用于抑制ns3(c型肝炎)的具有取代喹啉的羟基脯氨酸醚的三肽的制作方法

专利名称：用于抑制ns3(c型肝炎)的具有取代喹啉的羟基脯氨酸醚的三肽的制作方法
技术领域：
本发明是关于化合物，其合成方法，组合物及治疗C型肝炎病毒(HCV)感染的方法。具体地说，本发明提供新颖肽类似物，含这类似物的药物组合物及使用这些类似物治疗HCV感染的方法。
背景技术：
C型肝炎病毒(HCV)是世界上输血后及社会上获得的非-A非-B肝炎的主要病源剂。据估计，世界上有超过二亿人受该病毒感染。有高百分比的带病毒者变成慢性感染，并且很多发展成慢性肝病，即所谓慢性C型肝炎。而这群人又成为严重肝病如肝硬化，肝细胞癌及导致死亡的肝病的高危险群。
HCV确立病毒持续性并导致慢性肝病高发生率的机理现在还不完全明了。也不知HCV如何与宿主免疫系统相互作用及避开宿主免疫系统。此外，有关避免HCV感染及疾病的细胞及体液免疫反应的情况也还未确定。据报告，免疫球蛋白可预防输血引起的病毒性肝炎，但疾病控制中心(the Center forDisease Control)目前并不推荐免疫球蛋白治疗用于此目的。有效的保护性免疫反应的缺乏妨碍了疫苗的发展或适宜的曝露后的预防手段，所以近期内希望仍寄托于对抗病毒的干扰。
各种临床研究的目的在于确定能有效地治疗受慢性C型肝炎困扰的病人的HCV感染的药剂。这些研究包括使用α-干扰素，单独使用或和其他抗病毒剂组合使用。此种研究显示有相当数目的受试验者对此类治疗无反应，也有相当多受试者有不错的反应，发现有大部分在治疗结束后有复发。
直到最近，干扰素(IFN)是临床上唯一证明对慢性C型肝炎患者有利的治疗。但其持续反应率低，而且干扰素治疗也会引起严重的副作用(即视网膜病变，甲状腺炎，急性胰脏炎，抑郁症)，这些副作用降低了接受治疗的病人的生活品质。最近已允许对单独使用IFN无反应的病人组合使用干扰素与病毒唑(ribavirin)。但用IFN所引起的副作用并未因使用这组合治疗而减轻。聚乙二醇化的干扰素如PEG-Intron及Pegasys能明显地部分指出这些有害的副作用，但治疗HCV的供口服的抗病毒药物仍是选择的方法。
所以，现在需要发展克服现有的药物治疗限制的用于治疗HCV有效的抗病毒制剂。
HCV是B族虫媒病毒科中有包膜的正链RNA病毒。单链HCV RNA基因组的长度约9500个核苷酸，具有编码约3000个氨基酸的单一大的多蛋白的可读框(ORF)。在受感染的细胞内，这种多蛋白由细胞及病毒蛋白酶在多位点裂解以生成结构蛋白及非结构蛋白(NS)。在HCV的情形下，成熟的非结构蛋白(NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，及NS5B)的增殖是由二种病毒蛋白酶实施。第一种，现在还不完全明了其特性，在NS2-NS3连接处(前面称NS2/3蛋白酶)裂解；第二种为含于NS3(NS3蛋白酶)的N-端区内的丝氨酸蛋白酶，引发NS3下游所有其后的裂解，包括顺式，含在NS3-NS4A切割位点，及反式，剩余的NS4A-NS4B，NS4B-NS5A，NS5A-NS5B位点。NS4A蛋白质有多种功能，起NS3蛋白酶的辅因子的作用，并可能有助于NS3膜及其他病毒复制酶成分的定位。NS3蛋白酶与NS4A的复合形成(complex formation)对所有位点的加工过程(processing events)，增进蛋白水解效率似乎是必需的。NS3蛋白也是展现核苷三磷酸酶及RNA解旋酶活性。NS5B是一种涉及HCV复制的RNA-依赖性RNA聚合酶。
发展抗病毒剂的一般策略是钝化(inactivat)主要用于病毒复制的病毒编码的酶。
下面是最近几年发布的揭示HCV NS3蛋白酶抑制剂肽类似物的专利申请案，这些HCV NS3蛋白酶抑制剂肽类似物在结构上不同于本发明化合物GB 2,337,262；JP 10298151；JP 11126861；JP 11292840；JP 20001-103993；US 6,159,938；US 6,187,905；WO 97/43310；WO 98/17679；WO 98/22496；WO98/46597；WO 98/46630；WO 99/38888；WO 99/50230；WO 99/64442；WO99/07733；WO 99/07734；WO 00/09543；WO 00/009558；WO 00/20400；WO00/59929；WO 00/31129；WO 01/02424；WO 01/07407；WO 01/16357；WO01/32691；WO 01/40262；WO 01/58929；WO 01/64678；WO 01/74768；WO01/77113；WO 01/81325；WO 02/08187；WO 02/08198；WO 02/08244；WO02/08251；WO 02/08256；WO 02/18369；WO 02/60926及WO 02/79234。
本发明的一个优点是本发明提供三肽化合物，其抑制C型肝炎病毒复制所必需的NS3蛋白酶。而且，这些化合物能抑制在复制子细胞模型中的HCVRNA复制。
本发明一方面的另一优点是这些化合物特异地抑制NS3蛋白酶而对其他丝氨酸蛋白酶如人白细胞弹性蛋白酶(HLE)，猪胰弹性蛋白酶(PPE)，或牛胰凝乳蛋白酶，或半胱氨酸蛋白酶如人肝组织蛋白酶B(Cat B)并不显示明显的抑制活性。

发明内容
本发明范围内包括式(1)化合物 其中R1是羟基或NHSO2R1A；其中R1A是(C1-8)烷基，(C3-7)环烷基或{(C1-6)烷基-(C3-7)环烷基}，其全部视需要以卤素，氰基，硝基，O-(C1-6)烷基，酰氨基，氨基或苯基进行1至3次取代，或R1A是C6或C10芳基，其是视需要以卤素，氰基，硝基，(C1-6)烷基，O-(C1-6)烷基，酰氨基，氨基或苯基进行1至3次取代；R2是(C4-6)环烷基；R3是t-丁基或(C5-6)环烷基及R4是(C4-6)环烷基；或其医药上可接受的盐。
本发明范围内包括药物组合物，其含抗C型肝炎病毒有效量的式I化合物或其治疗上可接受的盐，及与其混合的医药上可接受的载剂介质或助剂。
根据本发明一具体实施例，本发明药物组合物还含有干扰素(聚乙二醇化或非聚乙二醇化的)，或病毒唑，或一种或多种其它抗-HCV剂，或以上诸剂的任何组合物。
本发明另一重要方面包括通过给药哺乳动物抗C型肝炎病毒有效量的式I化合物，其治疗上可接受的盐，或上述组合物，单独给予或与一种或多种干扰素(聚乙二醇化或非聚乙二醇化)，或病毒唑，或一种或多种其他抗-HCV剂一起给予或分别给药以治疗哺乳动物的C型肝炎病毒感染的方法。
本发明另一重要方面包括通过给药哺乳动物抗C型肝炎病毒有效量的式I化合物，其治疗上可接受的盐，或上述组合物，单独给予或与一种或多种干扰素(聚乙二醇化或非聚乙二醇化)，或病毒唑，或一种或多种其他抗-HCV剂一起给予或分别给药以预防哺乳动物的C型肝炎病毒感染的方法。
本发明范围还包括如本文所述的式I化合物，在制备用于治疗或预防C型肝炎病毒感染的药物中的用途。
本说明书涉及许多文献，其内容以参考列入。
优选实施方式的详述定义如本文所用，使用下述定义除非另有说明在涉及各实例时，(R)或(S)用于指明式I化合物取代基的绝对构形或不对称中心，这规定是用于整个化合物的说明而不是只用于取代基或不对称中心的说明。
本文所用的“P1，P2，及P3”是指从肽类似物C-端开始延伸至N-端的氨基酸残基的位置(即P1是指从C-端开始的1位，P2是指从C-端开始的2位，依此类推)(见Berger A.& Schechter I.，Transactions of the Royal Society LondonSeriesB257，249-264(1970))。
本文用的“乙烯基-ACCA”是指下式化合物 即，(1R，2S)1-氨基-2-乙烯基环丙基羧酸。
本文所用的“(C1-8)烷基”一词，不管单独使用或与另一取代基一起使用，是指含1至8个碳原子的非环形的直链或支链烷基取代基，包括，例如，甲基，乙基，2-甲基己基，1，1-二甲基己基(或叔-丁基)，及辛基。
本文所用的“(C3-7)环烷基”一词，不论单独使用或与其他取代基一起使用，是指含3至7个碳原子的环烷基取代基，包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基及环庚基。
本文所用的“{(C1-6)烷基-(C1-6)环烷基}”一词，是指含3至6个碳原子的环烷基，它直接键合到含1至6个碳原子的亚烷基上；例如环丙基甲基，环戊基乙基，环己基甲基，环己基乙基。在R1A是{(C1-6)烷基-(C1-6)环烷基}时，这基团是通过(C1-6)烷基(即亚烷基部分)连接到SO2基上。
本文所用的“C6或C10芳基”一词，不论单独使用或和其他基团一起使用，是指含6个碳原子的芳族单环基团或含10个碳原子的芳族双环基团。例如包含苯基，1-萘基或2-萘基的芳基。
本文所用的“O-(C1-6)烷基”一词，不论单独使用或与其他基团一起使用，是指-O-(C1-6)烷基，其中烷基的定义如上述，含至多六个碳原子，包括甲氧基，乙氧基，丙氧基，1-甲基乙氧基，丁氧基，及1，1-二甲基乙氧基。后一基团一般称作叔-丁氧基。
本文所用的“卤素”一词是指选自溴、氯、氟或碘的卤素取代基。
本文所用的“医药上可接受的盐”一词是指式(1)化合物的盐，在正确的医学判断范围内，适用于与人及低等动物的组织相接触而没有不适当的毒性，刺激性，过敏反应等，与合理的利益/风险比相匹配，一般是水溶性或油溶性，或是易分散的，在其使用上是有效的。此词包括医药上可接受的酸加成盐及医药上可接受的碱加成盐。适宜的盐的表见于S.M.Birge等人.，J.Pharm.Sci.，1977，66，页1-19，今全文附上供参考。
“医药上可接受的酸加成盐”一词是指保持生物有效性及游离态碱的性质，并且是非生物上或其他方面不需要的，它与无机酸如盐酸，氢溴酸，硫酸，氨磺酸，硝酸，磷酸，等，及有机酸如醋酸，三氯乙酸，三氟乙酸，己二酸，藻酸，抗坏血酸，天冬氨酸，苯磺酸，苯甲酸，2-乙酰氧基苯甲酸，丁酸，樟脑酸，樟脑磺酸，肉桂酸，柠檬酸，二葡糖酸，乙烷磺酸，谷氨酸，乙醇酸，甘油基磷酸，半硫酸，庚酸，己酸，甲酸，富马酸，2-羟基乙烷磺酸(羟乙磺酸)，乳酸，马来酸，羟基马来酸，苹果酸，丙二酸，扁桃酸，均三甲苯磺酸，甲烷磺酸，萘磺酸，烟酸，2-萘磺酸，草酸，双羟萘酸，果胶酯酸，苯基醋酸，3-苯基丙酸，苦味酸，新戊酸，丙酸，丙酮酸，水杨酸，硬脂酸，丁二酸，对氨基苯磺酸，酒石酸，对-甲苯磺酸，十一碳烷酸，等所成的盐。
“医药上可接受的碱加成盐”一词是指保持生物有效性及游离酸的性质，并且是非生物上或其他方面不需要的，其是与无机碱如氨或铵或金属阳离子如钠，钾，锂，钙，镁，铁，锌，铜，锰，铝等的氢氧化物，碳酸盐或碳酸氢盐所成的盐。特佳的是铵，钾，钠，钙，及镁盐。由医药上可接受的有机的非毒性的碱衍生的盐包括伯，仲，及叔胺，季铵化合物，经取代的铵，包括天然产生的经取代的胺，环胺及碱离子交换树脂，如甲基胺，二甲基胺，三甲基胺，乙基胺，二乙基胺，三乙基胺，异丙基胺，三丙基胺，三丁基胺，乙醇胺，二乙醇胺，2-二甲基氨基乙醇，2-二乙基氨基乙醇，二环己基胺，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，咖啡因，海巴明，胆碱，甜菜碱，亚乙基二胺，葡糖胺，甲基葡糖胺，可可碱，嘌呤，哌嗪，哌啶，N-乙基哌啶，四甲基铵化合物，四乙基铵化合物，吡啶，N，N-二甲基苯胺，N-甲基哌啶，N-甲基吗啉，二环己基胺，二苄基胺，N，N-二苄基苯乙胺，1-二苯羟甲胺，N，N′-二苄基亚乙基二胺，聚胺树脂等所成的盐。特佳的有机非毒性碱是异丙基胺，二乙基胺，乙醇胺，三甲基胺，二环己基胺，胆碱及咖啡因。
本文所用的“抗病毒剂”一词是指有效抑制哺乳动物中的病毒生成及/或复制的制剂(化合物或生物制剂)。这包括干扰哺乳动物内病毒生成及/或复制所需的宿主或病毒机理的制剂。抗病毒剂包括，例如，病毒唑，金钢烷胺，VX-497(merimepodib，Vertex Pharmaceuticals)，VX-498(Vertex Pharmaceuticals)，Levovirin，Viramidine，Ceplene(maxamine)，XTL-001及XTL-002(XTLBiopharmaceuticals)。
本文所用的“其他抗-HCV剂”一词是指减少或预防有关C型肝炎疾病症状的进展的制剂。此类制剂可选自抗病毒制剂，免疫调节制剂，HCV NS3蛋白酶抑制剂，HCV聚合酶抑制剂或HCV生命周期中另一目标的抑制剂。
本文所用的“免疫调节剂”一词是指有效增强或提高哺乳动物免疫系统反应的制剂(化合物或生物制剂)。免疫调节剂包括，例如，I类干扰素(如α-，β，及ω-干扰素，τ-干扰素，共有区干扰素及脱唾液酸干扰素(asialo-interferons))，II类干扰素(如γ-干扰素)及聚乙二醇化干扰素。
本文所用的“HCV NS3蛋白酶抑制剂”一词是指有效抑制哺乳动物HCVNS3蛋白酶的功能的制剂(化合物或生物制剂)。HCV NS3蛋白酶抑制剂包括例如，在WO 99/07733，WO 99/07734，WO 00/09558或WO 00/09543或WO00/59929或WO 02/060926中所述的化合物，Boehringer Ingeheim临床候补确证为BILN2061，及Vertex/Eli Lilly预发展候补确证为VX-950或LY-570301的化合物。特别是在WO 02/060926中第224-226页的表中所公开的化合物#2，3，5，6，8，10，11，18，19，29，30，31，32，33，37，38，55，59，71，91，103，104，105，112，113，114，115，116，120，122，123，124，125，126和127，可和本发明化合物组合使用。
本文所用的“HCV聚合酶抑制剂”一词是指有效抑制哺乳动物内的HCV聚合酶的功能的制剂(化合物或生物制剂)，这包括，例如，HCV NS5B聚合酶抑制剂。HCV聚合酶抑制剂包括非核苷，例如，描述于以下的化合物-US申请No 10/198680，相当于PCT/CA02/01127，两者在2002，7，18日申请(Boehringer Ingelheim)-US申请No 10/198384，相当于PCT/CA02/01128，两者在2002，7，18日申请(Boehringer Ingelheim)-US申请No 10/198259，相当于PCT/CA02/01129，两者在2002，7，18日申请(Boehringer Ingelheim)-WO 02/00846 A1和WO 02/100851 A2(两者为Shire)-WO 01/85172 A1和WO 02/098424 A1(两者为GSK)-WO 00/06529和WO 02/06240 A1(两者为Merck)-WO 01/47883和WO 03/000254(两者为日本Tobacco)-EP 125628 A2(Agouron)又其它的HCV聚合酶抑制剂也包括核苷类似物，例如，这些化合物描述在-WO 01/90121 A2(Idenix)-WO 02/029903 A2(Biocryst Pharmaceuticals Inc.)和-WO 02/057287 A2和WO 02/057425 A2(两者为Merck/lsis)HCV聚合酶抑制剂的具体实施例包括JTK-002、JTK-003和JTK-109(日本Tobacco)。
本文所用的“HCV生活周期中另一目标的抑制剂”是指有效抑制哺乳动物内HCV生成及/或复制而不抑制HCV NS3蛋白酶功能的制剂(化合物或生物制剂)。这包括干扰在哺乳动物内生成及/或HCV复制所需的寄主或HCV病毒机制的制剂。HCV生活周期内另一目标的抑制剂包括，例如，抑制选自解旋酶、HCV NS2/3蛋白酶及内部核糖体进入位点中的目标的制剂。HCV生活周期内另一目标的抑制剂的具体实例包括ISIS-14803(ISISPharmaceuticals)。
本文所用的“HIV抑制剂”一词是指有效抑制哺乳动物内HIV生成及/或复制的制剂(化合物或生物制剂)。这包括干扰哺乳动物内HIV的生成及/或复制所需的寄主或病毒机制的制剂。HIV抑制剂包括，例如，核苷抑制剂，非核苷抑制剂，蛋白酶抑制剂，融合抑制剂及整合酶抑制剂。
本文所用的“HAV抑制剂”一词是指有效抑制哺乳动物内HAV生成及/或复制的制剂(化合物或生活制剂)。这包括干扰哺乳动物内HAV的生成及/或复制所需的寄主或病毒机制的制剂。HAV抑制剂包括A型肝炎疫苗，例如，Havrix(GlaxosSmithKline)，VAQAT(Merck)及Avaxim(Aventis Pasteur)。
本文所用的“HBV抑制剂”一词是指有效抑制哺乳动物内HBV生成及/或复制的制剂(化合物或生物制剂)。这包括干扰哺乳动物内HAV的生成及/或复制所需的寄主或病毒机制的制剂。HBV抑制剂包括，例如，抑制HBV病毒DNA聚合酶或HBV疫苗的制剂。HBV抑制剂的具体实例包括拉米夫定(Lamivudine)(Eprivir-HBV)，阿德福韦地匹福西(Adefovir Dipivoxil)，恩替卡韦(Entecavir)，FTC(Coviracil)，DAPD(DXG)，L-FMAU(Clevudine)，AM365(Amrad)，Ldt(Telbivudine)，monoval-LdC(Valtorcitabine)，ACH-126，443(L-Fd4C)(Achillion)，MCC478(Eli Lilly)，Racivir(RCV)，Fluoro-L及D核苷，Robustaflavone，ICN 2001-3(ICN)，Bam 205(Novelos)，XTL-001(XTL)，亚氨基-Sugars(Nonyl-DNJ)(Synergy)，HepBzyme；及免疫调节剂产物如干扰素α-2b，HE2000(Hollis-Eden)，Theradigm(Epimmune)，EHT899(Enzo Biochem)，胸腺素α-1(Zadaxin)，HBV DNA疫苗(PowderJect)，HBV DNA疫苗(Jefferon Center)，HBV抗原(OraGen)，BayHep B(Bayer)，Nabi-HB(Nabi)及抗B型肝炎(Cangene)；及HBV疫苗产物如Engerix B，Recombivax HB，GenHevac B，Hepacare，Bio-Hep B，TwinRix，Comvax，Hexavac。
本文所用的“I类干扰素”是指选自全部结合到I型受体的干扰素。这包括天然的及合成的I类干扰素。I类干扰素的实例包括α-，β-，ω-干扰素，τ-干扰素，共有区干扰素及脱唾液酸干扰素。
本文所用的“II类干扰素”是指选自全部结合到II型受体的干扰素。II类干扰素的实例包括γ-干扰素。
本发明药物组合物可含一种或多种另外的活性剂，选自，例如，抗病毒剂，免疫调节剂，其他HCV NS3蛋白酶抑制剂，HCV聚合酶抑制剂，HCV生活周期中另一目标的抑制剂，HIV抑制剂，HAV抑制剂，及HBV抑制剂。这类制剂的实例见以上定义段内所提供的。
此类制剂中某些优选实例如下·抗病毒剂病毒唑及金钢烷胺；·免疫调节剂I类干扰素，II类干扰素及聚乙二醇化干扰素；·HCV生活周期中另一目标的抑制剂，其抑制目标选自NS3解旋酶，HCVNS2/3蛋白酶或内部核糖体进入位体(IRES)；·HIV抑制剂核苷抑制剂，非核苷抑制剂，蛋白酶抑制剂，融合抑制剂及整合酶抑制剂；或·HBV抑制剂抑制HBV病毒DNA聚合酶的制剂，或是HBV疫苗。
如上所述，可考虑组合治疗，其中将式(1)化合物，或其医药上可接受的盐与至少一种另外的制剂一起给药，所述另外的制剂是选自抗病毒剂，免疫调节剂，HCV NS3蛋白酶的另一种抑制剂，HCV聚合酶抑制剂，HCV生活周期内另一目标的抑制剂，HIV抑制剂，HAV抑制剂，及HBV抑制剂。这类制剂的实例见上定义段中所述。这类另外的制剂可与本发明化合物组合制成单一药物剂型。或者是，这些另外的制剂可作为多种剂型的一部分给药病人，例如，使用试剂盒。这些另外的制剂可在给予式(1)化合物，或其医药上可接受的盐，之前、同时、或之后给药病人。
本文所用的“治疗”一词是指给予本发明化合物或组合物以减轻或消除C型肝炎疾病症状及/或减少病人病毒载量。
本文所用的“预防”一词是指在个体曝露在病毒后但在出现症状前，及/或在血中检查出病毒前，给予本发明化合物或组合物。
优选实施方案优选的是，上述式1化合物，其中R1是羟基，NHSO2Me，NHSO2-环丙基，或NHSO2Ph。更佳是R1是NHSO2-环丙基或NHSO2Ph。或者最佳的R1是羟基。
优选是上述式1化合物，其中R2是环戊基或环己基。最佳是R2是环戊基。
R3优选是叔-丁基或环己基。最佳是R3是叔-丁基。
优选地以上限定的式1化合物，其中R4是环丁基或环戊基。最佳R4为环戊基。
更优选是上述式1化合物，其中R1是羟基，R2及R4各是环戊基及R3是叔-丁基。
更佳的式1化合物，其中R1是羟基，R2是环丁基，R3是叔-丁基及R4是环戊基。
更佳的式1化合物，其中R1是羟基，R2是环己基，R3是叔-丁基及R4是环戊基。
更佳的R1是NHSO2Ph，R2及R4各是环戊基及R3是t-丁基更佳的式1化合物，其中R1是羟基，R2是环戊基，R3是叔-丁基及R4是环丁基。
更佳的式1化合物，其中R1是羟基，R2是环戊基，R3是叔-丁基及R4是环己基。
更佳的式1化合物，其中R1是羟基，R2及R4各是环戊基，R3是环己基。
更佳的上述式1化合物，其中R1是羟基，R2，R3及R4各是环戊基。
根据另一实施方案，本发明的药物组合物可含有另外的抗-HCV剂。抗-HCV剂的实例包括α-，β，δ-，γ-，或ω-干扰素，病毒唑及金钢烷胺。
根据又一实施方案，本发明的药物组合物可另外含有另一抗-HCV NS3蛋白酶抑制剂。
根据又一实施方案，本发明的药物组合物可另外含有HCV聚合酶抑制剂。
根据又一实施方案，本发明的药物组合物可另外含有HCV生活周期中的其他目标的抑制剂，包括，但不限于，解旋酶，NS2/3蛋白酶或内部核糖体进入位点(IRES)的抑制剂。
本发明药物组合物可口服，肠胃外或经埋入的储存器给予。优选是口服或以注射给药。本发明药物组合物可含任何习用的非毒性药物可接受的载剂，助剂或赋形剂。在某些情形下，调配物的pH可用医药上可接受的酸、碱或缓冲剂调整以增强已调配的化合物或其输送形式的稳定性。本文所用的肠胃外包括皮下，皮内，静脉内，肌肉内，关节内，滑膜内，胸骨内，鞘内，及病灶内注射或输液技术。
本发明药物组合物可以是以灭菌注射制剂形式，例如灭菌的可注射的水性或油性悬浮液。这些悬浮液可根据现有技术中已知技术用适宜的分散剂或湿润剂(如吐温80)及悬浮剂调配。
本发明药物组合物可以以任何口服可接受的剂型经口给药，包括但不限于，胶囊，片剂，及水性悬浮液与溶液。如用于口服的片剂。一般使用的载剂包括乳糖及玉米淀粉。通常也可添加滑润剂如硬脂酸镁，以胶囊形式口服时，可用的稀释剂包括乳糖及干的玉米淀粉。在以水性悬浮液作口服时，将活性成分与乳化剂或悬浮剂组合。如有必要，可添加某些甜味剂及/或矫味剂及/或增色剂。
用于上述调配物及组合物的其他适宜的赋形剂或载体见于标准医药文献，例如“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，The Science and Practice ofPharmacy，19thEd.Mack Publishing Company，Easton，Penn.，(1995)。
约每天每公斤体重0.01至约100毫克之间，优选是约每天每公斤体重0.1至约50毫克的本文所述的蛋白酶抑制剂化合物的剂量是用作单一治疗以预防及治疗因HCV引起的疾病。一般是本发明药物组合物可以每天给予约1至约5次，或是以连续输液给予。此种给药可用作慢性和急性治疗。可与载剂物质组合制成单一剂型的活性成分的量可根据要治疗的宿主及具体给药方式而变化。典型制剂可含约5％至约95％活性化合物(重量/重量)。优选是此种制剂含约20％至约80％活性化合物。
精于本技术者会了解到，可能需要较上述剂量更低或更高的剂量。对任何具体病人所需的具体剂量及治疗方案将取决于各种因素，包括所用具体化合物的活性，年龄，体重，一般健康情况，性别，饮食，给予时间，排泄速度，组合的药物，感染的严重性及感染过程，病人对感染的倾向及治疗医生的判断。一般而言，治疗是以较肽的适度剂量为小的剂量开始。其后，剂量以小幅度增加直至环境下的适宜效果。一般而言，化合物最需要是以产生抗病毒效果而不产生任何有害或不良副作用的浓度给予。
当本发明组合物包含式1化合物及一种或多种其他治疗剂或预防剂时，这两种化合物及另外的制剂所存在的剂量约10至100％，较佳是在单一治疗方案中通常给予的剂量约10至80％。
当这些化合物或其药物上可接受的盐与医药上可接受的载剂一起调配时，所得组合物可活体内给予哺乳动物，如人，以抑制HCV NS3蛋白酶或治疗或预防HCV病毒感染。这种治疗也可以本发明化合物与其他的剂组合使用，这些制剂包括，但不限于，α-，β，δ-，ω-，τ-或γ-干扰素，病毒唑及金钢烷胺；其它的HCV NS3蛋白酶抑制剂；HCV聚合酶抑制剂；HCV生活周期其它目标的抑制剂，包括但不限于解旋酶，NS2/3蛋白酶，或内部核糖体进入位点(IRES)的抑制剂；或其混合物。这些另外的制剂可与本发明化合物组合成单一剂型。或者是，这些另外的制剂可作为多剂型的一部分而分开给予哺乳动物。
因此，本发明另一实施方案是提供通过给予式I化合物而抑制哺乳动物内HCV NS3蛋白酶活性的方法。
在优选的实施方案中，这方法用于降低感染哺乳动物的C型肝炎病毒的NS3蛋白酶活性的方法。
如果药物组合物只含本发明化合物作为活性成分，此法还可包括给予所述哺乳动物选自免疫调节剂，抗病毒剂，HCV NS3蛋白酶抑制剂，HCV聚合酶抑制剂，或HCV生活周期中其它目标如解旋酶，NS2/3蛋白酶或IRES的抑制剂的制剂的步骤。这些另外的制剂可在给予本发明组合物之前、同时、或之后给予哺乳动物。
本文所述的式1化合物也可用作实验室试剂。本发明化合物也可用于治疗或预防物料的病毒污染，因而减少接触这类物料(例如血液，组织，外科器材及衣物，实验室仪器及衣物，血液收集设备及物料)的实验室或医务人员或病人的病毒感染的危险性。
本文所述式1化合物也可用作研究试剂。式1化合物也可用作正面对照以有效代替细胞基的检测或体外或体内病毒复制的检测。
本发明其他详情以下述实施例说明，应了解到这些实施例并非限制所附权利要求书的范围。
方法论一般而言，式1化合物及其中间体是以已知方法使用适于反应物的已知反应条件进行制备。有数种方法揭示在WO 00/09543，WO 00/09558及美国专利6,323,180号，这些文选列入本文作为参考。
式I化合物，其中R1是本文所限定的NHSO2R1A，是通过偶合对应的式I的酸(即R1是羟基)与适宜的式R1ASO2NH2的磺酰胺在有偶合剂存在下以标准条件偶合而制备。虽然可用数种已知的偶合剂，已发现TBTU及HATU是实用的。这种磺酰胺可由市场购得，或可用已知方法制备。
下列方案说明使用已知方法的二种方便方法以制备R1为OH的式1化合物。
方案1 R1是OH的式I化合物方案2 R1是OH的式I化合物实施例温度以摄氏度表示。除非另有说明，溶液百分比以重量/容积关系表示，溶液比以容积/容积关系表示。核磁共振(NMR)谱以Bruker 400MHz分光计记录；化学位移(δ)以每百万分之份数报导。闪色层法以硅胶(SiO2)根据Still氏闪色层技术进行(W.C.Still等人，J.Org.Chem.，(1978)，43，2923)。
实施例中所用缩写包括DBU1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-碳；DCM二氯甲烷；DIAD二异丙基偶氮二羧酸酯；DIEA二异丙基乙基胺；DIPEA二异丙基乙基胺；DMFN，N-二甲基甲酰胺；DMAP4-(二甲基氨基)吡啶；EtOAc醋酸乙酯；HATU[O-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓六氟磷酸盐]；HPLC高效液体色层法；MS质谱(MALDI-TOF基质强制激光解吸电离-飞行时间(Matrix Assisted Laser Disorption Ionization-Time of Flight)；FAB快原子轰击)；Me甲基；MeOH甲醇；Ph苯基；R.T.室温(18至22℃)；叔-丁基或t-丁基1，1-二甲基乙基；Tbg叔-丁基甘氨酸叔-亮氨酸；TBTU2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓四氟硼酸盐；TFA三氟乙酸；及THF四氢呋喃。
式(I)化合物的合成二肽中间体15(方案2)及2-甲酯基-4-羟基-7-甲氧基喹啉9(方案1)是根据WO 00/09543所述方法合成。
二肽1的合成 将Boc-羟基脯氨酸(50.0克，216毫摩尔)，乙烯基-ACCA甲基酯(42.25克，238毫摩尔，1.1当量)，TBTU(76.36克，238毫摩尔，1.1当量)及DIPEA(113毫升，649毫摩尔，3当量)在DMF(800毫升)内的混合物在氮气下于室温搅拌。3.5小时后，蒸发溶剂，残余物用EtOAc萃取。萃取物用盐酸(10％)，饱和碳酸氢钠及盐水洗。然后将有机相于硫酸镁上干燥，过滤，蒸发，以得到油体。在高真空下干燥过夜后，得二肽1，呈黄色泡沫体(72.0克，94％，以HPLC测定纯度＞95％)。
二肽3的制备 将二肽1(72.0克，203毫摩尔)，三苯基膦(63.94克，243毫摩尔，1.2当量)及4-硝基苯甲酸(41.08克，245.8毫摩尔，1.2当量)溶于无水THF(1.4升)中。将搅拌的溶液在氮气下冷至0℃。然后用45分钟滴加二乙基偶氮二羧酸酯(38.4毫升，244毫摩尔，1.2当量)，使反应物升至室温。4小时后，蒸发溶剂。将残余物分成四份。每一份都于细硅胶(10-40微米筛目，柱直径12cm，柱长16厘米)上用梯度2∶1的己烷/EtOAc至1∶1己烷/EtOAc至纯EtOAc淋洗进行色层纯化。以这样得到Boc-二肽酯2，经蒸发溶剂并于高真空于70℃干燥1小时后呈无定形白色固体(108.1克，定量-105％)。于此Boc-二肽酯2(108克，243毫摩尔)中加入4N盐酸于二噁烷内的溶液后，得无色溶液。将此溶液于室温下搅拌1小时。蒸发溶剂，将残余物置于高真空下3小时，得化合物3的盐酸盐，呈无定形固体。该固体即可以原状使用。
氨基甲酸酯4的合成氨基甲酸酯4a的制备 0℃下在叔-丁基甘氨酸甲基酯(590毫克，3.25毫摩尔)于THF(8毫升)内的溶液中加入乙烯基氯甲酸酯(0.55毫升，6.47毫摩尔)及三乙基胺(1.15毫升，8.25毫摩尔)。使温度升至室温。将溶液搅拌16小时。然后浓缩溶液，将残余物溶于EtOAc内。这EtOAc溶液用10％柠檬酸水溶液(2x)，饱和NaHCO3水溶液(2x)及盐水洗涤，干燥，浓缩，得到对应的乙烯基氨基甲酸酯(608毫克)，呈无色油体。将此油体溶于DCM(4毫升)内，冷至0℃，加二碘甲烷(0.15毫升，1.86毫摩尔)及二乙基锌(95毫升，0.93毫摩尔)。先出现白色固体，但随时间(约1小时)溶解。将此悬浮液/溶液在室温搅拌5小时。加入饱和氯化铵溶液，此溶液用EtOAc(2x)萃取。将有机萃取物干燥(MgSO4)并浓缩。残余物作闪柱色层法纯化。用己烷∶EtOAc 95∶5洗脱，得对应的甲基酯，呈无色油体(96毫克，90％产出率)。
将此甲基酯(93毫克，0.41毫摩尔)在THF(5毫升)，MeOH(1毫升)中的溶液及LiOH(45毫克，1.81毫摩尔)在水(2毫升)内的溶液搅拌4小时。此溶液用水稀释，并用EtOAc(2x)萃取。水溶液通过加入1N HCl酸化，酸性溶液用EtOAc(2x)萃取。将合并的有机萃取物干燥(MgSO4)，过滤，并蒸发，以得到所需氨基甲酸酯4a，呈白色固体(53毫克，60％产出率)。
氨基甲酸酯6b的制备 将THF(350毫升)加到装有碳酸环戊基酯2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯(9.00克；39.6毫摩尔)及叔-丁基甘氨酸(6.24克；47.5毫摩尔)的烧瓶内，生成悬浮液。在强烈搅拌下加入蒸馏水(100毫升)。剩有少量未溶解的固体。然后加入三乙基胺(16.6毫升；119毫摩尔)，生成均匀溶液，将此溶液在室温下搅拌。2.5小时后，蒸发THF，水性残余物用水(100毫升)稀释。加1N NaOH使溶液成碱性(25毫升-最后pH＞10)。此溶液用EtOAc(2×200毫升)洗，用1N HCl酸化(约70毫升-最后pH＞2)。此混浊溶液用EtOAc(200+150毫升)萃取。将萃取物干燥(MgSO4)，蒸发，得氨基甲酸酯4b，呈白色固体(8.68克)。
其他氨基甲酸酯的制备用上述程序并用叔-丁基甘氨酸，环戊基甘氨酸，或环己基甘氨酸及碳酸环丁基、环戊基、或环己基酯2，5-二氧代-吡咯烷-1-基酯，制得以下各式的氨基甲酸酯
脲5的制备 将叔-丁基甘氨酸苄基酯盐酸盐(2.55克；9.89毫摩尔)在THF(20毫升)及吡啶(2.0毫升，24.73毫摩尔)内的溶液冷至0℃。于此冷溶液内滴加苯基氯甲酸酯(1.30毫升；10.19毫摩尔)。所得悬浮液于0℃搅拌5分钟，然后于室温搅拌1.5小时。反应混合物用EtOAc稀释，用10％柠檬酸(2x)，水(2x)，饱和NaHCO3(2x)，水(2x)及盐水(1x)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发，得粗制化合物，呈近无色油体(3.73克；＞100％；设想为9.89毫摩尔)。将此粗制产物(1.01克，2.97克毫摩尔)溶于DMSO(6.5毫升)内，滴加环戊基胺。反应混合物在室温搅拌45分钟。反应混合物用EtOAc稀释。有机相用10％柠檬酸(2x)，水(2x)，饱和NaHCO3(2x)，水(2x)及盐水(1x)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发，得到粗制环戊基脲-Tbg-OBn产物，呈近无色油体。此粗制物质用二氧化硅进行闪柱色层纯化，用己烷∶EtOAc 9∶1以除去较少极性杂质，并用7∶3己烷∶EtOAc洗脱纯化产物，呈粘稠无色油体(936毫克；95％)。将此酯苄基酯产物(936毫克；2.82毫摩尔)在氢气充满的球形瓶中室温下在无水甲醇(15毫升)溶液内通过搅拌有10％Pd/C(93.6毫升)的溶液5.5小时以去保护。反应混合物用0.45微米过滤器过滤，并蒸发至干，得脲5，呈白色固体(668.8毫克，98％)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.39(s，1H)，6.09(d，J＝7.4Hz，1H)，5.93(d，J＝9.4Hz，1H)，3.90(d，J＝9.4Hz，1H)，3.87-3.77(m，1H)，1.84-1.72(m，2H)，1.63-1.42(m，4H)，1.30-1.19(m，2H)，0.89(s，9H)。
M.S.(电喷)241.0(M-H)-243.0(M+H)+。反相HPLC均一性(0.06％TFA；CH3CN∶H2O)99％三肽6的合成 将氨基甲酸酯4b(6.15克；22.5毫摩尔)及TBTU(7.72克，24.7毫摩尔)悬浮于DCM内，迅速搅拌悬浮液。在室温加入DIPEA(3.92毫升，22.5毫摩尔)，10分钟后反应物已近均质化。然后将二肽3(10.39克；23.6毫摩尔)在含DIPEA(4.11毫升，23.62毫摩尔)的无水DCM(100毫升)内的溶液倒入反应物内。将所得黄色溶液搅拌14小时。然后蒸发溶剂，得黄色浆料，再以EtOAc(300+150毫升)萃取，用0.05N HCl(2×200毫升)，饱和Na2SO4(300毫升)及盐水(150毫升)洗涤。合并的萃取物于MgSO4上干燥，并蒸发，得三肽6，呈灰黄色泡沫体(15.68克，定量)。
三肽7的合成 将三肽6(15.68克)溶于THF(200毫升)内，并加入水(30毫升)。将所得溶液冷至0℃，在3分钟期间在强烈搅拌下加入氢氧化锂·一水合物(1.18克，28.12毫摩尔)。于0℃3小时后，多余的碱以1N HCl中和(最终pH约6)，蒸发THF，得水性悬浮液(黄色胶体)。此混合物以EtOAc(2×200毫升)萃取并用饱和NaHCO3(2×300毫升)洗涤。将合并的萃取物在MgSO4上干燥，并蒸发，得淡黄色泡沫体。泡沫体在硅胶上的闪色层法，是使用EtOAc作洗脱剂，得7，呈白色无定形固体(9.77克，91％)。
硫脲8的制备硫脲8a的合成
将叔-丁基异硫代氰酸酯(5.0毫升；39.4毫摩尔)在DCM(200毫升)内的溶液中加入环戊基胺(4.67毫升，47.3毫摩尔)，再加DIEA，并将该反应混合物于室温搅拌2小时。此混合物以EtOAc稀释，用10％柠檬酸水溶液(2x)，饱和NaHCO3(2x)，H2O(2x)及盐水(1x)洗涤。将有机层在无水MgSO4上干燥，过滤，蒸发，以得到N-叔-丁基-N-环戊基硫脲，呈白色固体(3.70克；47％产出率)。将此N-叔-丁基-N-环戊基硫脲(3.70克)溶于浓HCl(46毫升)内。所得暗黄色溶液轻轻回流加热。40分钟后，将反应混合物冷至室温，再于冰内冷却，以固体及饱和NaHCO3水溶液碱化至pH9.5。将产物萃取入EtOAc(3x)内。合并的EtOAc萃取物用H2O(2x)及盐水(1x)洗涤。将有机层干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，以得米色固体(2.46克粗制产物)。此粗制产物在己烷/EtOAc 95/5中研磨，经过滤后得N-环戊基硫脲8a，呈白色固体(2.38克；90％产出率)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.58(bs，1H)，7.19(bs，1H)，6.76(bs，1H)，4.34(bs，1H)，1.92-1.79(m，2H)，1.66-1.55(m，2H)，1.55-1.30(m，4H)。MS；es+144.9(M+H)+，es-142.8(M-H)-。
硫脲8b的制备用上述方法使用商业上可购得的环丁基胺代替环戊基胺，制得硫脲8b 硫脲8c的制备用上述方法使用商业上可购得的环己基胺代替环戊基胺，制得硫脲8c
硫脲8d的制备 在KSCN(4.60克；47.33毫摩尔)在丙酮(35毫升)内的溶液中在0℃滴加苯甲酰氯(5.0毫升；43.03毫摩尔)。将此乳状溶液于冰浴内搅拌1.5小时，然后滴加环丙基胺(3.2毫升；46.0毫摩尔)。此反应混合物于0℃搅拌1.5小时，再加入环丙基胺(0.50毫升，7.22毫摩尔)，并将反应混合物于室温再搅拌30分钟。将此反应混合物倒入冰/H2O(300毫升)内，搅拌5分钟，过滤浅黄色固体，用H2O洗数次，并干燥，得到N-苄基氧基-N′-环丙基硫脲(6.62克)。将此硫脲悬浮在2N NaOH(50毫升)的溶液内，并回流加热15分钟。将此溶液冷至室温，用固体NaCl饱和，并用EtOAc(3x)萃取。合并的EtOAc萃取物用H2O(2x)及盐水(1x)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发，得粗制产物，呈灰白色固体。此固体在己烷/EtOAc 5/5中研磨，得N-环内基硫脲8d，呈白色晶状固体(2.5克；50％产出率)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ7.92(bs，1H)，7.61(bs，1H)，7.13(bs，1H)，2.39(bs，1H)，0.67-0.63(m，2H)，0.51-0.44(m，2H)，MS；es+116.9(M+H)+，es-114.8(M-H)-。
实施例1化合物100的制备步骤1三肽10的合成 于三肽1(1.0克；2.09毫摩尔)溶于THF(35毫升)内的溶液中加入羟基喹啉9(729毫克；3.13毫摩尔)及三苯基膦(1.1克；4.2毫摩尔)。将此黄色悬浮液于冰浴内冷却，滴加DIAD(821微升，4.2毫摩尔)。将此溶液在冰浴温度下搅拌30分钟，在室温搅拌16小时。将溶液蒸发至干，残余物溶于EtOAc内，用饱和碳酸氢钠溶液(2x)，水(2x)及盐水(1x)洗，干燥(MgSO4)，过滤，蒸发，得到黄色油体，静置沉淀。将此粗制固体悬浮于DCM内，滤除不溶解物质。将溶液浓缩，残余物以闪色层法纯化，以己烷∶EtOAc 5∶5除去全部较少的极性杂质，以CHCl3∶EtOAc 80∶20淋洗直至所有Ph3P＝O洗脱。所需化合物以CHCl3∶EtOAc 65∶35洗脱，呈白色固体(1克；70％产出率)。
M.S.(电喷)693.3(M-H)-695.4(M+H)+717.4(M+Na)+。
反相HPLC均一性(0.06％TFA；CH3CN∶H2O)99％。
步骤2酯10的选择性单水解 将三肽10(1克；1.44毫摩尔)溶于THF(10毫升)及MeOH(5毫升)内，加水(5毫升)及1N NaOH水溶液(1.5毫升)，此溶液于室温搅拌2小时。将混合物蒸发至干，然后与MeOH∶甲苯(1∶1；4x)，甲苯(2x)及二乙醚(2x)共同蒸发，得产物(无水)，呈白色片状固体(1.04克；100％产出率)。
M.S.(电喷)679.3(M-H)-681.3(M+H)+703.3(M+Na)+。
反相HPLC均一性(0.06％TFA；CH3CN∶H2O)95％。
重氮酮12的合成 将钠盐11(设为1.44毫摩尔)溶于THF(16毫升)内，加入三乙基胺(301微升；2.16毫摩尔)，将此溶液冷至0℃。滴加异丁基氯甲酸酯(280微升；2.16毫摩尔)，并将白色悬浮液于0℃搅拌75分钟，再加入重氮甲烷(0.67M，于二乙醚内；13毫升；8.64毫摩尔)。这反应混合物于0℃搅拌1小时，于室温搅拌45分钟，并蒸发成粘稠悬浮液。将此悬浮液溶于EtOAc及水内。有机溶液用饱和NaHCO3溶液(2x)，水(2x)及盐水(1x)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，蒸发，得重氮酮产物，呈象牙白固体(用于下一步骤的粗制物质；设为1.44毫摩尔)。
M.S.(电喷)703.3(M-H)- 705.3(M+H)+。
反相HPLC均一性(0.06％TFA；CH3CN∶H2O)91％。
步骤4溴酮13的合成 在0℃下，于重氮酮12(1.44毫摩尔)在THF(24毫升)内的溶液中滴加HBr溶液(1.0毫升)，将此混合物搅拌1小时。该溶液用EtOAc稀释，用饱和NaHCO3溶液(2x)，水(2x)及盐水(1x)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，蒸发，得到所需溴酮为米色固体(1.1克；设为1.44毫摩尔)。
M.S.(电喷)757.3(M) 759.3(M+2)步骤5噻唑基三肽14的合成 将α-溴酮13(0.40毫摩尔)及N-环戊基硫脲(68.5毫克；0.48毫摩尔)溶于异丙醇(15毫升)内，该黄色溶液在70℃加热75分钟。使该溶液冷至室温，蒸发至干。将残余物溶于EtOAc内。这溶液用饱和NaHCO3(2x)，水(2x)及盐水(1x)洗，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到橙棕色泡沫体。在己烷∶EtOAc7∶3中进行闪色层法移除较少的极性杂质，以己烷∶EtOAc 6∶4回收所需化合物，呈浅黄色泡沫体(218毫克；69％)。
M.S.(电喷)801.4(M-H)- 803.4(M+H)+ 825(M+Na)+。
反相HPLC均一性(0.06％TFA；CH3CN∶H2O)99％。
步骤6酯14的水解 化合物100将甲基酯14(145毫克；0.18毫摩尔)在THF(3毫升)、MeOH(1.5毫升)内的溶液与LiOH(75.8毫克；1.81毫摩尔)于水(1.5毫升)内的水溶液一起搅拌18小时。浓缩有机溶液得灰白色悬浮液，用EtOAc及盐水稀释，得总溶液。通过加入1N HCl将pH调整至6，并将有机层用EtOAc(2x)萃取。将合并的有机萃取物用水(2x)，盐水(1x)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，蒸发，得所需化合物，呈黄色固体(138.2毫克；97％产出率)。
转化为Na盐将化合物100(138.2毫克；0.175毫摩尔)溶于MeOH(30毫升)内，并加1当量0.1N NaOH(17.5毫升)。将此澄清的黄色溶液浓缩以除去MeOH，用水稀释，冻干，得产物(Na盐)，呈黄色无定形固体(139毫克；理论产出142毫克；MW Na盐810.95)。
M.S.(电喷)787.2(M-H)- 789.3(M+H)+ 811.3(M+Na)+。
反相HPLC均一性(0.06％TFA；CH3CN∶H2O)98％。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)约5∶1旋转异构体混合物δ8.14(bs，1H)，8.02(d，J＝9.2Hz，1H)，7.89(d，J＝6.7Hz，1H)，7.49-7.36(m，2H)，7.27(bs，1H)，7.06-6.96(m，2H)，6.10-5.90(m，1H)，5.33(s，1H)，5.01(d，J＝16.8Hz，1H)，4.84(d，J＝10.6Hz，1H)，4.79-4.65(m，1H)，4.47-4.40(m，1H)，4.30(d，J＝11.5Hz，1H)，4.15(d，J＝8.8Hz，1H)，4.00-3.85(m，2H)，3.90(s，3H)，2.37-2.26(m，1H)，2.15-1.91(m，2H)，1.80-1.23(m，18H)，0.96 & 0.86(2x s，9H)。
实施例2化合物101的制备以实施例1相同程序，在步骤5中用N-环丁基硫脲8b代替N-环戊基硫脲8a，得化合物101，呈TFA盐 化合物1011H NMR(400MHz，DMSO-d6)约90∶10旋转异构体混合物，主异构体描述；δ8.59(s，1H)，8.45-8.30(m，1H)，8.25(bs，1H)，8.02(d，J＝9.2Hz，1H)，7.84(bs，1H)，7.74(s，1H)，7.32-7.26(m，1H)，7.01(d，J＝8.3Hz，1H)，5.78-5.66(m，2H)，5.20(dd，J＝17.0，1.6Hz，1H)，5.09-5.04(m，1H)，4.53-4.36(m，4H)，4.05-3.92(m，2H)，3.97(s，3H)，2.63-2.55(m，1H)，2.44-2.29(m，3H)，2.07-1.95(m，3H)，1.79-1.23(m，12H)，0.96(s，9H)。
M.S.(电喷)773.4(M-H)- 775.4(M+H)+。
反相HPLC均一性(0.06％TFA；CH3CN∶H2O)98％。
实施例3化合物102的制备以实施例1相同程序，在步骤5中用N-环丁基硫脲8c代替N-环戊基硫脲8a，得化合物102，呈TFA盐 化合物1021H NMR(400MHz，DMSO-d6)约90∶10旋转异构体混合物，主异构体描述；δ8.61(s，1H)，8.26-8.17(m，2H)，8.13-8.04(m，1H)，7.81(bs，1H)，7.73(bs，1H)，7.32-7.24(m，1H)，7.07(d，J＝8.2Hz，1H)，5.78-5.65(m，2H)，5.23-5.15(m，1H)，5.09-5.03(m，1H)，4.51-4.43(m，3H)，4.05-3.77(m，3H)，3.97(s，3H)，2.64-2.55(m，1H)，2.38-2.27(m，1H)，2.05-1.95(m，3H)，1.79-1.71(m，2H)，1.66-1.19(m，16H)，0.96(s，9H)。
(M.S.(电喷)801.4(M-H)- 803.4(M+H)+。反相HPLC均一性(0.06％TFA；CH3CN∶H2O)99％。
实施例4化合物103的制备 化合物100化合物103将化合物100(30毫克；0.038毫摩尔)与HTAU(17毫克，0.045毫摩尔)合并，溶于无水DMF(4毫升)内。此溶液于室温搅拌后在约1分钟期间滴加DIPEA(26毫升，0.15毫摩尔)。此混合物于室温搅拌60分钟，以分析用HPLC分析该活化酯的形成。然后，加入苯磺酰胺(23毫克，0.15毫摩尔)，DMAP(17毫克，0.14毫摩尔)及DBU(22微升，0.15毫摩尔)于DMF(1毫升)中的溶液。该反应混合物于室温搅拌24小时，再倒入EtOAc(50毫升)内。并用饱和NaHCO3，及饱和盐水溶液洗涤。有机相于MgSO4上干燥，过滤，浓缩。将残余物在DMSO内重建，并以制备用HPLC纯化。冻干，得终产物(17毫克，48％)，呈灰黄色无定形固体。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)，δ10.89(s，1H)，8.84(s，1H)，8.20(d，J＝8.8Hz，1H)，8.18-8.08(m，2H)，7.89(d，J＝7.6Hz，2H)，7.70(dd，J＝7.6，7.6Hz，2H)，7.58(dd，J＝7.7，7.7Hz，2H)，7.28(bs，1H)，7.11(d，J＝6.6Hz，1H)，5.75(bs，1H)，5.37-5.25(m，1H)，5.12(d，J＝17Hz，1H)，4.92(d，J＝12Hz，1H)，4.58-4.42(m，3H)，4.24(bs，1H)，4.05(d，J＝7.8Hz，1H)，3.97(s，3H)，3.93(d，J＝7.8Hz，1H)，2.69-2.61(m，1H)，2.35-2.21(m，1H)，2.13-1.98(m，3H)，1.78-1.68(m，4H)，1.68-1.51(m，8H)，1.50-1.41(m，4H)，1.29-1.22(m，1H)，0.99(s，9H)。
M.S.(电喷)928.5(M+H)+，及926.5(M-H)-。
RP-HPLCRt＝7.3分钟(均一性＝99％)。
使用方案2所示合成顺序制得下述化合物实施例5步骤1二肽16的合成 将二肽15(4.0克；7.02毫摩尔)溶于THF(20毫升)内，并加入MeOH(10毫升)，水(10毫升)及1N NaOH水溶液(1.05当量，7.4毫升)。此溶液于室温搅拌2.75小时。将混合物蒸发至干。残余物用水稀释，冻干，得钠盐16，呈白色无定形固体(4.28克)。
M.S.(电喷)554.2(M-H)- 556.3(M+H)+ 578.2(M+Na)+。
反相HPLC均一性(0.06％TFA；CH3CN∶H2O)96％。
步骤2二肽重氮酮17的合成 将钠盐16(设为7.02毫摩尔)溶于THF(78毫升)内，加入三乙基胺(1.37毫升；9.83毫摩尔)，将此溶液冷至0℃。滴加异丁基氯甲酸酯(1.28毫升，9.83毫摩尔)，此白色悬浮液于0℃搅拌2小时，再加入重氮甲烷(0.67M在二乙醚内；62毫升；42.13毫摩尔)。此反应混合物在0℃搅拌1小时，于室温搅拌1.25小时，并蒸发得粘稠悬浮液。将此悬浮液溶于EtOAc及水内。有机溶液用饱和NaHCO3(2x)，水(2x)及盐水(1x)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，蒸发，得重二氮酮17，呈米色固体(此粗制物质用于下一步骤；设为7.02毫摩尔)。
M.S.(电喷)578.2(M-H)- 580.3(M+H)-。
反相HPLC均一性(0.06％TFA；CH3CN∶H2O)90％。
步骤3二肽溴酮18的合成 0℃下，在重氮酮(设为1.44毫摩尔)于THF(116毫升)内的溶液中滴加48％HBr水溶液(5.1毫升)，将此混合物搅拌2小时。此溶液用EtOAc稀释，用饱和NaHCO3溶液(2x)，水(2x)及盐水(1x)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，蒸发，得所需溴酮，呈米色固体(4.25克；7.62毫摩尔)。
M.S.(电喷)632(M) 634.2(M+2)。
步骤4二肽19的合成 将α-溴酮18(512毫克；0.81毫摩尔)及N-环戊基硫脲(128.4毫克；0.89毫摩尔)溶于异丙醇(20毫升)内。所得黄色溶液在70℃加热1.5小时。使溶液冷却至室温，并蒸发至干。残余物用EtOAc稀释。EtOAc溶液用饱和NaHCO3(2x)，水(2x)及盐水(1x)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得产物，呈橘棕色泡沫体。在己烷∶EtOAc 7∶3中进行闪柱色层纯化以移除较少的极性杂质，以己烷∶EtOAc 6∶4回收所需化合物，呈浅黄色固体(411.5毫克；75％)。
M.S.(电喷)676.3(M-H)- 678.3(M+H)+反相HPLC均一性(0.06％TFA；CH3CN∶H2O)99％。
步骤5三肽20的合成
将Boc-二肽(32.6克；0.048毫摩尔)溶于4N HCl/二噁烷(3毫升)，于室温搅拌。2小时后，通过蒸发至干收取反应混合物。这样得到的HCl盐为灰白色固体。将HCl盐置于高真空30分钟。在HCl盐的DMC(2毫升)及DIEA(33微升；0.192毫摩尔)的溶液内加脲5(13.96毫克；0.058毫摩尔)，然后加入HATU偶合剂(21.90毫克；0.058毫摩尔)。此反应混合物于室温搅拌3小时。再将反应混合物以EtOAc稀释，用饱和NaHCO3(2x)，水(2x)及盐水(1x)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤、蒸发，得粗制产物，为粘稠黄色油体(设为0.048毫摩尔)。
M.S.(电喷)800.4(M-H)- 802.4(M+H)+反相HPLC均一性(0.06％TFA；CH3CN∶H2O)95％。
步骤6三肽甲基酯20的水解 将甲基酯20(77.80毫克；0.097毫摩尔)在THF(2毫升)和MeOH(1毫升)中的溶液及LiOH(40.7毫克；0.97毫摩尔)在水(1毫升)内的溶液搅拌16小时。浓缩此有机溶液成灰白色悬浮液。此粗制物质以制备用HPLC纯化(YMCCombiscreen ODS-AQ，50×20毫米ID S-5微米，120A；λ＝220毫微米)，使用线性梯度及0.06％TFA CH3CN/H2O。合并纯化部分，浓缩，并转化成钠盐。
转化成钠盐将浓缩部分用EtOAc及少许盐水稀释(用5N NaOH碱化至pH约为13，然后用1N HCl中和至pH5.5-6.0)。以EtOAc(3x)萃取产物，用水(2x)及盐水(1x)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并蒸发至干，得中性产物，呈黄色固体(52.7毫克；70％)。将此中性产物(49.4毫克；0.0627毫摩尔)溶于MeOH(10毫升)中，并加入1当量0.01N NaOH(6.27毫升)。浓缩此澄清黄色溶液以除去MeOH，并用水稀释，冻干，得产物(Na盐)，为黄色无定形固体(50.8毫克；理论产出50.8毫克；MW Na盐809.75)。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)约8∶1旋转异构体混合物；δ8.20(bs，1H)，7.96(d，J＝8.8Hz，1H)，7.86(d，J＝5.7Hz，1H)，7.51-7.47(m，2H)，7.26(s，1H)，6.97(d，J＝8.6Hz，1H)，6.19-6.02(m，1H)，5.33(bs，1H)，4.99(d，J＝16.8Hz，1H)，4.77(d，J＝10.0Hz，1H)，4.52-4.41(m，2H)，4.34(d，J＝11.0Hz，1H)，4.04-3.96(m，2H)，3.89(s，3H)，3.79-3.68(m，1H)，3.68-3.15(水峰下，2H)，2.45-2.36(m，1H)，2.05-1.92(m，2H)，1.82-1.35(m，16H)，1.35-1.12(m，2H)，0.91 & 0.84(2xs，9H)。
M.S.(电喷)786.4(M-H)- 788.3(M+H)+ 810(M+Na)+。
反相HPLC均一性(0.06％TFA；CH3CN∶H2O)99％。
实施例6化合物104使用与实施例6所述相同程序，在步骤5中使用叔-丁基甘氨酸的环丁基胺基甲酸酯代替脲5，并在步骤6合用制备用HPLC将粗制羧酸纯化，得标题化合物，呈TFA盐 化合物1041H NMR(400MHz，DMSO-d6)约7∶1旋转异构体混合物；δ8.09(bs，1H)，8.02(d，J＝9.0Hz，1H)，7.88(d，J＝6.5Hz，1H)，7.45(s，1H)，7.40(s，1H)，7.28(d，J＝2.3Hz，1H)，7.16-7.08(m，1H)，7.07-7.00(m，1H)，6.10-5.95(m，1H)，5.32(bs，1H)，5.00(d，J＝17.2Hz，1H)，4.82(d，J＝11.4Hz，1H)，4.64-4.52(m，1H)，4.48-4.41(m，1H)，4.29(d，J＝11.7Hz，1H)，4.12(d，J＝8.6Hz，1H)，3.97-3.85(m，2H)，3.91(s，3H)，2.36-2.27(m，1H)，2.18-2.04(m，2H)，2.03-1.81(m，6H)，1.77-1.43(m，9H)，1.41-1.34(m，1H)，0.96 & 0.85(2xs，9H)。
M.S.(电喷)773.3(M-H)- 775.4(M+H)+。
反相HPLC均一性(0.06％TFA；CH3CN∶H2O)99％。
实施例7化合物105使用与实施例6所述相同程序，在步骤5中使用叔-丁基甘氨酸的环己基胺基甲酸酯代替脲5，得标题化合物，呈钠盐 化合物1051H NMR(400MHz，DMSO-d6)约5∶1旋转异构体混合物；δ8.29(bs，1H)，8.02(d，J＝9.0Hz，1H)，7.89(d，J＝6.5Hz，1H)，7.45(s，1H)，7.40(s，1H)，7.27(d，J＝2.2Hz，1H)，7.05(d，J＝8.6Hz，1H)，7.00(dd，J＝2.0，9.0Hz，1H)，5.89(bs，1H)，5.34(s，1H)，5.08(d，J＝17.0Hz，1H)，4.91(d，J＝9.4Hz，1H)，4.43(dd，J＝8.4，16.8Hz，1H)，4.36-4.24(m，1H)，4.14(d，J＝8.6Hz，1H)，4.00-3.86(m，3H)，3.89(s，3H)，2.35-2.23(m，1H)，2.04-1.91(m，5H)，1.79-1.41(m，10H)，1.39-1.08(m，7H)，0.97&0.86(2x s，9H)。
M.S.(电喷)801.4(M-H)- 803.4(M+H)+。
反相HPLC均一性(0.06％TFA；CH3CN∶H2O)98％。
实施例8化合物106
使用与实施例6所述相同程序，在步骤5中使用环己甘氨酸的环戊基氨基甲酸酯代替脲5，得标题化合物，呈钠盐1H NMR(400MHz，DMSO-d6)约1∶4旋转异构体混合物；δ8.22 & 8.04(2xs，1H)，8.00(d，J＝9.2Hz，1H)，7.91(d，J＝6.5Hz，1H)，7.46(s，1H)，7.41(s，1H)，7.27(d，J＝2.4Hz，1H)，7.20(d，J＝8.4Hz，1H)，7.01(dd，J＝2.4，9.0Hz，1H)，6.09-5.98(m，1H)，5.34(s，1H)，4.98(dd，J＝1.6，17.4Hz，1H)，4.80(d，J＝11.9Hz，1H)，4.73-4.67(m，1H)，4.43-4.31(m，2H)，4.05-3.95(m，2H)，3.95-3.84(m，1H)，3.90(，3H)，2.38-2.29(m，1H)，2.03-1.92(m，2H)，1.83-1.21(m，24H)，1.21-0.83(m，5H)M.S.(电喷)813.4(M-H)- 815.4(M+H)+。
反相HPLC均一性(0.06％TFA；CH3CN∶H2O)99％。
实施例9化合物107使用与实施例6所述相同程序，在步骤5中使用环戊基甘氨酸的环戊基氨基甲酸酯代替脲5，得标题化合物，再将其转化成对应的Na盐。
实施例10NS3-NS4A蛋白酶检测用以评估本发明化合物的酶检测见WO 00/09543及WO 00/59929。
实施例11细胞基的HCV RNA复制检测细胞培养以前述方法(Lohman等人，1999，Science 285110-113)确立稳定保持亚基因组HCV复制子的Huh7细胞，并定为S22.3细胞系。将S22.3细胞保持在加有10％FBS及1毫克/1毫升新霉素的Dulbecco’s改性的Earle培养基(DMEM)(标准培养基)内。检测期间，使用加有10％FBS的DMEM培养基，内含0.5％DMSO，但不含新霉素(测定培养基)。加入化合物前16小时，将S22.3细胞用胰蛋白酶消化，并用标准培养基稀释至50000细胞/毫升。取200微升(10000个细胞)分配在96孔盘的每一孔内。然后将盘在37℃在5％CO2下培养至第二天。
试剂及物料

试验化合物的制备将10微升试验化合物(于100％DMSO内)加到2毫升检测培养基内，使DMSO终浓度为0.5％，此溶液以超声波处理15分钟，用0.22微米MilliporeFilter Unit过滤。将900微升移入聚丙烯深孔滴定盘的A排中。B至H排含400微升等分的检测培养基(含0.5％DMSO)，并用于通过将400微升由一排移至另一排(H排不含化合物)而制备系列稀释(1/2)。
试验化合物对细胞的应用由含S22.3细胞的96孔的盘吸出细胞培养物。将有适宜稀释的试验化合物的175微升检测培养基由含化合物盘的每一孔转移至细胞培养物盘的每一对应孔(H排用作“无抑制对照”)。将细胞培养盘在37℃在5％CO2下培养72小时。
总细胞RNA的萃取培养72小时后，使用RNeasy 96试剂盒(Qiagen，RNeasy Handbook，1999)由96孔盘的S22.3细胞萃取总细胞RNA。简言之，由细胞完全取出检测培养基，并加入100微升的含143mMβ-巯基乙醇的RLT缓冲液(Qiagen)到96孔细胞培养盘的每一孔内。将此微盘(microplate)轻轻摇动20秒。然后将100微升70％乙醇加到每一微盘孔内，用吸移混合。取出溶胞产物，并施加到RNeasy 96(Qiagen)盘的孔中，将盘置于QiagenSquare-Well Block的顶部。用胶带将RNeasy 96孔盘密封，将有RNeasy 96孔盘的Square-Well Block载入固定器内，并置于4K 15C离心机的转桶(rotor bucket)中。将样品在室温以6000转/分钟(约5600×g)离心4分钟。由盘上除去胶带。并在RNeasy 96盘的每一孔内加入0.8毫升Buffer RW1(QiagenRNeasy 96试剂盒)。再用新胶带密封RNeasy 96盘，并在室温下以6000转/分钟离心4分钟。将RNeasy 96盘置于另一清洁的Square-Well Block顶上，除去胶带，在RNeasy 96盘的每一孔内加入0.8毫升Buffer RPE(QiagenRNeasy 96试剂盒)。再用新胶带密封RNeasy 96盘，室温下以6000转/分钟离心4分钟。除去胶带并在RNeasy 96盘的每一孔中加入另外0.8ml的Buffer RPE(QiagenRNeasy 96试剂盒)。再用新的胶带密封96盘并在室温以6000转/分钟离心10分钟，除去胶带，将RNeasy 96盘置于含1.2毫升收集微管的支架顶端。通过加入50微升无RNase的水到每一孔内而洗脱RNA，用新胶带将盘密封，并于室温培养1分钟。然后将盘于室温以6000转/分钟离心4分钟。再用第二容积50微升的无RNase的水重复该洗脱步骤。将含总细胞RNA的微管存于-70℃。
总细胞RNA的定量用RiboGreenRNA定量试剂盒(Molecular Probes)在STORM系统(Molecular Dynamics)上定量RNA。简言之，将RiboGreen试剂于TE(10mMTris-HCl pH＝7.5，1mM EDTA)内稀释200倍。通常，将50微升试剂稀释在10毫升TE中。将核糖体的RNA的标准曲线在TE内稀释至2微克/毫升，并将预定量(100，50，40，20，10，5，2及0微升)的核糖体RNA溶液移入新的96孔盘(COSTAR#3997)中，再用TE将容积加至100微升。通常，96孔盘的第一列用于标准曲线，其他的孔用于要定量的RNA样品。将要定量的10微升的每一RNA样品转移至96孔盘的对应的孔中，加入90微升TE。在96孔盘的每一孔内加100微升容积的稀释的RiboGreen试剂，并于室温下培养2至5分钟，避光(200微升终容积内的10微升RNA样品产生20X稀释)。每一孔的萤光强度用STORM系统(Molecular Dynamics)测定。基于已知量的核糖体RNA及生成的萤光强度制出标准曲线。由标准曲线及对20X稀释的校对测出实验样品中的RNA浓度。
试剂及物料

真实时间R.T.-PCR真实时间R.T.-PCR是用TaqMan EZ R.T.-PCR试剂盒(Perkin-ElmerApplied Biosystems)在ABI Prism 7700 Sequence Detection System上完成。通过用类似前述技术(Martell等人，1999，J.Clin.Microbiol.37327-332)的Taqman技术(Roche Molecular Diagnostics System)使RT-PCR适合于HCVRNA的5’IRES的定量。这系统使用AmpliTaq DNA聚合酶的5’-3’溶核活性。简言之，此方法利用双重标记的荧光团杂交探针(PUTR Probe)，这探针特别使PCR引物(引物8125及7028)间的模板退火。探针的5’端含萤光报导分子(6-羧基萤光素[FAM])而其3’端含萤光熄灭剂(6-羧基四甲基罗丹明[TAMRA])。通过在完整杂交探针上的熄灭剂抑制FAM报导分子的发射光谱。杂交探针的核酸酶降解释出报导分子，导致萤光发射的增加。ABI Prism 7700序列测定器是在PCR放大过程中测定萤光发射的增加，以致使放大的产物直接与信号成正比。于反应早期在代表产物积累的对数相的点上分析扩增区。代表一种有关用于序列测定器的PCR产物指数生长的萤光信号中增加的已确定的检测阈值的点定义为循环阈值(Cτ)。Cτ值与输入的HCV RNA量成反比；这样，在相同PCR条件下，HCV RNA的起始浓度越高，Cτ越低。通过将Cτ对已知HCV RNA浓度的每一标准稀释度制成曲线图即可用ABI Prism7700检测系统自动制成标准曲线。
用于标准曲线的参考样品置于每一RT-PCR盘上。活体外合成HCV复制子RNA(通过T7转录)，纯化，并以OD260定量。考虑到1微克这种RNA＝2.15×1011RNA拷贝，进行稀释以具有108，107，106，105，104，103或102基因组RNA拷贝/5微升。对每一稀释度中也加入总细胞Huh-7 RNA(50毫微克/5微升)。将5微升的每一参考标准(HCV复制子+Huh-7 RNA)与45微升ReagentMix合并，并用于真实时间R.T.-PCR反应。
已于RNeasy 96-孔盘上纯化的实验样品的真实时间RT-PCR反应是通过将5微升的每一总细胞RNA样品与45微升Reagent Mix合并而进行的。
试剂及物料

试剂混合物制备

正向引物序列(SEQ ID.1)5’-ACG CAG AAA GCG TCT AGC CAT GGC GTTAGT-3’反向引物序列(SEQ ID NO.2)5’-TCC CGG GGC ACT CGC AAG CAC CCTATC AGG-3’
注这些引物放大HCV的5’未翻译区内存在的256-nt区。
PUTR探针序列(SEQ ID NO.3) TGG TCT GCG GAA CCG GTG AGTACACC 无模板对照(NTC)每一盘上使用4个孔作为“NTC”。对这些对照在孔内加入5微升水代替RNA。
热循环条件50℃2分钟60℃30分钟95℃5分钟 2循环 40循环RT-PCR反应终了后，数据分析需设定PCR盘的阈值萤光信号，通过将Cτ值与用于每一参考反应的RNA拷贝数制图而构成标准曲线。供检测样品取得的Cτ值用于插入基于标准曲线取得的RNA拷贝数。
最后，将RNA拷贝数正常化(基于由细胞培养孔萃取的总RNA的RiboGreen RNA的定量)并以基因组当量/微克总RNA[ge/μg]表示。
由细胞培养盘的每一孔得到的RNA拷贝数[g.e./μg]是在有不同浓度的抑制剂存在下复制HCV RNA量的量度。抑制％是以如下方程式计算100-[(g.e./μg inh)/(g.e./μg ctl)×100]。
将适合Hill模型的非线性曲线使用于抑制-浓度数据，通过使用SAS软件(统计软件体系统(Statistical Software System)SAS Institute，Inc.Cary，N.C)计算50％有效浓度(EC50)。
在以上述酶催及细胞基的检测评估本发明化合物时，发现这些化合物是高活性的。更具体地，这些化合物的IC50在NS3-NS4A蛋白酶检测中低于0.1μM，于细胞基的HCV RNA复制检测中EC50低于0.1μM。
实施例12特异性检测用于评估这化合物选择性的特异性检测描述于WO 00/09543。
当这些化合物以特异性检测进行评估时，发现式1化合物的特异性在于其对人白细胞弹性蛋白酶及组织蛋白酶B的检测中没有明显抑制。
实施例13药物动力学性质本发明化合物也有良好药物动力学性质，诸如对鼠在经口服5毫克/公斤后在1小时及2小时可测出有意义的血浆含量。
更明显的是，下述检测，活体内经口吸收筛选，用以测定于鼠经口服后试验化合物的血浆含量物料及方法1.用于汇集化合物的方法(“盒式选择”)要汇集入“盒”的化合物的选择是基于其结构的相似性及物理化学性质。确立可用于所有选择的化合物的固相萃取方法。以起始试验为基础，将每一化合物加入鼠血浆，并以HPLC或/HPLC/MS在0.5μM浓度下测定其停滞时间，离子质量，并通过HPLC及/或HPLC/MS使用各化合物间可能的分离作为将3-4个化合物汇集进“盒”的基础。
2.口服载体及化合物制剂每一“盒”含3-4种化合物，每一化合物为5或4毫克/公斤。盒可制成在0.5％的水性甲基纤维素及0.3％聚氧乙烯(20)山梨糖酮单油酸酯(吐温80)内的口服悬浮液。经口服饲管投药容积为10毫升/公斤。
3.投药及血样抽样将Male Spragur Dawley鼠于各自笼内空腹过夜，但可喝10％葡萄糖水溶液。给两只鼠投送每种“盒”。投药后1及2小时由2只鼠中采取血浆样品(约1毫升)，并汇集用于萃取及分析。
4.化合物萃取及分析以固体相萃取方法由每一盒萃取投药后1及2小时所取血浆样品，空白血浆，含各0.5μM所有化合物的空白血浆。以HPLC及HPLC/MS分析样品以进行比较。基于0.5μM标准的单个浓度评估血浆浓度。
以上述筛选检测本发明实例1至9化合物时发现在口服后1小时及2小时间血浆内有高含量，平均血浆内含量分别为1.23μM及1.16μM。由于这类肽的口服吸收低，本发明的这些化合物表明有明显的体内口服吸收是意想不到的。这些化合物的易于口服吸收使其可用于治疗HCV感染。
下表列出本发明代表性化合物。与本公开相一致外，这化合物全部在NS3-NS4A蛋白酶检测中具有低于0.1μM的IC50，而在基于细胞的HCV RNA复制检测中其EC50低于0.5μM。
表1
序列表<110>贝林格尔.英格海姆国际有限公司(BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH)<120>C型肝炎抑制剂三肽<130>13/092<150>2,369,711<151>2002-01-30<160>3<170>FastSEQ for Windows Vervion 4.0<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>1acgcagaaag cgtctagcca tggcgttagt 30<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>2tcccggggca ctcgcaagca ccctatcagg 30<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PUTR探针<400>3tggtctgcgg aaccggtgag tacacc 2权利要求
1.一种式(1)化合物 其中R1是羟基或NHSO2R1A；其中R1A是(C1-8)烷基，(C3-7)环烷基或{(C1-6)烷基-(C3-7)环烷基}，其全部视需要可被卤素，氰基，硝基，O-(C1-6)烷基，酰氨基，氨基或苯基进行1至3次取代，或R1A是C6或C10芳基，其视需要可被卤素，氰基，硝基，(C1-6)烷基，O-(C1-6)烷基，酰氨基或苯基进行1至3次取代；R2是(C4-6)环烷基；R3是叔-丁基或(C5-6)环烷基及R4是(C4-6)环烷基；或其医药上可接受的盐。
2.根据权利要求1的式1化合物，其中R1是羟基，NHSO2Me，NHSO2环丙基，或NHSO2Ph。
3.根据权利要求2的式1化合物，其中R1是NHSO2环丙基或NHSO2Ph。
4.根据权利要求2的式1化合物，其中R1是羟基。
5.根据权利要求1至4中任一的式1化合物，其中R2是环戊基或环己基。
6.根据权利要求5的式1化合物，其中R2是环戊基。
7.根据权利要求1至6中任一的式1化合物，其中R3是t-丁基或环己基。
8.根据权利要求7的式1化合物，其中R3是t-丁基。
9.根据权利要求1至8中任一的式1化合物，其中R4是环丁基或环戊基。
10.根据权利要求9的式1化合物，其中R4是环戊基。
11.根据权利要求1的式1化合物，其中R1是羟基，R2和R4各为环戊基而R3是t-丁基。
12.根据权利要求1的式1化合物，其中R1是羟基，R2是环丁基，R3是t-丁基和R4是环戊基。
13.根据权利要求1的式1化合物，其中R1是羟基，R2是环己基，R3是t-丁基和R4是环戊基。
14.根据权利要求1的式1化合物，其中R1是NHSO2Ph，R2和R4各是环戊基和R3是t-丁基。
15.根据权利要求1的式1化合物，其中R1是羟基，R2是环戊基，R3是t-丁基和R4是环丁基。
16.根据权利要求1的式1化合物，其中R1是羟基，R2是环戊基，R3是t-丁基和R4是环己基。
17.根据权利要求1的式1化合物，其中R1是羟基，R2和R4各为环戊基和R3是环己基。
18.根据权利要求1的式1化合物，其中R1是羟基，R2，R3和R4各为环戊基。
19.一种药物组合物，其包括抗C型肝炎病毒有效量的权利要求1至18中的任一式1化合物或其医药上可接受的盐，及与其混合的医药上可接受的载剂介质或助剂。
20.根据权利要求19的药物组合物，其还包括治疗有效量的一种或多种其他的抗-HCV制剂。
21.根据权利要求20的药物组合物，其中所述其他抗HCV制剂是选自α-干扰素或聚乙二醇化的α-干扰素。
22.根据权利要求20或21的药物组合物，其中所述其他抗HCV制剂是病毒唑。
23.根据权利要求20、21或22的药物组合物，其中所述其他抗HCV制剂是选自下列的抑制剂解旋酶，NS2/3蛋白酶及内部核糖体进入位点(IRES)。
24.一种用于治疗或预防哺乳动物C型肝炎病毒感染的方法，通过对哺乳动物给予一种抗C型肝炎病毒有效量的权利要求1至18的任一的式I化合物或其医药上可接受的盐。
25.一种用于治疗或预防哺乳动物C型肝炎病毒感染的方法，通过对哺乳动物给予一种抗C型肝炎病毒有效量的权利要求19至23中任一的组合物。
26.一种用于治疗或预防哺乳动物C型肝炎病毒感染的方法，通过对其给予一种抗C型肝炎病毒有效量的权利要求1至18的任一式I化合物，或其医药上可接受的盐，并结合1种或多种其它的抗-HCV制剂。
27.根据权利要求26的方法，其中所述其他抗-HCV制剂是选自α-干扰素或聚乙二醇化的α-干扰素。
28.根据权利要求26或27的方法，其中所述其他抗HCV制剂是病毒唑。
29.根据权利要求26、27或28的方法，其中所述其他抗HCV制剂是选自下列的抑制剂解旋酶，NS2/3蛋白酶及内部核糖体进入位点(IRES)。
30.根据权利要求1至18中任一的式1化合物的用途，它用于制造治疗或预防C型肝炎病毒感染用的药物。
31.根据权利要求20、21或22的药物组合物，其中所述其它抗HCV制剂是HCV聚合酶的抑制剂。
32.根据权利要求26、27或28的方法，其中所述其它抗HCV制剂是HCV聚合酶的抑制剂。
全文摘要
本文公开式(1)化合物其中R
文档编号A61K38/00GK1642974SQ03806164
公开日2005年7月20日 申请日期2003年1月24日 优先权日2002年2月1日
发明者蒙特斯·利纳斯-布鲁尼特, 维达·J·戈里斯 申请人:贝林格尔·英格海姆国际有限公司