一氧化氮治疗炎症的制作方法

专利名称：一氧化氮治疗炎症的制作方法
技术领域：
本发明涉及气态一氧化氮或一氧化氮供体形式的一氧化氮与糖皮质激素组合用于制备治疗哺乳动物、包括人的感染性炎症的药物的应用，治疗这种炎症的方法和用于治疗这种炎症的药物组合物。
背景技术：
许多实验和临床研究证明在急性肺损伤的治疗中通过吸入一氧化氮(吸入的NO，INO)可以改善血液的氧合作用和缓解或减弱肺高血压。这些作用通过选择性扩张通气肺薄壁组织中的肺血管而发生。INO还具有抗炎作用，并抑制被认为在炎症中涉及的基因的表达。这些作用包括趋化因子、粘附分子、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞间介素、核因子-κB(NF-κB)和环氧合酶-2(COX2)。但是对NO和炎症标记物之间的相互作用的认识远不充分。认识的增加可以开创新的抑制炎症的途径。INO可能发挥肺外作用，例如防止凝血、改善排尿，但没有确实的证据表明已表现出系统抗炎作用(Kang，J.L.等人，J.Appl.Physiol.(2002)92(2)，795-801；Kinsella，J.L.等人，Pediatr.Res.(1997)41(4)，457-463；Troncy，E.等人，Br.J.Anaesth.(1997)79(5)，631-640；Ballevre，L.等人，Biol.Neonate.(1996)69(6)，389-398；wraight W.M.等人，BritishJournal of Anaesthesia(2001)86(2)，267-269)吸入NO的主要治疗作用是肺血管舒张。两种观念使这种应用变得重要。首先，NO的作用限于肺循环。第二，由于NO在吸入的空气中给药，因而它优先作用于通气的肺泡(Rang，H.P.等人，Pharmacology(1995)，Churchill Livingstone.)。因此，NO的先前治疗应用涉及局部作用即肺。
糖皮质激素(GCs)是通过刺激下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴而由肾上腺产生的甾类激素。一般认为它们的有效的抗炎和免疫调节作用是由于抑制转录因子、如在前炎性基因的调节中涉及的活化剂蛋白-1(AP-1)和NF-κB的活性导致的。GCs作用的发挥通过糖皮质激素受体(GR)，一种属于核受体超家族的配体诱导的转录因子。GR通过两种主要作用方式控制转录。一种方式包括使GR二体与GR靶基因的调控序列中的糖皮质激素反应元件(GREs)结合。另一种作用方式是GR调节其它转录因子如AP-1、NF-κB和Stat5的活性，这种方式独立于直接DNA接触，一个指定为通讯(cross talk)的过程。对于这种第二作用方式GR本身不需要与DNA结合(Adcock，I.M.等人，Immunology and Cell Biology(2001)79(4)，376-384；DeEosscher，K.等人，J.Neuroimmunol.(2000)109(1)，16-22；Refojo，D.等人，Immunology and Cell Bioligy(2001)79(4)，385-394；Reichardt，H.M.等人，The EMBO Journal(2001)20(24)，7168-7173.)。
糖皮质激素的临床应用包括用于肾上腺衰竭患者的替代治疗、抗炎/免疫抑制治疗和用于肿瘤疾病。一般地，认为糖皮质激素具有抗炎和免疫抑制活性。它们抑制早期和晚期炎症症状。因此，糖皮质激素用于哮喘的抗炎/免疫抑制治疗，皮肤、眼、眼或鼻的炎症(即湿疹、过敏性结膜炎或鼻炎)，过敏症、具有自体免疫和炎症成分的多种疾病，以及预防移植物抗宿主疾病(Rang，H.P.等人，Pharmacology(1995)，Churchill Livingstone)。
但是，上述糖皮质激素的应用都涉及非感染性炎症。传统地，对于感染性疾病，优选抗生素治疗。
细菌性肺炎是由肺病原体感染引起。感染性试剂的实例是肺炎球菌试剂、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、克雷白杆菌属(Klebsiella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和军团菌属、革兰氏阴性生物和吸气物质。来自上气道或较少来自血原性扩散的细菌通向肺薄壁组织。一旦到达那里，因子(包括感染性生物的毒力、局部防御状况和患者的总体死亡)的组合可能导致细菌性肺炎(Stephen，J.(2003)，Bacterial Pneumonia，<http//www.emedicine.com/emerg/topic465.htm>)。
细菌性肺炎的药物治疗的主要依靠是抗生素治疗。糖皮质激素在急性细菌性肺炎中的作用仍不清楚。经典的教导警告在感染中使用糖皮质激素损及免疫反应。但是，最近的发现表明使用系统性糖皮质激素可以减少局部肺炎(Toshinobu Yokoyama等人，J.Infect.Chemother.(2002)8(3)，247-251；Lefering R.等人，Crit.Care Med.(1995)23，1294-1303.)。
脓毒症或脓毒性休克次于微生物感染的系统性炎症反应。在临床实践中引入抗生素之前，革兰氏阳性菌是导致脓毒症的主要微生物。更为最近地，革兰氏阴性菌成为导致严重脓毒症和脓毒性休克的关键病原体。
脓毒性休克患者的治疗由以下3个主要目标组成(1)使用支持疗法以纠正低氧症、低血压和受损的组织氧合作用使脓毒性休克患者复苏。(2)鉴定感染源并用抗微生物剂疗法、外科手术或二者进行治疗。(3)保持充足的由心血管监控指导的器官系统功能并中断多器官系统异常功能的发病机理。
虽然存在将大剂量皮质类固醇用于严重脓毒症和脓毒性休克患者的理论和实验动物证据，所有随机的人研究(除了1976年的研究)发现皮质类固醇并不防止中风的产生、逆转中风状态或改善14天死亡率。因此，在医药文献中没有证实将高剂量皮质类固醇用于脓毒症或脓毒性休克患者的常规应用(参见以下)(Sharma，S.，Mink，3.(2003)，Septic Shock，<http//www.emedicine.com/med/topic2101.htm>)但是，最近的试验证明了加强剂量的皮质类固醇给药对严重和顽固性休克患者的阳性结果(Briegel，J.等人，Crit.Care Med.(1999)27，723-732)。
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)定义为一种急性症状，其特征在于双侧肺浸润和严重低氧血，但缺少心原性肺水肿的证据。ARDS与肺泡和肺毛细管内皮的播散性损害有关。ARDS的风险因子包括直接肺损伤、系统性疾病和损伤。最常见的ARDS风险因子为脓毒症。导致产生ARDS风险的其它非胸症状包括具有或不具有大规模输血外伤、急性胰腺炎、配药过量和长期骨折。最常见的与ARDS有关的直接肺损伤为胃内容物的吸入。其它风险因子包括多种病毒和细菌性肺炎、接近溺死和毒性吸入(Hardmanl E.M.，Walia，R.(2003)，AcuteRespiratory Distress Syndrome，<http//www.emedicine.com/med/topic70.htm>)。
尚未证明有利于预防或控制ARDS的药物。皮质类固醇在脓毒性患者上的早期给药没有预防ARDS的产生。吸入一氧化氮(NO)、一种有效的肺血管舒张药似乎在早期试验中有希望，但在较大的对照试验中并没有改变ARDS成人的病死率。皮质类固醇的潜在作用可能存在于晚期ARDS(纤维增殖期)，因为它们通过抑制多形核白细胞的迁移和逆转毛细管渗透性增加而减少炎症。这可能被认为是对选择患者的抢救性治疗，但在目前正在进行的ARDS网络试验的结果未明朗之前不建议进行普遍使用(Kang，J.L.等人，J.Appl.Physiol.(2002)92(2)，795-601；Reichardt，H.M.等人，The EMBO Journal(2001)20(24)，7168-7173.)从前述对多种感染性症状的综述中可以认识到，糖皮质激素治疗在感染性炎症、如脓毒症和脓毒性休克患者中的应用是有争议的并存在大量争论。大随机研究和中位分析(meta-analyses)不足以表现出死亡率优点，甚至表明类固醇治疗可能是有害的(Cronin，L.等人，Crit.Care Med.(1995)23，1430-1439；Lefering，R.等人，Crit.Care Med.(1995)23，1294-1303)。一般优选针对疾病的微生物病因的治疗，如使用抗生素。而且，当糖皮质激素治疗被建议用于脓毒性患者时，它针对患有肾上腺功能异常的患者(Annane，D.等人，JAMA(2002)288，862-871)。因此，糖皮质激素治疗对于面对患有脓毒症或脓毒性休克的患者的内科医师而言不是一个明显和普通的选择。
总之，如上述，细菌性肺炎、脓毒性休克和ARDS是感染性炎症的实例。这些炎症的治疗传统上集中在基础感染上，即使用不同种类的抗生素。在某些情况下，也建议糖皮质激素治疗，这主要与特定的额外症状有关。但是，也有人反对将糖皮质激素治疗用于细菌性肺炎、脓毒性休克和不同原因的ARDS，例如没有获得治疗效果或发生副作用。
WO99/20251(Zapol等人)公开用于减少或预防非肺局部缺血一再灌输损伤和非肺炎症的方法。非肺炎症的实例为关节炎、心肌炎、脑炎、移植排斥、系统性红斑狼疮、痛风、皮炎、炎性肠病、肝炎和甲状腺炎。这些方法包括使哺乳动物吸入气态一氧化氮。NO气体减少将白细胞或血小板循环成为活化状态的能力，并导致局部缺血再灌输部位的炎症过程和非肺组织的炎症。可以施用与吸入的NO气体组合加强气态NO的治疗作用的第二化合物。第二化合物首先可以是磷酸二酯酶抑制剂，还可以是糖皮质激素。但是，此文献仅涉及非感染性炎症的治疗。糖皮质激素用于治疗非感染性炎症的应用是已知的，且糖皮质激素在所述方法中的作用与NO的作用互补，而不是提供协同作用(即比单独INO和类固醇作用的总和更为提高的作用)。
最后，虽然US 5,837,698和US 5,965,862(Tjoeng等人)谈到一氧化氮作为一种增强皮质类固醇在多种不同疾病中的作用的药物，但它们没有提供它们的总和作用的实施例，并没有明确提及感染性炎症。这些文献真正公开了与一个分子中的类固醇部分和一氧化氮供体部分组合的类固醇亚硝酸酯和/或硝酸酯化合物。
发明概述本发明的基础是发现糖皮质激素和一氧化氮之间在炎症过程中存在复杂的相互作用。根据这些相互作用，似乎可以获得强协同作用。似乎一氧化氮上调糖皮质激素受体的表达，并在与糖皮质激素联合给药时钝化炎症反应。
本发明的目的为提供一种用于治疗感染性炎症的药物。更为具体地，该药物的目的受益于上述协同作用。
本领域技术人员在研究下述说明书之后应该明显看出上述目的和本发明的其它目的，这些目的通过将气态一氧化氮或一氧化氮供体形式的一氧化氮与糖皮质激素组合用于制备治疗哺乳动物、包括人的感染性炎症的药物而实现，该组合以治疗有效量使用以实现该炎症的治疗。这些目的也通过治疗感染性炎症的方法和用于治疗感染性炎症的药物组合物来实现。
一氧化氮与糖皮质激素的联合应用利用上述协同作用。该作用与单独的一氧化氮或糖皮质激素的作用相比是显著的。以下实施例进一步例示了组合药物的作用。
感染性炎症的炎症反应包括下调糖皮质激素受体。因此，上调糖皮质激素受体的一氧化氮与糖皮质激素的组合使用特别优选用于治疗感染性炎症。
感染性炎症可能由细菌、真菌、病毒、支原体、原生动物、蠕虫或昆虫导致。例如，细菌感染可能是由拟杆菌属、棒状杆菌、肠细菌、肠球菌、大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌属或种导致的。
适于使用根据本发明的一氧化氮和糖皮质激素治疗的感染性炎症的实例为窦炎、上呼吸道感染、支气管扩张、支气管炎和慢性支气管炎、细菌性肺炎、尿道感染、脑膜炎、急性呼吸窘迫综合征、心肌炎、心包炎、心内膜炎、风湿热、脓毒症和脓毒性关节炎。
用于本发明治疗的优选的炎症为脓毒症、细菌性肺炎和急性呼吸窘迫综合征。
而且，同时观察到药物的系统作用对于肺、肾和肝具有良好作用。
一氧化氮和糖皮质激素可以同时给药。
但是，更优选一氧化氮与糖皮质激素分开给药。分开给药允许分别独立地控制一氧化氮和糖皮质激素的剂量。两种组分的最佳剂量比率可以随患者的年龄、性别、症状等和疾病的严重程度而变。
最优选一氧化氮在糖皮质激素之前给药。一氧化氮的早期给药允许在糖皮质激素给药之前起动即上调糖皮质激素受体。一氧化氮和糖皮质激素的这种连续给药为本发明的协同作用提供良好的基础。一氧化氮给药和糖皮质激素给药的时间间隔可以为大约1分钟(对于如肺炎等炎症)至大约30分钟(对于更远端的组织，如肝或肾)。
一氧化氮可以作为气态一氧化氮或作为一氧化氮供体给药。优选的作为可吸入一氧化氮的气态一氧化氮给药用于快速发生和弥补它的效果。对于要求机械通气的患者它还代表一种方便的给药途径。
可以通过任何施用类固醇的已知途径施用糖皮质激素，例如口服、吸入、肌内或皮下注射、静脉内灌输或注射或者皮内或关节内注射。但是，优选的给药途径是静脉内，因为严重疾病患者如脓毒症患者的微循环可以是不良的，从而限制药物的吸收。
而且，根据本发明的药物可以是可吸入药物。
可吸入的一氧化氮存在于载体气体或气体混合物中，例如与氮混合以保护一氧化氮防止氧化。一氧化氮在此载体气体或气体混合物中的浓度范围一般为0.1-180ppm，优选1-80ppm，更优选1-40ppm。
本发明药物中糖皮质激素的剂量范围一般为0.1-10mg/kg体重。
作为吸入气态一氧化氮的一种可供选择的形式，可以施用一氧化氮供体形式的一氧化氮。适宜的一氧化氮供体的实例为S-亚硝基半胱氨酸、硝普盐、亚硝基胍、三硝酸甘油酯、亚硝酸异戊酯、无机亚硝酸盐、叠氮化物、羟胺、硝化甘油、二硝酸异山梨醇酯和季戊四醇四硝酸酯(pentaerithrityl tetranitrate)。
任何起动糖皮质激素受体的糖皮质激素适用于本发明。优选的糖皮质激素的实例为氢化可的松、可的松、皮质甾酮、强的松龙、泼尼松、甲基强的松龙、曲安西龙、地塞米松、倍他米松、倍氯米松、布地奈德、去氧皮甾酮(deoxycortone)、醋酸氟轻松、氯倍他松和促皮质素。
附图的简要说明

图1显示在实施例中所用的不同方案。
图2A和2B分别显示来自实施例的平均肺动脉压(MPAP)的结果和动脉氧合作用(PaO2)的结果。数据来自健康动物(星号)和与以下试剂接触的动物单独的内毒素(三角形)、内毒素+吸入的一氧化氮(圆圈)、内毒素+类固醇(菱形)，和内毒素+吸入的一氧化氮和类固醇(加号)。
图3显示与来自健康小猪的肺(健康)相比以下试剂引起的肺组织的组织学变化单独的内毒素(LPS)，内毒素+吸入的一氧化氮(LPS+INO)，内毒素+类固醇(LFS+类固醇)，和内毒素+吸入的一氧化氮与类固醇(LPS+INO+类固醇)。内毒素诱导的急性炎症细胞渗透进入肺泡隔膜和支气管壁周围，使上皮和内皮细胞膨胀，并引起肺水肿和出血。
图4显示与来自健康小猪的肝(健康)相比以下试剂导致的肝的组织学变化单独的内毒素(LPS)，内毒素+吸入的一氧化氮(LPS+INO)，内毒素+类固醇(LPS+类固醇)，和内毒素+吸入的一氧化氮和类固醇(LFS+INO+类固醇)。内毒素诱导的急性炎症细胞渗透进入小叶外周的结缔组织，大量肝细胞充血和坏死，Kupffer细胞反应性增生和出血。
图5显示与来自健康小猪的肾(健康)相比由以下试剂导致的肾的组织学变化单独的内毒素(LPS)，内毒素+吸入的一氧化氮(LPS+INO)，内毒素+类固醇(LPS+类固醇)，和内毒素+吸入的一氧化氮和类固醇(LPS+INO+类固醇)。内毒素诱导的急性炎症细胞渗透、水肿并破坏肾小球结构，并使肾小球细胞坏死。
图6显示糖皮质激素受体在与以下试剂接触的小猪的肺组织中的表达单独的内毒素(LPS)或内毒素+吸入的一氧化氮(LPS+INO)。
图7显示NF-κB在与单独的内毒素(LPS)或内毒素加吸入的一氧化氮(LPS+INO)接触的小猪肺组织中的表达。
实施例材料和方法动物准备该研究得到Uppsala大学动物研究道德委员会批准。使用38只重量为22-28kg的瑞典国家品种小猪。用阿托品，i.m.，0.04mg/kg、替来他明/唑拉西泮(Zoletid，Virbac Laboratories)，6mg/kg和氯化赛拉嗪(Rompun，Bayer AG，Germany)，2.2mg/kg诱导麻醉，并保持连续灌输催眠药、氯美噻唑(Heminevrin，Astra，Sdertlje，Sweden)，400mg/h、溴化双哌雄双酯，2mg/h和芬太尼，120mg/h。将预加热的(38℃)等渗盐水500ml/h经静脉内施用以防止脱水。使动物处于仰卧位置以用于余下的研究。
在诱导麻醉后，进行气管切开术并插入套头的气管(cuffedtracheal tube)。以体积控制的方式(Servo 900C，Siemens-Elema，Lund，Sweden)提供机械通气，呼吸频率为22±2次呼吸/分(平均值±SD)，吸气与呼气比率为1∶2，终吸气暂停5％呼吸周期。调整分钟通气量以得到终末潮CO2张力(PetCO2)在最初受控条件下为33-45mmMg(4.4-6.0kPa)，并在整个实验中保持常数。平均潮气容积为10±1.4ml/kg。应用5cm H2O的正终呼气压力(PEEP)。氧的吸入分数(FIO2)为0.5。将三腔球形接头导管(Swan Ganz no.7F)引入肺动脉以进行血液取样和压力记录。还在对侧颈静脉和右颈动脉中插入导管进行压力记录、血液取样和灌输。记录平均动脉压力(MAP)、平均肺动脉压力(MPAP)、心率(HR)、中央血管压力(CVP)、肺毛细血管楔压(PCWP)和心输出量(Qt)。插入Douglas和膀胱导管以测定尿流量和腹水流体。
收集混合的静脉和动脉血样进行血液气体分析(ABL 500，Radiometer，Copenhagen，Denmark)并测定氧饱和度和血色素浓度(OSM 3，Radiometer，Copenhagen，Denmark)。校正猪血液的血氧测量计(Hemoximeter)数据。
方案将猪分成5组1.正常对照组2.内毒素(脂多糖，LPS)组3.LPS+INO组4.LPS+类固醇组5.LPS+INO+类固醇组不同的方案如图1图示并描述如下。
1.健康对照组(n＝8)休息30分钟后进行麻醉、外科手术准备和导管插入。然后完成基线测定。使猪在随后6小时内建立整个研究期间的对照数据。在最后一次测定后使用静脉内注射KCl处死猪，从肺、肝和肾中进行组织取样以用于形态学和生物化学研究。
2.LPS组(n＝8)与对照组类似地进行麻醉、外科手术和导管插入。在基线测定后，通过静脉内灌输在盐水中的LPS 25μg/kg/h 2.5小时，然后为研究的其余部分灌输10μg/kg/h而诱导急性肺损伤和脓毒性休克。然后对猪进行血液动力学和血液气体测定，并在实验结束时处死猪。如上述进行组织取样。
3.LPS+INO组(n＝8)在基线测定之后开始LPS灌输，并持续6小时。在开始内毒素灌输2.5小时后，开始吸入NO 30ppm并维持3.5小时。每小时进行测定以检查INO治疗对肺和肺外器官的任何保护作用。
4.LPS+类固醇组(n＝7)此方案与上述相同，但猪接受类固醇、氢化可的松i.v.(SolucortefPharmacia)，3.5mg/kg，代替在开始内毒素灌输2.5小时后接受INO。
5.LPS+INO+组(n＝7)如以上所述，此组在6小时内接受内毒素，并在开始内毒素给药2.5小时后开始静脉内施用类固醇和INO，30ppm，并继续其余3.5小时的研究期间。
NO给药将在N2中1000ppm的NO加到O2/N2的混合物中，并通过流式通气器下流入口(low-flow inlet)给药。使吸入的气体通过含有碱石灰(soda lime)的罐以吸收任何NO2。将吸入的NO设定为30ppm，且吸入的NO2的浓度总小于0.2ppm。在通气器管的吸入分支中，通过化学发光法(9841 Nox，Lear Siegler Measurement ControlsCorporation，Englewood，CO，USA)连续测定吸入的NO和NO2的浓度。加入NO后检查FIO2，并稳定保持在预INO的水平。
免疫组织化学使用标准链霉抗生物素蛋白-生物素-过氧化酶检测技术完成GR和NF-κB的免疫组织化学检测(GRSanta Cruz Biotechnology，Inc目录号sc-1004 USA，兔多克隆抗体，稀释1∶200；NF-κBSIGMA，产品号N5823 Germany，稀释1∶100)。试验表明主要抗体的高压釜或微波抗原复原以及温育过夜产生了最佳敏感度。用过氧化酶-抗过氧化物酶法，使用3-氨基-9-乙基-咔唑(AEC，SIGMA目录号A-6926德国)作为色原体检测抗体。所有的载玻片用0.1％鉴定的苏木精(SIGMA目录号MHS-16德国)对染色。
免疫组织化学的图像分析安装在全自动Leica(Wetzlar，Germany)DM RXA显微镜上的由12-比特(bit)冷充电耦合的设备照相机(Sensys KAF 1400，光度计Tucson，AZ)组成的图像分析系统用于将灰度图象数字化至双-Pentium 200Mhz宿主计算机。显微镜设置在所有测定中保持常数(×40 objective，Leica PL Fluotar 400×/0.75)。稳定的12V钨-卤素灯(100W)用于照明。用Omega Optical(Brattleboro，VT)制造的用户设计过滤器进行微密度测定以测定Vector红底物的吸光度(中央波长525nm，半波宽度10±2nm)。通过测定Leica MPV SP显微光度计系统(courtesy of Leica)中的底物测量确定最佳中央波长。
统计分析数值表示为平均值±SD。通过方差的双道分析及随后的Student-Newman-Keuls检验评价显著性差异。统计学显著性假设为P＜0.05。
结果血液动力学和动脉氧合作用在5组研究小组中，在基线血液动力学和动脉氧合作用方面不存在显著差异。在内毒素组中，LPS灌输导致肺动脉压增大，即保持两倍或三倍于基线水平的水平(图2)。PaO2在LPS灌输开始0.5小时后显著降低，并继续降低若干小时，然后保持小于基线一半的水平(图2)。INO减少MPAF的增加，但它显著地比健康对照组高75-80％(p＜0.01)(图2)。INO防止PaO2的部分降低。仅接受类固醇的猪在内毒素灌输期间具有如仅接受内毒素的猪同样的高MPAP。因此类固醇显示出无清楚的作用。而且，通过类固醇治疗PaO2没有改善，而是保持与内毒素组一样低的水平。
最后，接受INO和类固醇的猪表现出MPAP的连续降低，即在内毒素灌输6小时后在实验结束时与健康对照组不再有显著性差异(图2)。而且，PaO2在治疗期间得到改善，并在实验结束时与健康对照组不再有显著性差异。
组织学变化见表1和图3、4和5。
图3显示了肺组织的组织学变化。内毒素诱导的急性炎症细胞渗透进入肺泡隔膜和支气管壁周围，使上皮和内皮细胞膨胀，并引起肺水肿和出血。类固醇治疗(LPS+类固醇)恢复或防止某些损害。LPS+INO组的肺具有较小的这样的变化，且暴露于LPS+INO+类固醇的肺仅具有较小的变化，并因此具有接近正常的组织学。但是，仍可以看到某些炎症细胞渗透和较厚肺泡隔膜和某些水肿。箭头表示如上述的变化。
图4显示肝组织的组织学变化。内毒素诱导的急性炎症细胞渗透进入小叶外周的结缔组织中，大量肝细胞充血和坏死，Kupffer细胞增殖和出血。在与内毒素和类固醇(LPS+类固醇)接触的猪中，肝变性较小于LPS组。在与内毒素和吸入的一氧化氮(LPS+INO)接触的肝中，这些变化大大小于LPS组。在与内毒素和吸入的一氧化氮和类固醇组接触的组(LPS+INO+类固醇组)中，肝组织的结构较接近于来自健康对照组的肝，因此几乎没有坏死，尽管观察到Kupffer细胞数量和某些炎症细胞渗透有增加。箭头表示上述的变化。
图5显示肾组织的组织学变化。内毒素诱导的急性炎症细胞渗透、水肿和肾小球结构的破坏，以及肾小球细胞的坏死。在与内毒素加类固醇(LPS+类固醇)接触的肾中，这些变化与LPS组相比稍有些不明显。因此，在肾小球中存在更多的细胞(表示较少变性)。在与内毒素加吸入的一氧化氮(LPS+INO)接触的猪中，其变化的显著性甚至小于LPS+类固醇组。在与内毒素加吸入的一氧化氮和类固醇(LPS+INO+类固醇)的组中，肾小球结构保持。但是，仍看到炎症细胞渗透、肾小球膨胀和Bowman囊减小。箭头表示上述的变化。
表1表示与健康猪(健康组)相比由单独的内毒素(LPS)、内毒素和吸入的一氧化氮(LPS+INO)、内毒素和类固醇(LPS+S)，以及内毒素+吸入的一氧化氮和类固醇(LPS+INO+S)导致的肺(上图)、肝(中图)和肾(下图)的组织学变化。+表示五种程度变化的严重性(-、+、++、+++、++++)。*意指相对于LPS p＜0.05。除了LPS+INO+S猪外，所有的变化类型也明显不同于健康对照组，所述LPS+INO+S猪未表现出或表现出较小的肺水肿或出血，无肝小叶结构的破坏或坏死，并且没有肾坏死。
表1.肺、肝和肾组织的组织学变化肺变化健康LPS LPS+INOLPS+SLPS+INO+S炎症细胞渗透- +++++++++++ ++/*充血- ++++++++++ ++/*肺水肿 - ++++++(+)/*+++ +/*出血- +++++/*++(+)/* +(-)/*肝变化健康LPS LPS+INOLPS+SLPS+INO+S炎症细胞渗透- +++++++++++ ++/*充血和出血 - ++++++ +++ ++/*坏死- +++++(+)/* +++ +/-/*小叶结构的破坏 - +++++ +++ -/*肾变化健康LPS LPS+INOLPS+SLPS+INO+S炎症细胞渗透+ +++++++++++ ++/*水肿/出血 - ++++++++++ +(+)/*肾小球结构的破坏- ++++++(+)/*+++ +(+)/*坏死- ++++++/* +++ +/-/*免疫组织化学糖皮质激素受体，GR见表2和图6。
图6显示糖皮质激素受体在肺组织中的表达。在LPS组中，观察到GR在少数细胞中弱表达，少于正常组织(这里未显示)。GR的表达在LPS+INO组中显著增加，其中大量细胞的染色强度增大(深颜色，表明GR表达)。在炎症细胞和气道与肺泡的上皮细胞中看到染色。箭表示阳性染色的细胞。
表2显示与来自健康小猪(健康组)的肺相比，单独的内毒素(LPS)或内毒素+吸入的一氧化氮(LPS+INO)接触后糖皮质激素受体在肺和肝组织中的表达。+表明表达的量。*意指相对于健康组p＜0.05。§意指相对于LFS p＜0.05。
表2.GR表达(免疫组织化学染色的结果)组织健康LPSLPS+INO肺 +(+)+(-)* ++++*§肝 + --*++*§NE-κB见表3和图7。
图7显示NF-κB在肺组织中的表达。在炎症细胞、特别是巨噬细胞以及某些支气管壁上皮细胞中看到强烈的NF-κB表达(深色)。NF-κB表达位于细胞核心，而NF-κB阳性细胞有聚集的趋势。在LPS+INO组中，NF-κB表达处于低水平，大部分位于细胞质，且阳性细胞稀少和分散。箭头表示阳性染色细胞。
表3显示与来自健康小猪的肺(健康)相比NF-κB在与以下试剂接触的小猪的肺、肝和肾组织中的表达单独的内毒素(LPS)，内毒素+吸入的一氧化氮(LPS+INO)，内毒素+类固醇(LPS+S)，和内毒素+吸入的一氧化氮和类固醇(LPS+INO+S)。+表示表达的数量。*意指相对于LPS p＜0.05。除了LPS+INO+S猪外，所有类型的变化也明显不同于健康对照组，所述的LPS+INO+S的猪在肺和肝中显示出基本正常的表达。
表3.NF-κB的表达(免疫组织化学染色的结果)组织健康LPS LPS+INOLPS+SLPS+INO+S肺 + +++++(+)* +++ +*肝 + ++++++ ++(+)* +(+)*肾 + ++++++(+) +++ ++*讨论此研究表明在猪模型中灌输内毒素导致在肺循环(肺)和系统循环(肝和肾)方面的严重炎症反应。而且，内毒素灌输导致几乎完全消除肺组织和肝中的糖皮质激素受体表达(目前尚未研究肾的GR受体)和炎症标记物NF-κB的上调。炎症反应由水肿、血栓形成、出血和细微结构如肾脏中的肾小球破裂和肝小叶的变性组成。开始吸入NO治疗(INO)减弱炎症反应，但仅限于有限程度。另一种治疗形式，静脉内类固醇给药对研究期间的炎症反应几乎没有作用。最后，INO和类固醇的组合对炎症反应的减弱具有显著的效果。虽然仍看到某些形态异常，但来自肺、肾和肝的组织较类似于正常对照组织(图3-5)。
另一观察是INO和类固醇治疗的组合使生理变量平均肺动脉压和动脉氧合作用几乎正常化。在内毒素模型中，单独的INO改善氧合作用并降低MPAP，但没有回复至正常，而类固醇治疗几乎没有效果。
可能以如下的方式解释我们得到的相当显著的结果。内毒素脓毒症模型引起炎症反应，并更完全或更不完全地下调糖皮质激素受体。活化这种受体防止炎症级联反应，而此级联的早期步骤为释放NF-κB和其它炎症标记物。随着GR的下调，炎症标记物的产生和释放增强，促进脓毒症过程(Molijn，G.J.等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.(1995)80(6)，1799-1803)。
INO具有某些抗炎作用，并通过活化可诱导的NO合成酶(iNOS)产生NO。我们第一次显示，INO的一个重要的作用是上调脓毒症中的GR表达。我们推测这对炎症过程的调节起关键作用。我们还推测GR的可利用性增加将使更为有效的伴随类固醇治疗成为可能。如果可得到更多的糖皮质激素受体，外源类固醇给药可能具有更多待结合的受体，并通过这些方法更有效地阻断炎症反应。我们的发现支持这种推测(Kang，J.L.等人，J.Appl.Physiol.(2002)92(2)，795-801；Kinsella，J.P.等人，Pediatr.Res.(1997)41(4)，457-463；Webster，J.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2001)98(12)，6865-70；Almawi，W.Y.等人，J.Mol.Endocrinol.(2002)28(2)，69-78；Smith，J.B.等人，Am J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.(2002)283(3)，L636-L647)。
结论在内毒素猪模型中，INO和静脉内类固醇的联合给药明显地改善肺和系统器官(肝和肾)的组织学外观，并防止水肿形成、血栓形成和结构性损害。这种有益效果可能在INO上调糖皮质激素受体、使类固醇治疗更为有效之后发生。
权利要求
1.气态一氧化氮或一氧化氮供体形式的一氧化氮与糖皮质激素组合用于制备治疗哺乳动物、包括人的感染性炎症的药物的应用，所述组合以治疗有效量使用以实现该炎症的治疗。
2.根据权利要求1的应用，其中所述感染性炎症由细菌、真菌、病毒、支原体、原生动物、蠕虫或昆虫导致。
3. 根据权利要求2的应用，其中所述感染性炎症由细菌引起。
4.根据前述任一项权利要求的应用，其中该感染性炎症选自窦炎、上呼吸道感染、支气管扩张、支气管炎和慢性支气管炎、细菌性肺炎、尿道感染、脑膜炎、急性呼吸窘迫综合征、心肌炎、心包炎、心内膜炎、风湿热、脓毒症和脓毒性关节炎。
5.根据权利要求4的应用，其中所述感染性炎症为脓毒症。
6.根据权利要求4的应用，其中所述感染性炎症为细菌性肺炎。
7.根据权利要求4的应用，其中所述感染性炎症为急性呼吸窘迫综合征。
8.根据前述任一项权利要求的应用，其中所述该药物具有系统作用。
9.根据前述任一项权利要求的应用，其中所述药物为包含同时施用的所述一氧化氮和所述糖皮质激素的组合物的形式。
10.根据权利要求1-8任一项的应用，其中所述制备涉及用于以任何次序连续施用所述一氧化氮和所述糖皮质激素的药物。
11.根据权利要求10的应用，其中所述制备涉及用于以所述次序连续施用所述一氧化氮和所述糖皮质激素的药物。
12.根据前述任一项权利要求的应用，其中施用所述气态一氧化氮作为可吸入一氧化氮。
13.根据前述任一项权利要求的应用，其中所述糖皮质激素经静脉内施用。
14.根据权利要求12的应用，其中所述药物为可吸入药物。
15.根据权利要求12的应用，其中待吸入的气态一氧化氮的浓度范围为0.1-180ppm，优选1-80ppm，更优选1-40ppm，所述气态一氧化氮以载体气体或气体混合物存在。
16.根据前述任一项权利要求的应用，其中糖皮质激素的剂量范围为0.1-10mg/kg体重。
17.根据前述任一项权利要求的应用，其中该一氧化氮供体选自S-亚硝基半胱氨酸、硝普盐、亚硝基胍、亚硝酸异戊酯、无机亚硝酸盐、叠氮化物、羟胺、硝基甘油、二硝酸异山梨醇酯和季戊四醇四硝酸酯。
18.根据前述任一项权利要求的应用，其中所述糖皮质激素选自氢化可的松、可的松、皮质甾酮、强的松龙、泼尼松、甲基强的松龙、曲安西龙、地塞米松、倍他米松、倍氯米松、布地奈德、去氧皮甾酮、醋酸氟轻松、氯倍他松和促皮质素。
19.一种治疗哺乳动物、包括人感染性炎症的方法，所述方法包括给需要这种治疗的哺乳动物联合施用气态一氧化氮或一氧化氮供体形式的一氧化氮以及糖皮质激素，所述组合以治疗有效量使用以实现所述炎症的治疗。
20.根据权利要求19的方法，所述方法如在权利要求2-18之任一项中所定义。
21.用于治疗哺乳动物、包括人的感染性炎症的药物组合物，所述药物组合物包含与糖皮质激素组合的气态一氧化氮或一氧化氮供体形式的一氧化氮，所述一氧化氮和所述糖皮质激素以治疗有效量存在以实现所述炎症的治疗。
22.根据权利要求21的药物组合物，所述组合物用于如权利要求2-18任一项定义的应用。
全文摘要
气态一氧化氮或一氧化氮供体形式的一氧化氮与糖皮质激素组合用于制备治疗哺乳动物、包括人的感染性炎症的药物的应用，所述组合以治疗有效量使用以实现所述炎症的治疗。一种用于治疗这种炎症的方法和药物组合物。
文档编号A61K33/00GK1535692SQ03146249
公开日2004年10月13日 申请日期2003年7月4日 优先权日2003年4月3日
发明者笪冀平, 陈鲁妮, G·海顿斯蒂尔纳, 偎沟俣 申请人:Aga公司