体包括选自以下的至少一种赋形剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、包衣剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、稳定剂、吸收剂、注射用水和等渗剂。
5.权利要求1的组合物，其中该组合物配方成口服给药形式或注射给药形式。
6.权利要求1的组合物，其中该组合物为抗心律失常药。
7.权利要求1的组合物，其中该组合物为K+通道阻滞剂。
8.权利要求7的组合物，其中该组合物为hKv 1.5通道阻滞剂。
9.用于预防或治疗心律失常的方法，所述方法包括给予权利要求1的组合物。
10.用于预防或治疗K+通道介导的疾病的方法，所述方法包括给予权利要求1的组合物。
11.权利要求1-3之任一项的组合物在生产预防或治疗心律失常的药物中的应用。
12.权利要求1-3之任一项的组合物在生产预防或治疗K+通道介导的疾病的药物中的应用，其中所述药物对K+通道具有抑制作用。
全文摘要
本发明涉及包含白屈菜碱或其衍生物和药学可接受的载体的药物组合物。本发明的组合物可以选择性地阻滞优先在人心房肌细胞中表达的hKv 1.5通道，因而用作K
文档编号A61P9/00GK1516583SQ02812045
公开日2004年7月28日 申请日期2002年5月9日 优先权日2001年5月11日
发明者殷载淳, 郭湧根, 金大根, 蔡洙完 申请人:殷载淳, 郭湧根, 金大根, 蔡洙完, 郑英薰, 池玉杓