用于癌症治疗的cdk抑制剂和5－fu的联合的制作方法

专利名称：用于癌症治疗的cdk抑制剂和5－fu的联合的制作方法
技术领域：
本发明涉及适用于癌症和其它增殖性疾病治疗的药物联合。
背景技术：
哺乳动物细胞周期的启动、发展和结束受对细胞生长至关重要的各种细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)复合物调控。这些复合物包括至少一种催化(CDK自身)亚基和一种调节(细胞周期蛋白)亚基。用于细胞周期调控的一些比较重要的复合物包括细胞周期蛋白A(CDK1-还称为cdc2，和CDK2)、细胞周期蛋白B1-B3(CDK1)、细胞周期蛋白C(CDK8)、细胞周期蛋白D1-D3(CDK2、CDK4、CDK5、CDK6)、细胞周期蛋白E(CDK2)、细胞周期蛋白K和T(CDK9)和细胞周期蛋白H(CDK7)。这些复合物中的每一种都在细胞周期的特定期中涉及到。
通过与其它蛋白的短暂联合以及它们细胞内定位的变化，CDK的活性在翻译后被调节。肿瘤发展与CDK及其调节蛋白的基因变化和反调节密切相关，表明CDK抑制剂可为有用的抗癌治疗药。事实上，早期结果表明，转化细胞和正常细胞在对例如细胞周期蛋白A/CDK2的需求上不同，因而可开发没有使用常规胞毒和细胞抑制剂时观察到的常见宿主毒性的新型抗肿瘤药。
CDK的功能是磷酸化并因此激活或失活特定的蛋白，包括例如成视网膜细胞瘤蛋白、核纤层蛋白、组蛋白H1和有丝分裂纺锤体的成分。由CDK介导的催化步骤涉及从ATP到大分子酶底物的磷酸基转移反应。已发现几类化合物(N.Gray，L.Détivaud，C.Doerig，L.Meijer，Curr.Med.Chem.1999，6，859)由于CDK特异性ATP拮抗作用而具有抗增殖活性。
Roscovitine为化合物6-苄氨基-2-[(R)-1-乙基-2-羟乙基氨基]-9-异丙基嘌呤。已证实Roscovitine为有效的细胞周期蛋白依赖性激酶尤其是CDK2的抑制剂。目前这种化合物正开发作为抗癌药。CDK抑制剂被认为阻断了来自细胞周期G1/S和G2/M期的细胞途径。还表明Roscovitine为成视网膜细胞瘤磷酸化的抑制剂，并因此被暗示对Rb阳性肿瘤更有效。
在本领域中已很好地证实，为了使治疗方案最佳经常联合给药活性药剂。因此本发明设法提供一种已知药剂的新型联合，该联合特别适用于增殖性疾病尤其是癌症的治疗。更具体地说，本发明集中于令人惊奇和预料不到的与联合使用某些药剂相关的效果。
发明简述第一方面，本发明提供一种包括CDK抑制剂和5-FU或其前体药物的联合。
第二方面提供一种包括根据本发明的联合并与药物可接受载体、稀释剂或赋形剂混合的药物组合物。
第三方面涉及根据本发明的联合在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的应用。
第四方面涉及包括CDK抑制剂和5-FU或其前体药物的药物制品，作为在治疗中同时、依次或分别使用的联合制剂。
第五方面涉及治疗增殖性疾病的方法，所述方法包括同时、依次或分别地向患者给药CDK抑制剂和5-FU或其前体药物。
第六方面涉及CDK抑制剂在制备用于增殖性疾病治疗的药物中的应用，其中所述治疗包括同时、依次或分别地向患者给药CDK抑制剂和5-FU或其前体药物。
第七方面涉及CDK抑制剂和5-FU或其前体药物在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的应用。
第八方面涉及涉及CDK抑制剂在制备用于增殖性疾病治疗的药物中的应用，其中所述药物用于在与5-FU或其前体药物联合治疗中使用。
第九方面涉及5-FU或其前体药物在制备用于增殖性疾病治疗的药物中的应用，其中所述药物用于在与CDK抑制剂联合治疗中使用。
发明详述下文中阐述的优选实施方式适用于本发明的所有上述方面。
如上所述，本发明涉及包括CDK抑制剂和5-FU或其前体药物的联合。
5-氟尿嘧啶(5-FU)为一种抗肿瘤抗代谢物，在抵抗实体肿瘤，尤其是胃或结肠源，的化疗方案中广泛使用。根据肿瘤细胞利用碱基对尿嘧啶用于DNA合成比肠粘膜的正常细胞更有效的观察，在1957年开发了5-氟尿嘧啶。5-FU为氟化嘧啶，在细胞内新陈代谢成其活性形式氟脱氧尿苷一磷酸(FdUMP)。活性形式通过抑制胸腺嘧啶脱氧核苷的正常产生来抑制DNA合成。5-FU为细胞周期期特异性的(S-期)，即它阻滞细胞从细胞周期的S-期发展。
药物联合的效果本质上不可预知，并经常存在一种药物部分或完全地抑制其它药物作用的倾向。本发明基于以下令人惊奇的观察，即联合(同时、分别或依次)给药5-FU和CDK抑制剂(例如roscovitine)不会导致两种药剂间任何的不利相互作用。如此意外地不产生任何所述相互拮抗作用对临床应用都关重要。
优选地，联合具有协同效应，即联合是协同性的。
如上所述，本发明的一个方面涉及包括CDK抑制剂和5-FU或其前体药物的药物制品，作为在治疗中同时、依次或分别使用的联合制剂。
可同时、联合、依次或分别(作为给药方案的一部分)给药CDK抑制剂和5-FU或其前体药物。
本文中使用的“同时”是指同时地给药两种药剂，而术语“联合”是指在时限内如果不能同时则“依次”地给药以使它们能在同一时限内起治疗作用。因此，“依次”给药可允许在一种药剂后5分钟、10分钟或大约几小时后给药另一种药剂，只要第一种给药药剂的循环半衰期能使二者同时以治疗有效量存在即可。两成分给药间的延时依成分的确切性质、它们之间的相互作用和它们各自的半衰期而改变。
与“联合”或“依次”相比，本文使用的“分别”是指给药一种药剂和另一种药剂之间的间隔是明显的，即当给药第二种药剂时，在血流中可不再存在治疗有效量的第一种给药药剂。
本发明的一个方面涉及CDK抑制剂在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的应用，其中所述治疗包括向患者同时、依次或分别地给药5-FU或其前体药物和CDK抑制剂。
优选地，同时或依次给药CDK抑制剂和5-FU或其前体药物。
在一种优选实施方式中，同时给药5-FU或其前体药物和CDK抑制剂。
在一种特别优选的实施方式中，在向患者依次或分别地给药5-FU或其前体药物前向所述患者给药CDK抑制剂。
本发明的另一方面涉及治疗增殖性疾病的方法，包括依次给药治疗有效量的CDK抑制剂然后是治疗有效量的5-FU。
本发明的另一方面涉及roscovitine在生产用于增殖性疾病治疗的药物中的应用，包括依次给药治疗有效量的CDK抑制剂然后是治疗有效量的5-FU。
在其他优选实施方式中，在向患者依次或分开地给药CDK抑制剂前向所述患者给药5-FU或前体药物。
在一种特别优选的实施方式中，依次给药CDK抑制剂和5-FU或其前体药物。
在本发明的一种优选实施方式中，对于单独成分，分别给药治疗有效量的CDK抑制剂和5-FU或其前体药物。
在本发明的另一种优选实施方式中，对于单独成分，分别给药亚治疗量的CDK抑制剂和5-FU或其前体药物。
本发明的另一方面涉及CDK抑制剂和5-FU或其前体药物在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的应用。
本发明的又一方面涉及CDK抑制剂在制备用于增殖性疾病治疗的药物中的应用，其中所述药物用于与5-FU或其前体药物在联合治疗中使用。
本发明的还一方面涉及5-FU或其前体药物在制备用于增殖性疾病治疗的药物中的应用，其中所述药物用于与CDK抑制剂在联合治疗中使用。
本文中使用的术语“联合治疗”是指在时限内如果不能同时则依次给药5-FU或其前体药物和CDK抑制剂以便在同一时限内它们均可起治疗作用的治疗。
本文使用的术语“药物制备”包括本发明的成分除了用于这类药物制备的任意阶段外还有直接作为药物的应用。
本文使用的术语“增殖性疾病”广义上包括需要控制细胞周期的任何疾病，例如心血管疾病如心瓣手术后再狭窄和心肌病、自体免疫疾病如肾小球肾炎和类风湿性关节炎、皮肤疾病如牛皮癣，抗炎症、抗真菌、抗寄生物的疾病如疟疾、气肿和脱发。在这些疾病中，本发明的成分可根据需要诱导目标细胞内的细胞凋亡或保持停滞。
优选地，增殖性疾病为癌症或白血病，最优选癌症。
在一种较优选的实施方式中，增殖性疾病为软组织癌，例如乳腺癌。
在另一优选的实施方式中，增殖性疾病为结直肠癌、头颈部癌症、子宫颈癌或胰腺癌。
在一种特别优选的实施方式中，本发明涉及本文所述的联合在CDK依赖性或敏感性疾病治疗中的应用。CDK依赖性疾病与超过一种或多种CDK酶的活性正常水平有关。这种疾病优选与CDK2和/或CDK4的异常活性水平有关。CDK敏感性疾病为这样一种疾病，其中CDK水平的异常不是主因，而是主要新陈代谢异常的后阶段。在这种情况下，CDK2和/或CDK4可被认为是敏感性新陈代谢途径的一部分，因此CDK抑制剂可有效地治疗这种疾病。这种疾病优选为癌症或白血病。
优选地，CDK抑制剂为CDK2和/或CDK4的抑制剂。更优选地，CDK抑制剂选自WO97/20842、WO98/05335(CV Therapeutics)、WO99/07705(Regents of the University of California)中描述的roscovitine、purvalanol A、purvalanol B、奥罗莫星(olomucine)和其它2，6，9-三取代嘌呤。
甚至更优选地，CDK抑制剂选自roscovitine和purvalanol A。
在一种特别优选的实施方式中，CDK抑制剂为roscovitine。
roscovitine为化合物2-[(1-乙基-2-羟乙基)氨基]-6-苄氨基-9-异丙基嘌呤，还描述为2-(1-D，L-羟甲基丙基氨基)-6-苄氨基-9-异丙基嘌呤。本文中使用的术语“roscovitine”包括拆分的R和S对映异构体、它们的混合物和它们的外消旋物。
为使治疗方案最佳，许多抗癌药联合给药。5-FU已与环磷酰胺、氨甲喋呤联合使用(Int J Cancer(1981)28，91-96)，并在顺氯氨铂的服药方案中与甲酰四氢叶酸一起使用(Jpn J Clin Onc(2001)31，605-609)。后一文献提供了从改善前期(advance)胃癌治疗的角度尝试的5-FU联合的综述。Bible KC和Kaufmann SH在Cancer Res.(1997)573375-3380中描述了flavopurinol和5-FU的依次给药。但是，到目前也没有与roscovitine联合给药5-FU或其前体药物的建议。
甚至更优选地，联合为包括roscovitine和5-FU或其前体药物的协同联合。
在一种优选实施方式中，5-FU或其前体药物和roscovitine的联合与单独给药的任一种药物相比产生了增强的效果。这种令人惊奇的特性与根据现有技术预料的大不相同。
在本发明的一种特别优选的实施方式中，前体药物为卡培他滨。因此，优选地，联合包括roscovitine和卡培他滨。
药物组合物尽管可单独给药本发明的成分(包括它们的药物可接受盐、酯和药物可接受溶剂化物)，但对于人类治疗，通常与药物载体、赋形剂或稀释剂混合给药。
因此，本发明的一种优选实施方式涉及包括CDK抑制剂和5-FU或其前体药物并与药物可接受赋形剂、稀释剂或载体混合的药物组合物。
可在由Wade和PJ Weller编辑的“Handbook of Pharmaceutical Excipients”第二版(1994)中找到用于本文所述各种不同形式药物组合物的这类合适赋形剂的例子。
在药物领域，用于治疗用途的可接受载体或稀释剂是众所周知的，并在例如Remington的Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co(A.R.Gennaroedit.1985)中有描述。合适的载体的例子包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨糖醇等。合适的稀释剂的例子包括乙醇、甘油和水。
药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可根据预定给药途径和标准药物实践来选择。药物组合物可包括作为或除载体、赋形剂或稀释剂之外的任何粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂。
合适的粘合剂的例子包括淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β乳糖、玉米甜味剂、天然和合成橡胶、如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇。
合适的润滑剂的例子包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠等。
在药物组合物中可提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至增香剂。防腐剂的例子包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。还可使用抗氧化剂和悬浮剂。
盐/酯本发明的药剂可以盐或酯尤其是药物可接受的盐或酯的形式提供。
本发明药剂的药物可接受盐包括它们合适的酸加成盐或碱性盐。可在Berge等人的J.Pharm Sci，66，1-19(1977)中找到合适药物盐的综述。用例如以下酸形成盐强无机酸，如矿物酸，例如硫酸、磷酸或氢卤酸；强有机羧酸，如未取代或取代(如被卤)的1至4个碳原子的链烷羧酸，例如乙酸；饱和或不饱和的二羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或与有机磺酸，如未取代或取代(如被卤)的(C1-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。
使用有机酸或醇/氢氧化物形成酯，取决于被酯化的官能团。有机酸包括羧酸，如未取代或取代(如被卤)的1至12个碳原子的链烷羧酸，例如乙酸；饱和或不饱和的二羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或与有机磺酸，如未取代或取代(如被卤)的(C1-C4)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。合适的氢氧化物包括无机氢氧化物，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝。醇包括未取代或取代(如被卤)的1至12个碳原子的链烷醇。
对映异构体/互变异构体本发明还适当包括药剂的全部对映异构体和互变异构体。本领域的技术人员能认识到具有光学性质(一个或多个手性碳原子)或互变异构特征的化合物。可通过本领域中已知的方法分离/制备相应的对映异构体和/或互变异构体。
立体异构体和几何异构体本发明的一些药剂可以立体异构体和/或几何异构体的形式存在，例如它们可具有一个或多个不对称和/或几何中心并因此可以二种或多种立体异构和/或几何形式存在。本发明包括那些药剂所有的单独立体异构体和几何异构体及它们的混合物的使用。权利要求中使用的术语包括这些形式，只要所述形式保留适当的官能活性即可(但不必到相同程度)。
本发明还包括药剂的所有合适的同位素变体或其药物可接受盐。本发明药剂的同位素变体或其药物可接受盐定义为至少一个原子被具有相同原子序数但原子质量与自然界中通常发现的原子质量不同的原子取代的物质。可被结合到药剂和其药物可接受盐的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别如2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。药剂和其药物可接受盐的某些同位素变体，例如那些结合了放射形同位素如3H或14C的，在药物和/或底物组织分布研究中是有用的。含氚的即3H和碳-14即14C同位素因其容易制备和可检测性而特别优选。此外，用同位素如氘即2H的取代可因较大的新陈代谢稳定性而提供特定的治疗益处，例如体内半衰期增加或剂量要求降低，并因此可在一些情况下被优选。通常可使用合适试剂的适当同位素变体通过常规过程制备本发明药剂的同位素变体和其药物可接受盐。
溶剂化物本发明还包括本发明药剂的溶剂化物形式。权利要求中使用的术语包括这些形式。
多晶型物本发明还涉及各种结晶形式、多晶型形式和无水/水合形式的本发明的药剂。在药物工业中已很好地证实了，化合物的任意一种所述形式可通过稍微改变这种化合物合成制备中所用溶剂的纯化方法和或分离形式来分离。
化学衍生物本发明还涉及包括药剂衍生物的联合。本文中使用的术语“衍生物”包括药剂的化学修饰。例如这类化学修饰可为氢被卤基、烷基、酰基或氨基取代。
前体药物本发明还包括前体药物形式的本发明的药剂。这种前体药物通常为一个或多个适当基团已被修饰的化合物，并且，在向人或哺乳动物患者给药时，修饰可被逆转。通常通过在这类患者中天然存在的酶实现这种逆转，但也可与这种前体药物一起给药第二种药剂以实现体内逆转。这类修饰的例子包括酯(例如上述那些中的任一种)，其中可通过酯酶等进行逆转。其它这类系统为本领域中那些技术人员所熟知。
在一个特别优选的实施方式中，5-FU为前体药物形式，优选为卡培他滨。卡培他滨为特别适于口服给药的5-FU前体药物。
给药可使本发明的药物组合物适合于口服、直肠、阴道、肠胃外、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内、支气管内、皮下、皮内、静脉内、鼻、口腔或舌下给药途径。
对于口服给药，特别地，利用压片、药丸、片剂、凝胶(gellules)、滴剂和胶囊。优选地，这些组合物每剂包含1-2000mg和更优选50-1000mg的有效成分。
其它给药形式包括溶液或乳液，它们可静脉内、动脉内、鞘内、皮下、皮内、腹膜内或肌内注射，并由无菌或可消毒溶液制备。本发明的药物组合物还可为栓剂、阴道栓剂、混悬剂、乳液、洗液、软膏、乳膏剂、凝胶、喷雾剂、溶液或撒粉的形式。
经皮给药的其他方式是利用皮肤贴片。例如，可将有效成分结合到由聚乙二醇含水乳液或液体石蜡组成的乳膏剂内。还可以1-10wt％的浓度将有效成分结合到软膏内，该软膏由白蜡或白色软石蜡基础成分与可能需要的稳定剂和防腐剂共同组成。
可注射形式每剂量可包含10-1000mg、优选10-500mg的有效成分。
组合物可被配制成单元剂型，即包含单元剂量的离散部分或单元剂量的多重单位或亚单位的形式。
在一种特别优选的实施方式中，静脉内给药本发明的联合或药物组合物。
剂量本领域的普通技术人员不用额外试验就可容易地确定一种速溶组合物的适宜剂量以向患者给药。典型地，医师会确定对个体患者最适合的实际剂量，并且其取决于各种因素，包括使用的具体药剂的活性、药剂的新陈代谢稳定性和作用长短、年龄、体重、平常健康状况、性别、饮食、给药方式和时间、排泄速度、药物联合、特定病症的严重程度和个体正进行的治疗。本文公开的剂量为典型的一般情况。当然也可有较高或较低剂量范围有益的个别情况，这都在本发明的范围内。
根据需要，可以0.1-30mg/kg体重、或2-20mg/kg、更优选0.1-1mg/kg体重的剂量给药。
如上所述，优选以药学可接受组合物的形式给药治疗有效量的每种有效成分即CDK抑制剂和5-FU或其前体药物。本领域技术人员熟悉这些用量。利用手册，典型地静脉内、口服或局部给药5-FU。静脉内和口服剂量典型地包括250mg或500mg 5-FU，并根据医师指导以依据患者体重的总剂量给药，例如每周口服15mg/kg，最大剂量1g/天，或4小时内静脉内给药12mg/kg，或每天24小时内24-49mg/kg连续5天。典型地以胶囊形式口服给药，而静脉内给药通常在数小时内进行，典型地为4小时。
优选地，以1-5g/天的剂量口服或静脉内给药roscovitine。然后按如上所述以适宜的剂量和被视为最合适的方式给药5-FU。优选地，在给药roscovitine至少24小时后给药5-FU。
典型地以约0.05-约5g/天、优选约0.5-约5g/天或1-约5g/天、甚至更优选约1-约3g/天的剂量口服或静脉内给药roscovitine。或者，优选以约0.4-约3g/天的剂量给药roscovitine。优选以片剂或胶囊的形式口服给药roscovitine。roscovitine的总日剂量可作为单次剂量给药，或分成每天给药2、3或4次的分散剂量。
通过实施例并结合以下图进一步描述本发明，其中

图1显示了用roscovitine(本文中称为“CYC202”或“202”)、5-FU和[roscovitine+5-FU]处理对HT29细胞细胞周期分布的影响。
图2显示了用roscovitine和5-FU依次处理对HT29细胞细胞周期分布的影响。
图3显示了roscovitine、5-FU和[roscovitine+5-FU]处理对HT29细胞中半胱氨酸天冬氨酸酶-3激活的影响。
图4显示了roscovitine和5-FU依次处理对HT29细胞中半胱氨酸天冬氨酸酶-3激活的影响。
图5显示了用roscovitine和5-FU联合处理对HT29细胞中增殖的影响，这通过结合BrdU确定。
图6显示了5-FU预处理对MCF7细胞的影响；细胞数目(以对照的％表示)对药物剂量(以IC50％表示)。
图7显示了roscovitine预处理对MCF7细胞的影响；细胞数目(以对照的％表示)对药物剂量(以IC50％表示)。
图8显示了roscovitine/5-FU同时处理对MCF7细胞的影响；细胞数目(以对照的％表示)对药物剂量(以IC50％表示)。
图9显示了roscovitine联合5-氟尿嘧啶(5-FU)在人乳腺癌异种移植MAXF857中的体外抗癌疗效。
实施例材料和方法用roscovitine和/或5-FU处理HT29人结直肠癌细胞。单独、伴随和依次提供化合物。用流式细胞仪并通过分析半胱氨酸天冬氨酸酶-3水平(诱导细胞凋亡的早期标记)分析roscovitine与5-FU给药次序的影响。
细胞培养从European Collection of Animal Cell Cultures获取人结直肠癌细胞系HT29。在补充有10％v/v胎牛血清(Perbio)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养液中培养细胞。在37℃、5％v/v CO2的湿润气氛中培养细胞，并使用0.05％w/v胰岛素、0.02％w/v EDTA收获。在重新接种或分析前在介质中洗涤细胞以灭活胰岛素。
药物处理根据通过细胞毒性分析计算的IC50值选择药物处理浓度。Roscovitine的剂量为IC50(20μM)或2×IC50(40μM)，5-FU剂量为IC50(1μM)或0.5×IC50(0.5μM)。对于联合和依次处理，评价所有可能的药物和浓度的组合。
细胞周期分布分析以1×106细胞/板将HT29细胞接种到90mm直径板上并孵育24小时。用相应浓度的roscovitine、5-FU或roscovitine+5-FU处理细胞48小时，除了应用依次药物处理的情况外。在要评价的依次应用药物的样品中，在暴露于第一种药物24小时后，将培养基从板上移到管内，并加入相应的第二种药物。混合后，培养基被返回到相应的板上，并再孵育24小时。然后收获分离的细胞和粘着的细胞。在PBS中洗涤一次后，在冰冷的70％v/v乙醇的水溶液使细胞固定，并在-20℃下贮存。在PBS+1％w/v BSA中洗涤细胞二次以除去固定剂并重悬浮到包含0.1％v/v氚核-X、50μg/ml碘化丙啶和50μg/mlRNaseA的PBS中。在室温下孵育20分钟后，使用流式细胞仪分析细胞。
激活的半胱氨酸天冬氨酸酶-3分析按照与细胞周期分布测定相同的方法接种HT29细胞、用药物处理并收获。在37℃下在1％w/v多聚甲醛中固定细胞30分钟，在PBS中洗涤一次，重悬浮到冰冷的70％v/v乙醇中，并在分析前于-20℃下贮存。在PBS+1％w/vBSA中洗涤细胞二次，并重悬浮到120μl FITC结合的抗激活半胱氨酸天冬氨酸酶-3抗体(Pharmingen)被稀释至1∶5的PBS+1％BSA中，在室温下避光孵育30分钟。在PBS+1％BSA中洗涤一次后，将细胞重悬浮到包含0.1％v/v氚核-X、50μg/ml碘化丙啶和50μg/ml RNaseA的PBS中。在室温下避光孵育20分钟后，使用流式细胞仪分析样品。
通过结合BrdU评价细胞增殖按照与细胞周期分布测定相同的方法接种HT29细胞并用药物处理。24小时后，用含有10μM BrdU的培养基替代培养基并孵育30分钟。收获分离的细胞，在PBS中洗涤板二次并通过胰蛋白酶处理收获粘着的细胞。汇合粘着和分离的细胞，在PBS中洗涤，在冰冷的70％v/v乙醇中固定并在4℃下贮存。在PBS+1％BSA中洗涤细胞二次并用2M HCl处理20分钟，然后再在PBS中洗涤三次。将细胞沉淀并向沉淀中加入2μl抗BrdU抗体(Pharmingen)。在室温下放置细胞30分钟并在PBS+1％BSA中洗涤一次。向沉淀的细胞中加入50μl FITC结合的抗小鼠F(ab’)2(Dako)，其已用PBS+1％BSA按1∶10稀释，并在室温下避光孵育样品30分钟。用PBS+1％BSA洗涤一次后，将细胞重悬浮到包含0.1％v/v氚核-X、50μg/ml碘化丙啶和50μg/mlRNaseA的PBS中。在室温下避光孵育20分钟后，使用流式细胞仪分析样品。
流式细胞仪使用Becton Dickinson LSR流式细胞仪用于这些研究，并遵循厂商建议。使用设定在488nm的氩离子激光器作为激发源。使用时，同样根据在对数标度上获得的绿色荧光(530±28nm)标明激活的半胱氨酸天冬氨酸酶-3和BrdU阳性细胞。红色荧光(575±26nm)在线性标度上获得，使用脉冲宽度分析从分析中排除细胞双重线和聚集体。DNA含量在2n和4n之间的细胞被指定处于细胞周期的G1、S或G2/M期，这由红色荧光的水平限定。表现出小于2n DNA含量的细胞被指定为亚G1细胞。每个细胞周期间隔中的细胞数目以存在的细胞总数的百分比表示。
结果细胞周期分析roscovitine、5-FU和roscovitine+5-FU处理对HT29细胞的细胞周期分布的影响示于图1。
用20μM和40μM roscovitine的处理都导致细胞在G2/M累积，用0.5μM和1μM 5-FU的处理都导致细胞在S期累积，二者均为剂量相关方式。当用20μM roscovitine和0.5μM或1μM 5-FU同时处理细胞时，可看到在S期的累积，这表明两种浓度下5-FU可防止20μM roscovitine的G2/M阻滞。但是，当roscovitine的水平增加到40μM时，在0.5μM和1μM5-FU下都可看到在G2/M的累积，这表明通过提高roscovitine的水平，能克服5-FU的效应。
用roscovitine和5-FU的依次处理对HT29细胞的细胞周期分布的影响示于图2。
当在5-FU前给药roscovitine时，细胞周期分布与单独使用roscovitine得到的极其相同。提高5-FU的浓度从0.5μM到1μM对细胞周期分布没有明显影响。当在roscovitine前给药5-FU时，通常在roscovitine处理中看到的G2/M中的累积没有那么显著，特别是在用40μM roscovitine处理的那些样品中。在先用1μM 5-FU然后用40μM roscovitine处理的样品中，S期细胞存在显著的增加。这些结果表明5-FU能阻滞roscovitine的细胞周期效应。
半胱氨酸天冬氨酸酶激活图3显示了roscovitine、5-FU和(roscovitine+5-FU)处理对HT29细胞中半胱氨酸天冬氨酸酶-3激活的影响。
Roscovitine以剂量相关的方式诱导半胱氨酸天冬氨酸酶-3的激活(凋亡细胞死亡的前期标记)，5-FU也如此，虽然程度较低。当联合给药时，结果类似于单独用roscovitine所得到的，这表明用试验水平的二种药物同时处理未增加细胞死亡(即根据这种特定分析没有证实相加或协同效应)。
图4显示了roscovitine和5-FU依次处理对HT29细胞中半胱氨酸天冬氨酸酶-3激活的影响。
5-FU前用roscovitine处理显示了高的半胱氨酸天冬氨酸酶-3激活(细胞死亡)水平，与在所有药物浓度联合中看到的水平类似。更具体地说，在5-FU前给药roscovitine导致半胱氨酸天冬氨酸酶-3激活提高，并且这种激活大于单独用5-FU或roscovitine获得得。因此，根据这种分析，与单独给药任一种药物相比，依次给药CDK抑制剂如roscovitine然后给药5-FU能对细胞凋亡的诱导产生最大影响。不希望受理论的束缚，但认为先roscovitine后5-FU的依次处理防止了S期中5-FU诱导的阻滞。
当按照这种特定分析测量时，当在roscovitine前给药5-FU时，细胞死亡水平大大降低，表明5-FU可阻滞由roscovitine对细胞死亡的诱导。
BrdU分析结合BrdU的细胞的数目减少(3.8％)表明，40μM roscovitine的处理导致增殖减少。1μM 5-FU的处理增加结合BrdU的细胞的数目到64.3％，但Brdu标记的强度低于对照中所看到的，表明药物导致S期停止。当同时给药时，40μM roscovitine+1μM 5-FU比单独roscovitine产生更多的结合BrdU的细胞。这表明5-FU的存在抑制了roscovitine的效应，就象细胞周期分布结果所示。先用40μM roscovitine后用1μM 5-FU的依次处理得到类似于单独40μMroscovitine的结果。先用1μM 5-FU后用40μM roscovitine的依次处理与单独5-FU相比显示出增殖减少，与单独用roscovitine相比增殖增加，这表明在roscovitine前给药5-FU可抑制roscovitine的效应。
通过BrdU的结合确定的用roscovitine和5-FU联合处理对HT29细胞中增殖的影响示于图5。
MCF7细胞的roscovitine和5-FU处理在96孔板中以3000/孔接种MCF7细胞。使细胞沉淀过夜，并在次日用含有药物的培养液替换培养液。试验9种不同的药物处理，每个板中一式三份。在MCF7细胞中所关心的二种药物的IC50值为8μM(5-FU)和10μMroscovitine。试验模型范围从用5-FU 100％的IC50处理细胞(处理1)到用roscovitine 100％的IC50处理(处理7)。处理2-6包括用不同的5-FU与roscovitine的比例范围处理细胞，如下面的表1所示。还试验了二种另外的对照，包括不用药物(处理8)或用两种药物100％的IC50处理(处理9)。
表1

试验了三种不同的联合方案(A)5-FU预处理，其中用5-FU处理细胞24小时，然后用含有roscovitine的培养液替换培养液并处理48小时。
(B)roscovitine预处理，其中用roscovitine处理细胞24小时，然后用5-FU处理48小时。
(C)用5-FU和roscovitine同时处理细胞72小时。
在全部三种联合方案中，在72小时试验期后，使用WST1分析(RocheApplied Science Assay Catalogue No.1644807)评估每个孔中的细胞数目。在每个板内，每次处理的细胞数目以对照孔(没有药物)中细胞的百分比表示。
联合研究的统计分析为解释联合曲线，用每次试验联合(75∶25 roscovitine/5-FU)和端点(100∶0-roscovitine和0∶100-5-FU)进行统计比较。统计上显著结果需要在联合(roscovitine和5-FU)吸光率值和两个端点值(单独的roscovitine和5-FU)之间存在差异[Greco等人，The search for synergy；A critical review from a responsesurface perspective.Pharmacol；Review 47331-385，1995；Laska等人，Simpledesigns and model-free tests for synergy；Biometrics 50834-841，1994]。如果大多数(≥3/5)值统计学上在线(端点)上面或下面，则分别描述拮抗性或协同性。否则，图形与相加的相互作用更一致。
结果联合方案(A)、(B)和(C)的结果示于下面表2、3和4以及图6、7和8中。
表2

表3

表4

表5

联合方案(A)用5-FU预处理的结果(表2和5、图6所示)表明在5-FU和roscovitine之间有协同的相互作用。
联合方案(B)用roscovitine预处理的结果(表3和5、图7所示)表明在5-FU和roscovitine之间有相加的相互作用。
联合方案(C)用5-FU和roscovitine同时处理的结果(表3和5、图8所示)表明在5-FU和roscovitine之间有协同的相互作用。
克隆源性分析从人肿瘤异种移植物制备单细胞悬浮物在无菌条件下除去在胸腺发育不全的裸小鼠(NMRI，Naval MedicalResearch Institute，USA，nu/nu株，得自饲养实验室)皮下生长的连续传代实体人肿瘤异种移植物，机械分解并随后用由胶原酶(41U/ml，Sigma)、DNAseI(125U/ml，Roche)、透明质酸酶(100U/ml，Sigma)和分散酶(dispase)II(1.0U/ml，Roche)组成的酶混合物的RPMI 1640-培养液(Life Technologies)在37℃下孵育40分钟。使细胞通过200μm和50μm目径的筛，并用无菌PBS缓冲液(Life Technologies)洗涤二次。使用台盼蓝排染法在Neubauer血球计中测定活细胞的比例。
培养方法根据Hamburger等人介绍的改进双层软琼脂分析[Hamburger，A.W.&S.E.Salmon.1977；Primary bioassay of human tumor stem cells.Science197461-463]在24孔格式中进行克隆源性分析。底层由0.2ml/孔的Iscove改良的Dulbecco培养液(补充有20％(v/v)胎牛血清和0.01％(v/v)庆大霉素)和0.75％(w/v)的琼脂组成。向0.2ml补充有0.4％(w/v)琼脂的相同培养液中加入5·104个细胞，并放到24多孔盘中再放到底层上。在细胞中接种后通过连续在0.2ml培养液中暴露(药物覆盖)24小时施加细胞生长抑制药。每个盘包括6个对照孔和6种浓度一式三份的药物处理组。在联合研究中，同时施加roscovitine和标准细胞毒素药，在通过分析层扩散达到的各自试验浓度中以3倍浓缩结束。在6种稀释物中试验细胞毒素药，并将roscovitine以2种不变浓度加入到各个稀释物中。在37℃和7.5％CO2的湿润气氛中孵育培养物8-20天，并使用倒置显微镜密切监测集落生长。在此期间，体外肿瘤生长导致直径＞50μm的集落的形成。在最大集落形成时，用自动图象分析系统(OMNICON FAS IV，Biosys GmbH)进行计数。在评价前24小时，用氯化2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四唑的无菌水溶液(1mg/ml，100μl/孔)染色活集落(Alley，M.C.，Uhi，C.B.和M.M.Lieber，1982.Improved detection of drugcytotoxicity in the soft agar colony formation assay through use of ametabolizable tetrazolium salt.Life Sci.313071-3078)。
如果满足以下的质量控制标准，则认为分析是完全可评价的·24多孔板的对照组孔中的集落平均数≥20个，集落直径＞50μm；·对照组的变异系数≤50％；·阳性基准化合物5-氟尿嘧啶(5-FU)(有毒剂量为1000μg/ml)必须影响集落成活率＜对照的20％；或·在第0或2天上的初始板计数＜最终对照组计数的20％。
数据评价用存活率的百分比来表示药物效应，通过比较处理的板中的集落平均数与未处理的对照组的平均集落计数得到(用试验值比对照组值表示相对集落计数，T/C值[％])
在联合研究中，将得到的每种药物剂量联合的T/C值与单独用各自浓度的roscivitine或标准药剂得到的T/C值比较。当联合的T/C值显著低于各个单一治疗的T/C值时就得到了联合的益处。通过绘制化合物浓度对相对集落计数的曲线确定IC50和IC70值，即分别抑制50％(T/C＝50％)和70％(T/C＝30％)集落形成所需要的药物浓度。
结果示于图9。当单独用10μM roscivitine处理人乳腺癌异种移植物MAXF857时，得到77％的相对集落计数。当用roscivitine和5FU的联合处理这种细胞系时，在单独处理时对细胞生长没有影响的5FU浓度下，相对集落计数为大约45％。因此，从77％到45％的降低表明在这种同时处理中有显著的协同效应。
总之，已使用各种试验方法包括细胞周期分析、细胞增殖研究和细胞凋亡诱导研究证实了使用roscivitine和5-FU联合治疗的疗效。值得注意的是，使用MCF7细胞的研究结果表明在同时给药5-FU和roscivitine时存在协同效应，对于用5-FU预处理也是这样。通过激活的半胱氨酸天冬氨酸酶-3分析测量的细胞凋亡诱导研究表明，对于用roscivitine的预处理存在协同效应。
因此，上述试验结果证实了同时给药5-FU和roscivitine时以及以任何顺序依次给药，即在roscivitine前给药5-FU和在5-FU前给药roscivitine时，的协同机制。
在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的各种改变和变化对本领域的那些技术人员来说是显而易见的。尽管已结合具体的优选实施方式描述了本发明，但应该认识到要求的本发明不过分限制于这种具体实施方式
。事实上，对相关领域那些技术人员明显的用于实施本发明上述方式的各种改变都意在被本发明覆盖。
权利要求
1.一种联合，包括CDK抑制剂和5-FU或其前体药物。
2.根据权利要求1所述的联合，其中CDK抑制剂为CDK2或CDK4的抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述的联合，其中CDK抑制剂选自roscovitine、purvalanol A、purvalanol B和奥罗莫星。
4.根据任一前述权利要求所述的联合，其中CDK抑制剂为roscovitine。
5.根据任一前述权利要求所述的联合，其中5-FU前体药物为卡培他滨。
6.一种药物组合物，包括根据任一前述权利要求所述的联合和药物可接受载体、稀释剂或赋形剂。
7.根据权利要求1至5中任意一项所述的联合在制备用于增殖性疾病治疗的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其中增殖性疾病为癌症。
9.根据权利要求8所述的应用，其中癌症为乳腺癌。
10.一种药物制品，包括CDK抑制剂和5-FU或其前体药物，作为在治疗中同时、依次或分别使用的联合制剂。
11.根据权利要求10所述的药物制品，用于在治疗中分别或依次使用，其中依次给药5-FU或其前体药物和CDK抑制剂。
12.根据权利要求10或11所述的药物制品，其中CDK抑制剂为CDK2或CDK4的抑制剂。
13.根据权利要求10至12中任意一项所述的药物制品，其中CDK抑制剂选自roscovitine、purvalanol A、purvalanol B和奥罗莫星。
14.根据权利要求10至13中任意一项所述的药物制品，其中CDK抑制剂为roscovitine。
15.根据权利要求10至14中任意一项所述的药物制品，其中5-FU前体药物为卡培他滨。
16.根据权利要求10至15中任意一项所述的药物制品，以包括药物可接受载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物的形式存在。
17.根据权利要求10至16中任意一项所述的药物制品，用于治疗增殖性疾病。
18.根据权利要求17所述的药物制品，其中增殖性疾病为癌症。
19.根据权利要求18所述的药物制品，其中增殖性疾病为乳腺癌。
20.一种治疗增殖性疾病的方法，所述方法包括同时、依次或分别地向患者给药5-FU或其前体药物和CDK抑制剂。
21.根据权利要求20所述的方法，包括在向患者依次或分别地给药5-FU或其前体药物前向所述患者给药所述CDK抑制剂。
22.根据权利要求20所述的方法，包括在向患者依次或分别地给药CDK抑制剂前向所述患者给药5-FU或其前体药物。
23.根据权利要求20至22中任意一项所述的方法，其中CDK抑制剂为CDK2或CDK4的抑制剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其中CDK抑制剂选自roscovitine、purvalanol A、purvalanol B和奥罗莫星。
25.根据权利要求24所述的方法，其中CDK抑制剂为roscovitine。
26.根据权利要求20至25中任意一项所述的方法，其中5-FU前体药物为卡培他滨。
27.根据权利要求20至26中任意一项所述的方法，其中对于单独成分，分别给药治疗有效量的CDK抑制剂和5-FU或其前体药物。
28.根据权利要求20至26中任意一项所述的方法，其中对于单独成分，分别给药亚治疗量的CDK抑制剂和5-FU或其前体药物。
29.根据权利要求20至28中任意一项所述的方法，其中增殖性疾病为癌症。
30.根据权利要求20至29中任意一项所述的方法，其中增殖性疾病为乳腺癌。
31.CDK抑制剂在制备用于增殖性疾病治疗的药物中的应用，其中所述治疗包括同时、依次或分别地向患者给药5-FU或其前体药物和CDK抑制剂。
32.CDK抑制剂和5-FU或其前体药物在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的应用。
33.CDK抑制剂在制备用于增殖性疾病治疗的药物中的应用，其中所述药物用于在与5-FU或其前体药物联合治疗。
34.5-FU或其前体药物在制备用于增殖性疾病治疗的药物中的应用，其中所述药物用于在与CDK抑制剂联合治疗。
全文摘要
本发明的第一方面涉及包括CDK抑制剂和5－FU或其前体药物的联合。本发明的第二方面涉及包括CDK抑制剂和5－FU或其前体药物的药物制品，作为在治疗中同时、依次或分别使用的联合制剂。本发明的第三方面涉及治疗增殖性疾病的方法，所述方法包括同时、依次或分别地向患者给药CDK抑制剂和5－FU或其前体药物。
文档编号A61K31/7068GK1652844SQ03810999
公开日2005年8月10日 申请日期2003年3月14日 优先权日2002年3月15日
发明者西蒙·R·格林, 伊恩·N·弗莱明, 罗斯玛丽·G·克拉克, 史蒂文·J·麦克卢 申请人:西克拉塞尔有限公司