疫苗组合物及制备方法及应用的制作方法

专利名称：疫苗组合物及制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疫苗组合物，其包含非磁性的无机物基的纳米粉体材料(Nanopowders)和抗原。
背景技术：
疫苗的应用已有200多年历史，第二次世界大战后，人用疫苗得到了迅速发展。到目前为止，人用疫苗有近百种。人类已利用疫苗控制了天花、百日咳、白喉、破伤风、脊髓灰质炎、麻疹等多种疾病。家禽及兽用的疫苗也有几十种。在本发明中，所有通过注射、粘膜或皮肤途径接种的、可以诱导针对致病原的特异性抗体和细胞免疫或其它免疫状态，从而获得保护或消灭这种致病原或消除这种病态因子的蛋白、多糖、核酸、活载体或感染因子，统称为疫苗。
疫苗可以分为几类，一类是病毒的灭活疫苗，就是获得病毒以后经过一些方法的处理，让它完全丧失活性。第二类是减毒疫苗，也就是去除微生物对宿主的毒力，把它做成疫苗。第三类是基因工程和化学合成疫苗，即使用基因工程和化学合成的方法生产出与免疫源相同的特异抗原片断蛋白质、多糖或表达特异抗原片断蛋白质的DNA，再将其导入机体或细胞，使产生针对这一段免疫源的蛋白的抗体，来达到获得保护或消灭这种致病原或消除这种病态因子的目的。
在以往的疫苗中，以预防单一疾病的“单苗”为主，随着疫苗种类的增多，注射一针预防多种疾病的联合疫苗也开始出现。如“麻风腮”疫苗，就是将预防麻疹、风疹、腮腺炎三大危害健康的疾病的疫苗做在一起的联合疫苗。23价肺炎疫苗就是将23种不同亚型的肺炎球菌夹膜多糖做在一起的多价疫苗。
过去的来源于微生物的疫苗多未经纯化，使用时副作用大，效果也受到影响。为了降低副作用，现在的来源于微生物的疫苗一部分已经是纯化疫苗。新开发的合成细菌、病毒外壳的特异蛋白、多糖结构，只包含了有用的抗原或抗原决定簇，由此制成的疫苗称为亚单位疫苗。纯化疫苗、亚单位疫苗仅有几种主要抗原决定簇蛋白和/或多糖，因而能减少不需要的副作用。但是它们(特别是多糖亚单位疫苗)又有免疫原性较低的弱点，需与佐剂合用才能得到好的效果。佐剂是一类与免疫原结合使用而能增强免疫效果的物质。在本发明中，疫苗组合物是指包含有佐剂与抗原的物质。当前，为了获得疫苗更好的免疫效果，疫苗几乎都使用了佐剂。或者说，当前几乎所有的疫苗均为疫苗组合物。
最广泛使用的疫苗组合物，是以氢氧化铝、磷酸钙等金属盐类为佐剂的疫苗组合物，例如基因工程乙肝疫苗，等等。这些金属盐类佐剂对大分子蛋白质、多糖有很强的吸附能力，使用后大大增强了疫苗的免疫原性和免疫持久性。但是这些经典佐剂在弱抗原时佐剂作用不强。因此，后来发展出了油性佐剂、脂肪族佐剂、聚合物表面活性剂、聚微粒载体佐剂、植物佐剂、细菌佐剂、人工合成佐剂、细胞因子佐剂、核酸佐剂，等等。一个有效的佐剂必须满足下列条件1).可以强化宿主的体液和细胞免疫反应，2).不可以使宿主的系统恶化，3).易于制备且稳定。到目前为止，美国FDA批准用于人体的疫苗佐剂还只有铝盐一种。尽管如此，由于其巨大的潜力，各种不同的佐剂、或者疫苗组合物仍然在不断地被发明出来。

发明内容
本发明提供一种疫苗组合物、特别是疫苗组合物的佐剂。本发明的佐剂(或免疫效应物)要满足的目标，是在使用剂量范围基本无毒，可以加强各种疫苗特别是小分子蛋白质和多糖疫苗的免疫源性，增强免疫动物体内的体液和细胞免疫，提高接种和治疗效果，并且易于生产和具有较高的稳定性。
本发明还提供了本发明所述的疫苗组合物的应用及制备方法。
本发明提供的疫苗组合物是一种疫苗组合物，包含非磁性的无机物基的纳米粉体材料(Nanopowders)和抗原，所述纳米粉体材料的平均粒径小于300nm，优选方案小于100nm，更优选方案小于50nm。
本发明所述的无机物基纳米粉体材料是指无机粉体材料及基于无机粉体材料的改性粉体材料。例如，基于无机纳米粉体材料的表面改性纳米粉体材料。
本行业的专业人士都应当知道，本发明疫苗组合物中的纳米粉体材料是一种佐剂。目前报道的用作佐剂的纳米材料，均为有机材料，包括纳米高分子微球和纳米脂质体，等等。用作佐剂的铝等的金属盐沉淀，也不会被本专业的技术人员视作本发明所述的纳米粉体材料。载药磁性纳米载体，例如三氧化二铁、四氧化三铁、铁钴合金等及其衍生物，也不在本发明所述的纳米粉体材料内。此外，粉体材料专业的技术人员应当知道，本发明的粉体材料更易以可控尺寸(平均粒径小于300nm，优选方案小于100nm，更优选方案小于50nm)及较高的尺寸一致性的方式生产，也容易进行各种表面改性。
又一方面，本发明提供的疫苗组合物，其中纳米粉体材料包括无机纳米粉体材料和基于无机纳米粉体材料的表面改性纳米粉体材料。
本发明提供的疫苗组合物，其中无机纳米粉体材料包括纳米非金属氧化物粉体、纳米金属粉体和纳米金属氧化物粉体。
本发明提供的疫苗组合物，其中纳米非金属氧化物粉体包括硅的纳米氧化物粉体，等等；所述纳米金属粉体包括纳米金，等等；所述纳米金属氧化物粉体包括钛的纳米氧化物粉体，等等。
本发明提供的疫苗组合物，其中硅的纳米氧化物粉体为多微孔颗粒或/和实心颗粒。
本发明提供的疫苗组合物，其中纳米粉体材料为在上述无机纳米粉体材料的表面上固定分布有有机物的表面改性纳米粉体材料。
本发明提供的疫苗组合物，其中纳米粉体材料的表面上固定分布的有机物为胺基或/和环氧烷基或/和醚基胺基。
本发明提供的疫苗组合物，其中纳米粉体材料的表面上固定分布的有机物为高分子表面活性剂。高分子表面活性剂是指相对分子量数千以上，含有亲水基和疏水基，具有表面活性功能的高分子化合物。
本发明提供的疫苗组合物，其中纳米粉体材料的表面上固定分布的高分子表面活性剂包括聚乙烯吡咯烷酮、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基酯。
另一方面，本发明提供的疫苗组合物，其中抗原来自下述微生物或组织病毒、细菌、衣原体、螺旋体、疟原虫、弓形虫、细胞、过敏原，和根据上述微生物或组织的氨基酸序列或/和核酸序列采用基因工程、核酸合成、蛋白质或多肽合成所得到的产物。
本发明提供的疫苗组合物，其中佐剂结构和组成简单，专业人士应当知道其可与范围广泛的抗原混合而不丧失其在本发明中的佐剂性质。上述微生物或组织的更细的例子包括人免疫缺陷病毒(HIV)、水痘带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、人巨细胞病毒、登革热病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、人乳头状瘤病毒、流感病毒、流行性脑膜炎病毒、人类白血病病毒(HTLV)、冠状病毒、流行性出血热病毒(EHFV)、沙门氏菌属、弧菌属、奈瑟氏菌属、包特(Bordetella)氏菌属、布氏菌属(Brucella)、耶尔森菌属(Yersinia)、需氧芽胞杆菌属、梭状芽胞杆菌属、链球菌属、支原体属、分枝杆菌属、嗜血杆菌属、疏螺旋体菌属、衣原体属、疟原虫属、弓形虫属、肿瘤相关蛋白抗原和核酸抗原、口蹄疫病毒、鼠瘟病毒、口蹄疫病毒、鼠假性狂犬病毒、登革热病毒、黄热病减毒活病毒，导致动脉粥样硬化肺炎衣原体、呼吸道合胞病毒、轮状病毒、独特型抗体抗原、绿脓杆菌、动物寄生虫抗原，等等。
本发明疫苗组合物的应用是本发明疫苗组合物在作为制备预防和/或治疗病毒、细菌、寄生虫感染，过敏或癌症的疫苗和避孕疫苗方面的应用。
发明所述的疫苗包括用于人和动物的DNA疫苗、蛋白质/多肽疫苗、多糖疫苗，重组疫苗、亚单位疫苗、灭活疫苗、减毒活疫苗、粘膜疫苗，单价或多价、单联或多联疫苗。
本发明所述的疫苗包括预防疫苗和治疗性疫苗(Therapeuticalvaccines)。
又一方面，本发明疫苗组合物是以片剂、口含剂、栓剂、水针剂、透皮剂、滴鼻剂、气溶胶或喷雾的形式应用。
本发明疫苗组合物的制备方法是本发明一种制备疫苗组合物的方法，将非磁性的无机物基的纳米粉体材料、抗原或抗原组合物进行混合。
本发明所述的制备疫苗组合物的方法还包括将非磁性的无机物基的纳米粉体材料、抗原或抗原组合物、与药学上可接受的赋形剂和/或药学上要求的保护剂、稳定剂进行混合。
本发明疫苗组合物的优点是本发明疫苗组合物所包含的佐剂，更易以可控尺寸及较高的尺寸一致性的方式生产，也容易进行各种表面改性，其可以强化宿主的体液和细胞免疫反应而无明显毒性。由于本发明佐剂的组成和结构的简单性，本发明疫苗组合物的应用可以有很广的范围。本发明疫苗组合物的制备程序简单、易于操作。
具体实施例方式实施例1，不同佐剂疫苗小鼠免疫效果试验本实施例所用纳米粉体材料见表1表1，用作佐剂的纳米粉体材料

本实施例所用抗原为经纯化的乙肝核心抗原(HBcAg)(北京人民医院肝病研究所)。本实施例所用疫苗组合物由表1中列出的纳米粉体材料与HBcAg在巳优化的条件下混合而成。本实施例所用哺乳动物模型为8周龄，重18-20g的Balb/c小鼠(清洁级)。实验动物共分9组，1、2、3、4组分别为以纳米氧化硅、纳米金、纳米氧化钛、聚乙烯吡喀烷酮改性纳米氧化硅为佐剂、以HBcAg为抗原的不同疫苗组合物免疫；第5、6、7、8组分别为不加抗原的纳米氧化硅、纳米金、纳米氧化钛、聚乙烯吡喀烷酮改性纳米氧化硅佐剂对照；第9组为不加佐剂的HBcAg抗原对照。
在本实施例中，纯化的HBcAg用PBS稀释至20μg/ml，与等体积的免疫佐剂完全混合后，在小鼠腹腔内按2ug HBcAg/只的剂量注射。初次免疫后间隔3周再以同样剂量加强免疫一次。采用耳洞法进行组内小鼠编号标记，采用毛细吸管眼静脉采血法采集小鼠免疫前及免疫后第3、6、9周血，分离血清，-30℃保存待检。
抗-HBc抗体的检测采用ELISA法。抗-HBc抗体酶标检测试剂盒为市售酶标检测试剂盒(厦门科创生物技术有限公司)。检测时将小鼠血清和参考品倍比稀释(1∶50，1∶100，1∶200，1∶400…)，每个稀释度双孔测定。阴性和阳性对照不需稀释每个稀释度双份测定。对照为样品稀释液(双份)、阴性和阳性对照(不需稀释)。终点滴定各组小鼠血清抗-HBc抗体滴度。结果见表2。
表2各组小鼠抗乙肝表面抗原抗体终点滴度的检测结果

9组小鼠在免疫前均未检测到抗-HBc抗体。在本实施例的条件下，比较疫苗组合物免疫组(1、2、3、4组)和佐剂免疫组(5、6、7、8)，两者之间抗体滴度有显著性差别；比较疫苗组合物免疫组(1、2、3、4组)和HBcAg免疫组(第9组)，两者之间抗体滴度有显著性差别；比较分别混合有不同纳米粉体材料佐剂的疫苗组合物免疫组(1、2、3、4组)之间，不同疫苗组合物之间抗体滴度无显著性差别。免疫后3-9周，不同疫苗组合物免疫组(1、2、3、4组之间)的抗-HBc滴度随观察时间延长而增高。
到实验结束时，在实验组72只小鼠无一死亡，提示本发明的疫苗组合物具有安全性。实施例2，纳米粉体材料佐剂的疫苗小鼠局部反应试验本实施例所用抗原与实施例1相同，为经纯化的乙肝核心抗原(HBcAg)(北京人民医院肝病研究所)。本实施例所用纳米粉体材料佐剂与实施例1的纳米粉体材料佐剂(表1)相同。
本实施例所用哺乳动物模型为8周龄，重18-20g的Balb/c小鼠(清洁级)。实验动物共分5组，1、2、3、4组分别以纳米氧化硅、纳米金、纳米氧化钛、聚乙烯吡喀烷酮改性纳米氧化硅为佐剂、以HBcAg为抗原(注射浓度与实施例1中相同)的不同疫苗组合物免疫；第5组分别为不加佐剂的HBcAg抗原对照。每只小鼠在后脚掌中皮下注射25ul疫苗组合物或抗原，以后每天测量小鼠注射掌厚度，减去注射前掌厚度，结果见表3。
表3不同佐剂的局部反应组别 肿胀值(mm)1天 2天 3天 6天 12天1 1.68 1.89 1.58 1.29 0.682 1.58 1.69 1.41 1.23 0.723 1.72 1.87 1.56 1.31 0.934 1.65 1.61 1.53 1.26 0.615 0.32 0.16 0.03 0.01 0.00所有的注射小鼠脚掌均有不同程度的肿胀，仅有蛋白质的肿胀程度最轻，消退也最快。而疫苗组合物则肿胀的程度强，消退也慢。
权利要求
1.一种疫苗组合物，其特征在于该疫苗组合物包含非磁性的无机物基的纳米粉体材料(Nanopowders)和抗原，所述纳米粉体材料的平均粒径小于300nm，优选方案小于100nm，更优选方案小于50nm。
2.根椐权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于所述纳米粉体材料包括无机纳米粉体材料和基于无机纳米粉体材料的表面改性纳米粉体材料。
3.根椐权利要2所述的疫苗组合物，其特征在于所述无机纳米粉体材料包括纳米非金属氧化物粉体、纳米金属粉体和纳米金属氧化物粉体。
4.根椐权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于所述纳米非金属氧化物粉体包括硅的纳米氧化物粉体；所述纳米金属粉体包括纳米金；所述纳米金属氧化物粉体包括钛的纳米氧化物粉体。
5.根椐权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于所述硅的纳米氧化物粉体为多微孔颗粒或/和实心颗粒。
6.根椐权利要求2-5之一所述的疫苗组合物，其特征在于所述纳米粉体材料为在所述无机纳米粉体材料表面上固定分布有有机物的表面改性纳米粉体材料。
7.根椐权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于所述有机物为含胺基或/和环氧烷基或/和醚基的有机物。
8.根椐权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于所述有机物为高分子表面活性剂。
9.根椐权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于所述高分子表面活性剂包括聚乙烯吡咯烷酮、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基酯。
10.根椐权力要求1所述的疫苗组合物，其所包合的抗原来自下述微生物或组织病毒、细菌、衣原体、螺旋体、疟原虫、弓形虫、细胞、过敏原，和根据所述微生物或组织的氨基酸序列或/和核酸序列采用基因工程、核酸合成、蛋白质或多肽合成所得到的产物。
11.一种疫苗组合物的应用，其特征在于所述的疫苗组合物在作为制备预防和/或治疗病毒、细菌、寄生虫感染，过敏或癌症的疫苗和避孕疫苗方面的应用。
12.根椐权利要求11的疫苗组合物，其特征在于其中所述疫苗是片剂、口含剂、栓剂、水针剂、透皮剂、滴鼻剂、气溶胶或喷雾形式。
13.一种疫苗组合物的制备方法，其特征在于将非磁性的无机物基的纳米粉体材料、抗原或抗原组合物进行混合。
14.根据权利要求13所述的疫苗组合物的制备方法，其特征在于将非磁性的无机物基的纳米粉体材料、抗原或抗原组合物，与药学上可接受的赋形剂和/或药学上要求的保护剂、稳定剂进行混合。
全文摘要
本发明提供一种疫苗组合物、特别是疫苗组合物的佐剂，以及该疫苗组合物制备方法及应用，其为平均粒径小于300nm、优选方案小于100nm、更优选方案小于50nm的非磁性的无机物基的纳米粉体材料(Nanopowders)。本发明疫苗组合物中的佐剂更易以可控尺寸及较高的尺寸一致性的方式生产，也容易进行各种表面改性，其可以强化宿主的体液和细胞免疫反应而无明显毒性。
文档编号A61P35/00GK1483477SQ03135250
公开日2004年3月24日 申请日期2003年6月19日 优先权日2003年6月19日
发明者邹方霖, 陈春生, 陈宁, 王建霞 申请人:成都夸常科技有限公司