融合铁蛋白在疫苗和其他方面的应用的制作方法

专利名称：融合铁蛋白在疫苗和其他方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及融合铁蛋白，特别是在铁蛋白内部和外部的N端和/或C端融合其他蛋白或肽片段形成能够自组装的融合蛋白，以及该类融合蛋白在作为疫苗和其他方面的应用，包括运输氧气以及治疗性导入药物和其他治疗药剂。
背景技术：
铁蛋白含有高度保守的24个亚基，这些亚基存在于所有的动物、细菌和植物中。铁蛋白的主要生理作用是控制多核Fe(III)2O3形成的速度和定位。(见Theil，E.C.等人在《Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.》上发表的文章，1990，63421-449；Harrison，P.M.，Lilley，T.H.等人在Loehr T.M.编著的《WeinheimVCH》中的文章，1990，33-452)该控制作用是通过生物矿化作用，将水合铁离子和质子运进和运出含无机物的内核实现的。通过这一机制使铁蛋白积累的铁离子强度大于生理状态下可溶性的游离铁离子强度。生物矿化作用的速度直接与每个铁蛋白颗粒内的H亚基和L亚基(即所谓的轻链和重链)的比例相关，H亚基含量增加时表现出铁离子储存速度增加的趋势。蛋白颗粒的组成差异具有组织特异性，并影响铁的氧化代谢、核心形成和铁循环的机制。比如，血清中的铁蛋白主要由L链组成，来自于心脏的铁蛋白H链含量较高。铁蛋白矿化核心为不同的氧化酶提供铁离子，而且起到还原的作用。
每个铁蛋白由24个亚基组成，每个亚基含有432个对称体，直径125埃，颗粒厚度约为25埃，中空的内部核心直径约为80埃(

图1)。典型的铁蛋白单体含有至少两个异构体，由H链和L链组成，二者在氨基酸序列上不同。在许多脊椎动物包括人中已经确定H亚基和L亚基的长度，这两种结构体通常存在于已经确证的铁蛋白中。每个铁蛋白亚基分子量大约为17道尔顿，具有束状螺旋的拓扑结构，包含4个反向平行螺旋基序和一个短螺旋(C端螺旋)，该螺旋大致与第4个束状螺旋的长轴垂直。依据惯例从N端开始分别将螺旋标记为“A，B，C，D和E”。N端序列与颗粒第3个折叠轴相邻并明显延伸到颗粒表面，而E螺旋与第4个折叠轴挤压在一起，其C端延伸到颗粒核心。挤压的结果是在蛋白颗粒表面形成2个孔。位于第四个折叠的孔大约有4-5埃，主要为疏水性；而位于第三个折叠的孔直径略大，是6.0埃，主要为亲水性。这两个孔或其中一个可能是水合铁离子扩散出入颗粒的通道。
以前关于铁蛋白的研究工作，如5,248,589；5,358,722和5,304,382号美国专利，通过引证被并入本文均列在参考文献中，主要集中在蛋白外壳和内核的生理作用方面，如除了含铁水合物以外的物质可能定位于壳内。通过差示扫描量热法研究显示(见SP MartseV，AP Vlasov，P Arosio，等人在《Proterin Engineering》发表的文章，1998，11，377-381)重组人L和H铁蛋白在pH2.0到2.8之间时解离成亚基单体。
其他方面的工作包括使用病毒样颗粒作为疫苗的结构模型，在缺少佐剂的的情况下诱导产生抗体反应，保护免受病毒感染和过敏反应(见Lechner等人在《Intervirology》发表的文章，2002，212-217，45(4-6))，但该系统不包括以铁蛋白为基础的蛋白开发系统。在Marchenko等人在2003年《J.Mol.Microbiol Biotechnol》5(2)97-104页发表的文章中，已知蛋白P1-380能够形成病毒样颗粒(VLP)。在该研究中，P1-380蛋白的C端和/或N端融合后不影响VLP的自组装，具有双功能的融合蛋白颗粒显示出诱导更强免疫反应的能力。Douglas等人还进行了以下研究一种形成铁离子核的蛋白与豇豆花叶病毒(CCMV)相连，具体参考发表在《Adv.Mater.》上的文章，2002，14(6)，415-418页。其他的融合蛋白还有包含与乳头瘤病毒非结构蛋白L2，一种次要结构蛋白，融合形成的病毒样颗粒的嵌合蛋白，具体参考Greenstone等人在《PNAS USA》上发表的文章，1998，95(4)，1800-1805页。但是以上所有的融合蛋白中都不包括铁蛋白。
因此，以前的文献均未对铁蛋白的使用或分别对颗粒外表面和内表面的N端和C端的任何用途进行过研究(如图2A和B显示)，而且也没有人利用该结构通过与铁蛋白融合连接其他蛋白或肽以加强这些蛋白或肽的特性，产生能够自组装的的融合蛋白。
发明简述因此，本发明的目标是提供包括与铁蛋白N端和/或C端融合的蛋白或肽片段的融合铁蛋白。
本发明的另一目标是除了提供融合铁蛋白，还提供一种表达蛋白的方法，表达蛋白既可以与颗粒表面结合，也可以通过任一蛋白末端的延伸的内在化表达。
本发明的又一目标是提供融合蛋白产品，可应用于疫苗、治疗、图象衬比试剂、新的金属鳌合系统、胶凝剂、蛋白纯化平台、治疗性受体结合蛋白和其他适当的应用。
本发明的再一目标是提供可以在医人和医兽中应用及其他许多非治疗方面中应用的融合铁蛋白。
本发明的另一目标是提供能延长动脉停留时间的融合铁蛋白，这样可以促进免疫反应的发生，使药物和其他治疗药剂发挥更长时间的治疗作用。
本发明的其它目标是提供重组融合铁蛋白在疫苗、药物导入和其他许多治疗方面的应用，重组融合铁蛋白包括能融合到铁蛋白上的蛋白和肽且不影响蛋白的自组装或形成高级聚合结构的能力如形成颗粒结构或聚合体的片段。
本发明的这些目标及其它目标是提供包含外源蛋白或肽的融合铁蛋白，并能形成聚合结构如铁蛋白颗粒或其他聚合体，外源蛋白或肽与铁蛋白N或C末端连接。所融合的外源蛋白或肽不会限制融合蛋白形成具有功能的高级结构如颗粒结构，但也可能形成其他的聚合结构如半球形，柱状等。依照本发明，融合铁蛋白提供了一种表达蛋白的方法，可以与铁蛋白外部如颗粒表面连接，或通过蛋白末端延伸融合表达在蛋白内部。本发明的融合蛋白有多种形式，病毒包膜和衣壳蛋白与铁蛋白融合可以作为病毒疫苗使用。此外因为本发明的方法还可以融合表达多种蛋白和肽，可以构建多价融合蛋白，如来自同一生物体的不同蛋白或来自不同生物体的相同蛋白作为多价疫苗。
此外，形成铁蛋白颗粒结构时，C端位于铁蛋白内部核心位置，N端位于蛋白外表面，因此可以构建这样的疫苗与铁蛋白表面连接的第一种蛋白或肽抗原能快速诱导产生抗体，而第二种所需抗原与内部C端连接，从而在开始的免疫反应中受到屏蔽达到延长反应时间的目的。因此该类疫苗的第一部分能诱导产生最初的抗体，疫苗的第二部分只有在经过一定时间后降解与铁蛋白核心解离暴露第二种抗原才具有免疫原性。这种内部屏蔽作用为导入非水溶性抗原提供了方法。而且，因为与铁蛋白连接，还能增强融合蛋白或肽在降解前的有效作用时间，有利于治疗性蛋白或肽发挥作用。本发明中融合蛋白的其他优点还有当不希望偶联表达的多肽或蛋白引起免疫反应时可以使用人源颗粒(或在兽医中使用动物来源的颗粒)避免产生免疫相关问题。另一个应用是使用铁蛋白颗粒组装人血红蛋白聚合体作为运输血液中氧的替代品。最后这类融合蛋白在其他方面也有作用，如清除金属，包裹有用的蛋白或小分子，或储存与抗体相连、针对特定组织或细胞的具有放射活性的物质。
对于读过本说明书和/或引入本文作为参考的此领域的普通技术人员来说，在本发明的公开范围内的实施方案和其选择方案和修改是显而易见的，所有这样的方案引入本文作为参考。
图示简介图1是铁蛋白颗粒的连续剖面图，从四个折叠轴(中心)的角度观察，亚基以醒目的颜色表示。
图2A-2B显示铁蛋白颗粒下部四个折叠轴(中心)的1/3图形立体图.清晰标出外部N端和内部C端，说明可以利用末端构建重组融合蛋白或肽。图2A显示颗粒内部的结构，图2B显示外表面结构。
图3为质粒示意图，质粒编码根据本发明构建的人血红蛋白α链与人铁蛋白C端融合的蛋白。
图4为在第四个折叠轴周围组装的亚基立体结构图。箭头所示是亚基假定的旋转方向，通过旋转可容纳较大的C端融合蛋白。
图5为(FL.G.Hα)的正则直方图。
图6为马心脏天然铁蛋白的正则直方图。
图7为(FL.GG.Ag4)的正则直方图。
图8为(FL.GG.Ag4)特有颗粒构像的透射电镜图。
图9为质粒示意图，质粒编码根据本发明构建的HIV Tat蛋白(84个氨基酸)与人铁蛋白N端连接的融合蛋白。
图10为使用针对Tat的多克隆抗体进行的免疫印迹分析图，确证了本发明中铁蛋白-Tat蛋白成功构建。
图11为(Tat.6G.FL)的正则直方图。
图12A为质粒示意图，质粒编码根据本发明构建的HIV Tat小肽与人铁蛋白轻链N端连接的融合蛋白。
图12B为质粒示意图，质粒编码根据本发明构建的HIV P24蛋白与人铁蛋白轻链N端连接的融合蛋白。
本发明的详细描述根据本发明，融合铁蛋白是指至少在铁蛋白的一个链如H或L链融合有外源蛋白，这些蛋白或肽能够与铁蛋白的N端或C端结合且不影响融合蛋白形成聚合结构如颗粒、聚合体或其他功能性结构的能力。铁蛋白含有高度保守的24个蛋白亚基，这些亚基存在于所有动物、细菌和植物中，主要作用是通过从矿化核心运进和运出水合铁离子和质子来控制多核Fe(III)2O3形成的速度和定位。通过这一机制，铁蛋白积累了一定浓度的铁离子，其浓度在生理状态下高于可溶性游离铁离子。生物矿物化作用的速度直接与铁蛋白颗粒内的H亚基和L亚基(即所谓的轻链和重链)的比例相关，随着H链含量增高其储存铁的速度也随着增高。这种颗粒组成的差异具有组织特异性，影响铁的氧化，核心形成和铁的运转。铁蛋白的矿物化核心能够为许多氧化还原酶提供具有生物活性的铁离子，还具有解毒作用。
每个铁蛋白由24个亚基组成颗粒，每个颗粒含432个对称体，直径为125埃，外壳厚度约为25埃，中空的内部核心直径约为80埃(图1)。典型的铁蛋白单体结构至少有含有H链和L链的两种异构体，这两种链的差异在于氨基酸序列的不同。在包括人的脊椎动物中发现了多种长度的H亚基和L亚基。每个铁蛋白亚基的分子量约为17Kd，具有束状螺旋的拓扑结构，包括4个反平行螺旋基序和一个短螺旋(C端螺旋)，该短螺旋与第4个螺旋束的长轴大致垂直。依据惯例从N端开始分别将螺旋标记为“A，B，C，D和E”。N端序列与颗粒的第3个折叠轴相邻，延伸到蛋白表面，而E螺旋在第4个折叠轴挤压在一起，其C端延伸到颗粒核心。螺旋挤压在颗粒表面形成两个小孔。位于第4折叠区的小孔约有4-5埃，主要为疏水性。位于第3折叠区的小孔稍大些，直径约有6.0埃，主要为亲水性。这两个孔或其中一个可能是水合铁离子扩散出入颗粒的通道。
根据本发明，可以将适当的蛋白或肽融合到铁蛋白的N端，紧邻蛋白颗粒的第三个折叠轴形成颗粒外产物；或者将蛋白或肽融合到C端，延伸到蛋白核心形成颗粒内产物，或者是以上二者的集合体。这里所说的铁蛋白是指铁蛋白和/或它的H链和/或L链以及铁蛋白类似物如5,304,382号美国专利中所描述的，在此通过引证被并入本文，还包括去铁铁蛋白和那些具有铁蛋白结构的蛋白，即蛋白外表面为N端区域，内部核心为C端区域。本发明使用的蛋白或肽包括那些氨基酸序列能与铁蛋白连接但不影响其结构的蛋白、多肽、抗体、片断、酶、半抗原、肽聚糖或其他分子。融合铁蛋白表达后自组装成大分子或聚合结构，与天然铁蛋白具有相同的构和构像(N端在表面，C端在内部核心)。
根据本发明设计融合产物时，有必要考虑在每个铁蛋白和与铁蛋白融合的蛋白或肽之间包括“间隔”结构的残基，如甘氨酸或其他适当的氨基酸。一般而言间隔结构能增加铁蛋白中心与连接蛋白或肽之间的距离，如希望增加铁蛋白与融合蛋白或肽之间的空间时。铁蛋白与具有抗原性的蛋白或肽连接时该类情况较多。因为充分暴露抗原有利于产生抗体如在疫苗的使用中。此外，本发明的融合蛋白是抗体与铁蛋白连接，间隔结构能减少铁蛋白与融合蛋白之间的空间位阻，使抗体更好的与目标结合。通常连接的分子越大就越需要充足的间隔结构。因此在本发明的融合产物中，无论是颗粒内融合产物还是颗粒外融合产物，如果颗粒外部需要足够的空间容纳较大蛋白时，均可利用一个或更多的甘氨酸残基(或其他适当的氨基酸)。通常选择甘氨酸因为它可以形成具有弹性的“链”，容易适应外伸的多肽构像。
正如本领域技术人员所认识的一样，根据生理或物理需要，当需要屏蔽环境中的灭活或其他造成蛋白降解或切除因素时，可以将目标蛋白或肽融合到铁蛋白内部；不需要屏蔽蛋白如希望引起更加快速的免疫反应时目标蛋白或肽可融合到蛋白外部。此外还可以利用颗粒内部(C端)或外部(N端)融合蛋白形成混合颗粒，如在颗粒表面或内部表达多种抗原蛋白或肽。可以利用这个方法确保发生抗体反应和细胞免疫反应。另外可以利用相同方法表达的多种酶为多步生化反应产生高度浓缩的酶“工厂”。通过相同载体多重表达或使用已知方法使颗粒解离后再与目的产物重新连接形成混合物的方法构建这类多价嵌合铁蛋白。
本发明利用N端和C端分别在聚合结构外部和内部的定位(图2A和2B)，将蛋白或肽连接到这些特定位置构建融合蛋白。在优选实施例中，使用适当的方法制备本发明的融合铁蛋白，其中至少有一种蛋白或肽与铁蛋白连接，且不会影响融合蛋白形成聚合结构，即融合铁蛋白形成稳定多聚体结构时蛋白或肽仍与铁蛋白保持连接，铁蛋白保持基本的内部核心和外部表面结构，外表面的N端或内表面的C端与蛋白或肽连接(或在两个部位都进行连接)。本发明的一个实施方案是融合蛋白具有铁蛋白形成聚合颗粒结构的特性。可以理解的是，铁蛋白具有自组装的趋势是有利的，表现出多种不同的形式，不仅是颗粒结构，还有其他的聚合结构如聚合体、半球形、柱状等结构。根据本发明与铁蛋白融合的自组装产物具备多种应用如疫苗和以下详细描述的方面。可以使用本领域技术人员熟知的适当方法构建本发明的融合蛋白，如重组表达或通过物理或化学方法与单个蛋白连接构建本发明的融合蛋白。
根据本发明，融合铁蛋白具有融合到外部如与外部N端连接的蛋白或通过与C端连接表达在内部的蛋白。正如下面详细描述的一样，本发明中融合蛋白的应用领域包括疫苗、治疗、图象衬比试剂、新的金属鳌合系统、胶凝剂、蛋白纯化平台、治疗性受体结合蛋白等，在人和兽医中还有许多非治疗方面的应用。
如上所述，使用基因工程领域常规的重组技术就能构建本发明中重组表达的融合铁蛋白。如使用分子克隆的方法构建融合蛋白，比如通过与适当的铁蛋白如人铁蛋白L链连接，在大肠杆菌中表达制备重组人血红蛋白α亚基。在这一过程中，使用以PCR为基础的方法将血红蛋白α亚基的全长cDNA与铁蛋白轻链基因的C端通过甘氨酸连接子连接(图3)。基因构建完成后，进行蛋白表达和分离和/或纯化。首先对融合蛋白(如铁蛋白/血红蛋白融合蛋白)的编码序列测序以确保重组体具有正确的DNA序列。重组质粒转化蛋白表达细菌BL21(DE3)。当细菌繁殖到合适浓度如OD值为1.0(600nm)时，加入1mM IPTG激活T7启动子，在30℃诱导表达。表达结束后细菌重悬在B-PER缓冲液中进行超声破碎释放蛋白。然后对融合蛋白进行分离和/或纯化，如采用合适的层析方法或其他方法如分子排阻、凝胶过滤、离子交换层析等从上清液中分离蛋白。使用适当的多克隆和单克隆抗体通过常规的免疫印迹试验进行蛋白确证。
本发明中的融合蛋白构建完成后，通过下列观察对颗粒构像进行确认1)分子排阻凝胶层析纯化的表达产物具有与比天然重组铁蛋白(铁蛋白分子量，408K)稍大的蛋白复合物一致的保留效应；2)使用光度计检测单个蛋白的分散性，显示蛋白直径约是天然铁蛋白的两倍(图6和表2)；
3)使用适当的多克隆抗体(如在上述实施例中，同时使用人铁蛋白和血红蛋白α的多克隆抗体)与融合蛋白进行免疫印迹试验，分别得到阳性结果。
根据本发明，融合蛋白中的亚基数目有可能显著多于天然铁蛋白中的24个亚基数目，说明颗粒具有增加亚基与亚基之间组装角度的能力，二聚体可能通过旋转与平行于第二个折叠轴的“B”螺旋组装，位于颗粒表面“B-C环”的弹性使二聚体进一步得到稳定，B-C环穿过第二个折叠轴形成反平行β折叠。该旋转假说得到空间相互作用的支持，颗粒曲率增大为较大的血红蛋白分子提供更多空间。亚基组装角度发生的较小变化与颗粒直径的显著增加相关，使颗粒内部能容纳更大的融合产物。同时可以更好的理解通过对表面暴露的环、B-C环进行修饰或替换构建“嵌合”铁蛋白分子，用于疫苗或其他方面。
因此可以利用本发明的融合蛋白增强多种治疗性蛋白和肽的效果。特别是通过与铁蛋白连接极大增强了治疗性蛋白在血浆中的半衰期，其半衰期通常为18-20个小时。因此当血液中的非融合蛋白或肽被完全降解后，融合蛋白或肽仍能提供较长时间的治疗作用。此外，蛋白或肽与铁蛋白融合后可以避免免疫相关问题，特别是蛋白与铁蛋白内部C端区域连接时。同样，融合铁蛋白能够对一些蛋白或肽(如酶，毒素鳌合物或小分子治疗剂)起保护作用，否则这些蛋白或肽在血液中很快被降解。在这类应用中最好将这些蛋白和肽与铁蛋白C端区域连接，使它们位于融合蛋白颗粒的内部核心部位。
经济并可测量的分离纯化融合铁蛋白产物更进一步，蛋白或小肽与铁蛋白外部的酶切位点连接后，根据铁蛋白颗粒大小的差异，使用简单的超滤对终产物进行分离，然后通过酶切将融合产物容易的分离出来。因此可以利用融合铁蛋白平台进行方便经济的颗粒外融合产物的分离。
沉淀金属复合物铁蛋白核心具有沉淀多种金属复合物的特性，包括某些天然状态的陶瓷(见5,248,589、5,358,722和5,304,382号美国专利)。如实施例所示在融合蛋白核心表达一种新的金属核多肽。可以理解由于组成金属或无机复合物的放射性元素具有增强X射线或核磁共振造影剂的作用，这类物质可用于多种医学方面的治疗、诊断或预防。还可以理解利用颗粒结构的蛋白核心浓缩和沉淀贵重或稀有金属(如通常在Fe的实例中)，利用这些具有特殊功能的蛋白通过细菌、酵母等发酵过程比较容易对表达的目的或非目的无机物进行分离。最近的研究集中在控制半导体材料中极小粒子生产的颗粒大小方面。
抗体介导的治疗性病毒样颗粒(VLPs)由抗体Fv片断或更大结构域构成的颗粒外融合产物能够介导在颗粒内或在表面表达的治疗或诊断制剂到特定部位。在这一实施例中，针对或摧毁细胞如肿瘤细胞的蛋白或肽与铁蛋白连接后再与抗体(或抗体的活性区域如活性片断)连接，这样形成的融合蛋白将直接针对靶组织(如肿瘤)。因此根据本发明可以将以这类方式结合的颗粒蛋白包括毒素蛋白，放射性元素或其他破坏性因子直接导入肿瘤组织。
以血红蛋白为基础的血液替代品与血红蛋白融合的铁蛋白可以作为新的血液替代品。这类嵌合铁蛋白的潜在优点包括1)增加血管内残留时间；2)降低与内皮的相互作用，限制或消除与氧化氮结合引起的副作用；3)组装方式可以保护血红蛋白的Fe免受不必要的氧化；4)聚合体形式能防止血红蛋白α链与β链解离。
疫苗以上描述的本发明的融合蛋白可以在疫苗开发中加以应用，诱导产生针对感染的主动免疫和被动免疫。
在实施例中，根据本发明抗体与铁蛋白连接形成融合蛋白可以作为被动免疫的疫苗，为治疗或预防感染提供适当抗体。
正如本领域技术人员所认识的一样，根据本发明构建的疫苗可以有多种免疫方式，如注射方式(肌肉注射，皮内注射或皮下注射)或鼻咽方式(鼻内免疫)。其中一种情况是疫苗进行肌肉注射如注射到三角肌，但具体免疫途径还应该根据感染的性质和病人的状况。疫苗最好溶于制药行业认同的溶剂中以方便使用。这类溶剂通常是含有或不含防腐剂的水或生理盐水。疫苗可以冻干或以溶液形式保存，冻干疫苗在免疫时重悬。
本发明中融合蛋白的优选的免疫剂量是免疫病人后的有效剂量，如使病人产生特异性和非特异性抗体。该剂量通常指“具有免疫原性的量”，使用剂量根据抗原性质和病人免疫系统及身体状况变化很大。因此本发明中作为有效疫苗使用的融合蛋白的“免疫原性量”即指没有毒性，但有足够的抗原量以产生预防或治疗性抗体。同时免疫原用量随着病人不同而不同，与人种、年龄和病人的状况，需要治疗的严重程度，疫苗使用的特殊载体或佐剂及免疫方式等方面有关。同时任何一个特定融合蛋白成分中的“免疫原性量”根据特定的情况而不同，在每种疫苗的具体使用中，由本领域技术人员根据常规试验决定免疫原的适当用量。根据个体需要调整使用剂量和疫苗组成，并根据个体的年龄、体重和代谢情况有所不同。疫苗组份还包括稳定剂或制药行业认可的防腐剂，如硫柳汞(乙基(2-巯基乙醇)汞钠盐)(Sigma化学公司，St.Louis，MO)。
因此，根据本发明构建的有效疫苗，由上述单个蛋白的免疫原性量决定有效疫苗的使用量，用来免疫需要这类疫苗的病人或患病动物。疫苗还可能包括适当的、制药行业认可的媒介物、赋形剂或载体。根据本发明，铁蛋白可以与具有高度致病性病毒的蛋白，如AIDS、SARS等病毒的包膜蛋白或其他蛋白连接，使用融合蛋白诱导产生针对AIDS和/或SARS病毒的抗体。除了能用于保护免受致命性病毒感染的疫苗外，融合蛋白还可以用于对该类疾病的研究，同时还可能用于开发针对该类疾病的有效的治疗方法或药物。
本发明的融合蛋白与抗体连接可以作为被动疫苗进行免疫。在这种情况中，以能有效预防和治疗感染的用量作为根据本发明构建的被动疫苗的适宜剂量。这一用量随着感染性质和病人状态的不同而有很大变化。根据本发明构建的融合抗体的“有效用量”指没有毒性但有足够量的抗体以能达到预期的预防或治疗作用。同时抗体或治疗药物得到用量随着病人不同而不同，与人种、年龄和病人的状况，需要治疗的严重程度，疫苗使用的特殊载体或佐剂及免疫方式等方面有关。同时任何一个特定抗体组份的“有效用量”根据特定的情况而变化，在每种疫苗的具体使用中，由本领域技术人员根据常规试验决定适当的有效用量。根据个体需要调整使用剂量和疫苗组成，并根据个体的年龄、体重和代谢情况有所不同。疫苗组份还包括稳定剂或制药行业认可的防腐剂，如硫柳汞(乙基(2-巯基乙醇)汞钠盐)(Sigma化学公司，St.Louis，MO)。
此外，以上描述的本发明中的抗体和疫苗可以与适当佐剂共同免疫，增强针对融合体的免疫反应。比如，常用的佐剂包括在人体中广泛使用的铝制剂(磷酸铝或氢氧化铝)，其他佐剂如皂角苷和它的纯化成份Quil A，完全弗氏佐剂及在研究和兽医中使用的其他佐剂。其他化学组成明确的制备包括胞壁酰二肽、单磷酰脂质A、由Goodman-Snitkoff等人在《J.Immunol.》1991，147410-415页描述的磷脂化合物，文献在此通过引证被并入本文及由Miller等人在《J.Exp.Med.》1992，1761739-1744页中描述的蛋白脂质体包裹的融合体，文献在此通过引证被并入本文，脂质体包裹的蛋白如NovasomeTM脂质体(Micro VescularSystems，Inc.，Nashua，NH)比较有用。
与其他病毒颗粒疫苗相比，铁蛋白不像病毒颗粒一样可以被免疫系统迅速识别，使用根据本发明构建的颗粒内融合蛋白产物时，颗粒不会被认为是外源蛋白。只有在融合产物开始降解，暴露出抗原后才能诱导产生免疫反应，所以可以创造缓释抗原效应，因为抗原可以保持相当长的暴露时间从而诱导产生较强的免疫反应。融合铁蛋白结构简单，比病毒样颗粒特别是那些包含多个蛋白结构组份的颗粒更容易制备。
药物组合物正如本领域技术人员所认识的，根据本发明构建的融合蛋白还可以作为用于治疗或预防人或动物感染的药物组合物，或作为治疗疾病的药剂。上述融合蛋白的药物组合物可以与其他合适的药物溶剂、赋形剂或载体联合使用，这些联合制剂在本行业中经常使用，包括盐、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其他治疗性组合物。正如专业人士所认识的，这些特殊的溶剂、赋形剂或载体随着病人和病人状态的不同而不同，根据药物组合物采用适当的给药方式，包括但不局限于以下方式局部给药、口腔给药、肛门给药、阴道给药、静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔和皮内给药。
局部给药的制剂中，药剂形式有膏剂、霜剂、凝胶体、滴剂(如滴眼剂和滴耳剂)或溶液(如漱口液)。还包括由特定制剂浸泡的伤口或外科敷料、缝合用的线、气雾剂等。这些制剂还包括常规的添加剂，如防腐剂、促进渗透的溶剂和缓和剂。局部用药制剂还可能包括常规的吸收剂如霜或膏基质，乙醇或油醇。
其他方面的应用如上所述，根据本发明构建的融合铁蛋白在疫苗领域、制药、治疗药物组合物及其它能够提供有益作用的许多方面均有应用价值。比如可以利用本发明中的融合铁蛋白储存浓缩的具有放射性的金属，这些金属与抗体连接作为治疗药剂直接高浓度导入肿瘤组织。此外，由于铁蛋白具有潜在的结合铁离子和其他稀有金属的能力，可以通过本发明中的融合铁蛋白提取所需金属。因为该方法可以避免产生有毒的化学物质，因此提供了一种环保的采矿方法。另外在一些组织中L和H链的构成比例不同，具有特定L链和H链比例的融合铁蛋白或主要由一种类型的链构成的融合铁蛋白(如60-100％)可以将颗粒即治疗剂(DNA等)导入组织中，比如在心肌组织中铁蛋白主要由H链构成，而血液中的铁蛋白主要有L链构成。
其他方面的应用包括用于更加复杂的系统大结构组装平台(Macro structure assembly platform)-纳米技术。另外，铁蛋白、包裹在内部的治疗剂或其他药剂通过与抗体连接或其它方法到达体内需要进行治疗或其它的目标。就抗体而言，可以将完整的抗体或只具有抗原识别部位的Fv片断通过化学或重组的方法与铁蛋白连接。还可以插入铁蛋白颗粒的不同成分进行修饰，构建作为疫苗或治疗药物的混合分子。如替代位于蛋白表面的BC环。还可以使那些难以形成晶体的多肽或蛋白表达形成颗粒进而形成晶体，特别是在颗粒内部表达时，从而可以保留晶体外部组装的相互作用。颗粒内表达还可以解决某些疏水性蛋白的溶解性问题。融合铁蛋白还可以有以下方面的应用在识别过程如NMR，图象衬比或X射线成像中使用的颗粒由于连接旋转速度减慢，因此本发明的融合蛋白可应用于相关领域。
总之，上述根据本发明构建的融合铁蛋白在疫苗、其他药物和治疗药剂的组成中非常有用，将在给药、运输氧气和提高药物在血液中残留时间的应用中发挥特殊的作用。
实施例下面的实施例体现了本发明的优选实施方案。此领域中的技术人员应理解后面实施例中公开的技术代表了本发明发明人所发明的技术，其很好地实施了本发明，因而可以作为操作方法的优选模式。然而，根据本申请的公开内容，本领域技术人员应可认识到对本文公开的具体实施方案所做的各没有背离本发明范围和精神的并仍然获得相同或相似结果的修改。
例1颗粒内表达的融合蛋白人血红蛋白蛋白α链通过单甘氨酸连接子与人铁蛋白C端连接构成重组融合蛋白颗粒缩写(FL.G.Hα)。
分子克隆在大肠杆菌中表达人血红蛋白α亚基与人铁蛋白L链融合的重组蛋白。使用PCR方法将血红蛋白α链的全长cDNA与铁蛋白轻链基因C端通过由一个甘氨酸组成的连接子连接(图3)。
蛋白表达和纯化通过DNA测序验证铁蛋白/血红蛋白的编码序列。将重组子转化蛋白表达细菌BL21(DE3)。转化细菌生长到OD值为1.0(600nm)时，加入1mMIPTG激活T7启动子，在30度诱导表达。表达结束后将细胞重悬于B-PER缓冲液中，超声破碎释放蛋白。使用分子筛和离子交换凝胶过滤层析从上清中纯化重组的融合蛋白。使用多克隆和单克隆抗体进行免疫印迹试验确证表达蛋白。
通过以下观察显示颗粒或自组装颗粒(SAP)具有正确构像1)分子排阻凝胶层析洗脱的纯化表达产物具有与大于天然重组铁蛋白一致的保留效应(铁蛋白分子量408K)。
2)图5和表1中的蛋白光扫描试验显示单个分散蛋白的直径约是天然铁蛋白2.5倍，这一数据是根据图6和表2中的数值(这些数值一般不十分准确，但重要的是为单个分散蛋白提供了分子大小一致和有序SAP的依据)进行估计的。分别使用针对人铁蛋白和血红蛋白α的多克隆抗体与融合产物进行免疫印迹试验，应得到阳性结果。
对本复合物使用光散射分析得到的亚基数目要高于天然铁蛋白中的24个。尽管该复合物的确切结构还不清楚，SAP与单个分子在性质上是一致的。说明亚基与亚基之间的结合具有增加组装角度的内在能力。假设二聚体(见图4)越过颗粒第二个折叠轴旋转后与B螺旋组装，颗粒表面越过第二个折叠轴与β折叠反平行的B-C环的弹性进一步稳定了这种相互作用。这一旋转假设得到血红蛋白α链之间的空间相互作用的支持，如弯曲率大的颗粒能容纳较大的血红蛋白分子。这些亚基组装角度中小的变化与颗粒直径的增加有关，使得颗粒核心能容纳更大的融合蛋白。
表1(FL.G.Hα)的数据表。在温度22℃使用Proteinsolutions Dynapro光散射分光光度计进行检测得到的结果。
表2(天然马的心脏的铁蛋白)的数据表。在温度22℃使用Proteinsolutions Dynapro光散射分光光度计进行检测得到的结果。
例2颗粒内表达的融合蛋白银浓缩多肽通过包含2个甘氨酸的连接子与人铁蛋白L链C端连接构成重组融合蛋白颗粒缩写(FL.GG.Ag4)，AG4是指NPSSLFRYLPSD(序列号1)。
作为与铁蛋白连接的金属提取多肽，通过下列观察显示颗粒具有正确构像
1)分子排阻凝胶层析洗脱的纯化表达产物具有与天然重组铁蛋白(铁蛋白分子量408K)一致的保留效应。
2)图7和表3中的蛋白光散射试验显示单个分散蛋白的直径约为180埃；3)silver condensing peptide的颗粒特点已经明确；4)透射电子显微镜成像显示具有适当外部尺寸的多面体颗粒与铁蛋白X射线结构完全一致(图8)。
表3(FL.GG.Ag4)的数据表。在温度22℃使用Proteinsolutions Dynapro光散射分光光度计进行检测得到的结果。
例3颗粒外融合蛋白HIV Tat蛋白(84个氨基酸)通过包含6个甘氨酸的连接子与N端连接构成重组蛋白。
颗粒缩写(Tat.6G.FL)其中HIV Tat蛋白序列MEPVDPRLEP WKHPGSQPKT ACTNCYCKKC CFHCQVCFITKALGISYGRK KRRQRRRAHQ NSQTHQASLS KQPTSQPRGDPTGPKE-(序列号2)甘氨酸连接子序列GGGGGG(序列号3)人铁蛋白L链序列MSSQIRQNYS TDVEAAVNSL VNLYLQASYT YLSLGFYFDR DDVALEGVSHFFRELAEEKR EGYERLLKMQ NQRGGRALFQ DIKKPAEDEW GKTPDAMKAAMALEKKLNQA LLDLHALGSA RTDPHLCDFL ETHFLDEEVK LIKKMGDHLTNLHRLGGPEA GLGEYLFERL TLKHD(序列号4)分子克隆在大肠杆菌中表达野生型HIV-1 Tat与人铁蛋白L链融合的重组蛋白。使用PCR方法将Tat蛋白的全长cDNA与铁蛋白轻链基因N端通过包含6个甘氨酸的连接子连接(图9)。
蛋白表达和纯化通过DNA测序验证铁蛋白/Tat的编码序列。将重组子转化蛋白表达细菌BL21(DE3)。转化细菌生长到OD值为1.0(600nm)时，加入1mMIPTG激活T7启动子，在30度诱导表达。表达结束后将细胞重悬于B-PER缓冲液中，超声破碎释放蛋白。使用分子筛和离子交换凝胶过滤层析从上清中纯化重组的融合蛋白。使用多克隆和单克隆抗体进行免疫印迹试验确证表达蛋白(图10)。
通过下列观察显示颗粒具有正确构像1)分子排阻凝胶层析洗脱的纯化表达产物具有与同样大小或大于天然重组铁蛋白(铁蛋白分子量408K)特点一致的保留效应，；2)图11和表4中的蛋白光散射试验显示，单个分散蛋白的直径约是天然铁蛋白2倍；3)使用针对Tat的多克隆抗体与融合蛋白进行免疫印迹试验得到阳性结果(图10)。
表4(Tat.6G.FL)的数据表。在温度为22℃使用Proteinsolutions Dynapro光散射分光光度计进行检测得到的结果。
例4颗粒外融合蛋白HIV Tat小肽通过包含6个甘氨酸的连接子与人铁蛋白L链N端连接构成重组蛋白。
颗粒缩写(TatP.6G.FL)，其中TatP的序列为QPKTACTNC(序列号5)分子克隆在大肠杆菌中表达野生型HIV-1 Tat多肽与人铁蛋白L链融合的重组蛋白。使用PCR方法将Tat蛋白的全长cDNA与铁蛋白轻链基因N端通过包含包含6个甘氨酸的连接子连接(图9)。
蛋白表达和纯化通过DNA测序验证铁蛋白/Tat的编码序列。将重组子转化蛋白表达细菌BL21(DE3)。转化细菌生长到OD值为1.0(600nm)时，加入1mMIPTG激活T7启动子，在30度诱导表达。表达结束后将细胞重悬于B-PER缓冲液中，超声破碎释放蛋白。使用分子筛和离子交换凝胶过滤层析从上清中纯化重组的融合蛋白。由于融合多肽的分子较小，在本例中使用多克隆和单克隆抗体进行免疫印迹试验不能得到阳性结果。
通过下列观察显示颗粒具有正确构像1)分子排阻凝胶层析洗脱的纯化表达产物具有与天然重组铁蛋白(铁蛋白分子量408K)相一致的保留效应。
例5颗粒外融合蛋白HIV P24蛋白通过包含6个甘氨酸的连接子与N端连接构成重组蛋白。
颗粒缩写(P24.6G.FL)分子克隆在大肠杆菌中表达野生型HIV-1 P24与人铁蛋白L链融合的重组蛋白。使用PCR方法将Tat的全长cDNA与铁蛋白轻链基因N端通过包含6个甘氨酸的连接子连接(图9)。
蛋白表达和纯化通过DNA测序验证铁蛋白/P24的编码序列。将重组子转化蛋白表达细菌BL21(DE3)。转化细菌生长到OD值为1.0(600nm)时，加入1mMIPTG激活T7启动子，在30度诱导表达。表达结束后将细胞重悬于B-PER缓冲液中，超声破碎释放蛋白。使用分子筛和离子交换凝胶过滤层析从上清中纯化重组的融合蛋白。所表达的蛋白可能包含截短的P24蛋白(未对表达产物进行确证)。但是使用多克隆抗体与融合颗粒蛋白进行免疫印迹试验得到阳性结果。
通过下列观察显示颗粒具有正确构像1)分子排阻凝胶层析洗脱的纯化表达产物具有与天然重组铁蛋白(铁蛋白分子量408K)相一致的保留效应；2)融合蛋白与P24多克隆抗体进行免疫印迹试验得到阳性结果。
实施例附录1.GenBank序列号人铁蛋白L链GenBank序列号M11147人铁蛋白H链GenBank序列号AA075690人血红蛋白α链GenBank序列号V00493HIV-1GenBank序列号K034552.氨基酸序列HIV-1 P24PIVQNIQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRVHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQASQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVL(列号6)Tat-多肽QPKTACTNC(序列编号5)
α球蛋白MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHLPAEFTPAVHASLDKFLASVSTVLTSKYR(序列号7)HIV Tat序列MEPVDPRLEP WKHPGSQPKT ACTNCYCKKC CFHCQVCFIT KALGISYGRKKRRQRRRAHQ NSQTHQASLS KQPTSQPRGDPTGPKE(序列号2)人铁蛋白L链序列MSSQIRQNYS TDVEAAVNSL VNLYLQASYT YLSLGFYFDR DDVALEGVSHFFRELAEEKR EGYERLLKMQ NQRGGRALFQ DIKKPAEDEW GKTPDAMKAAMALEKKLNQA LLDLHALGSA RTDPHLCDFL ETHFLDEEVK LIKKMGDHLTNLHRLGGPEA GLGEYLFERL TLKHD(序列号4)人铁蛋白H链序列MTTASTSQVR QNYHQDSEAA INRQINLELY ASYVYLSMSY YFDRDDVALKNFAKYFLHQSH EEREHAEKLM KLQNQRGGRIFL QDIKKPDCDDWESGLNAMEC ALHLEKNVNQ SLLELHKLAT DKNDPHLCDF IETHYLNEQVKAIKELGDH VTNLRKMGAP ESGLAEYLFD KHTVVETVIMK AKPRANFP(序列号8)
序列表<110>丹尼尔·C·卡特<120>融合铁蛋白在疫苗和其他方面的应用<130>P07624WO00/BAS<150>60/379,145<151>2002-05-10<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Asn Pro Ser Ser Leu Phe Arg Tyr Leu Pro Ser Asp1 5 10<210>2<211>86<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe20 25 30
His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala His Gln Asn Ser Gln Thr50 55 60His Gln Ala Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Pro Arg Gly Asp65 70 75 80Pro Thr Gly Pro Lys Glu85<210>3<211>6<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Gly Gly Gly Gly Gly Gly1 5<210>4<211>175<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Met Ser Ser Gln Ile Arg Gln Asn Tyr Ser Thr Asp Val Glu Ala Ala1 5 10 15Val Asn Ser Leu Val Asn Leu Tyr Leu Gln Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu20 25 30Ser Leu Gly Phe Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu Glu Gly Val35 40 45
Ser His Phe Phe Arg Glu Leu Ala Glu Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Glu50 55 60Arg Leu Leu Lys Met Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ala Leu Phe Gln65 70 75 80Asp Ile Lys Lys Pro Ala Glu Asp Glu Trp Gly Lys Thr Pro Asp Ala85 90 95Met Lys Ala Ala Met Ala Leu Glu Lys Lys Leu Asn Gln Ala Leu Leu100 105 110Asp Leu His Ala Leu Gly Ser Ala Arg Thr Asp Pro His Leu Cys Asp115 120 125Phe Leu Glu Thr His Phe Leu Asp Glu Glu Val Lys Leu Ile Lys Lys130 135 140Met Gly Asp His Leu Thr Asn Leu His Arg Leu Gly Gly Pro Glu Ala145 150 155 160Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Thr Leu Lys His Asp165 170 175<210>5<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>5Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys1 5
<210>6<211>231<212>PRT<213>Homo sapiens<400>6Pro Ile Val Gln Asn Ile Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile Ser15 10 15Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe20 25 30Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr35 40 45Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala50 55 60Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp65 70 75 80Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln Met85 90 95Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gln100 105 110Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu115 120 125Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met130 135 140
Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro145 150 155 160Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln165 170 175Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln180 185 190Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala195 200 205Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro210 215 220Gly His Lys Ala Arg Val Leu225 230<210>7<211>142<212>PRT<213>Homo sapiens<400>7Met Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly1 5 10 15Lys Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg20 25 30Met Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp35 40 45
Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala50 55 60Asp Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala65 70 75 80Leu Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro85 90 95Val Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala100 105 110His Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys115 120 125Phe Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg130 135 140<210>8<211>190<212>PRT<213>Homo sapiens<400>8Met Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp1 5 10 15Ser Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser20 25 30Tyr Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala35 40 45
Leu Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg50 55 60Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg65 70 75 80Ile Phe Leu Gln Asp Ile Lys Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser85 90 95Gly Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn100 105 110Gln Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro115 120 125His Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys130 135 140Ala Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly145 150 155 160Ala Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Trp165 170 175Glu Thr Val Ile Met Lys Ala Lys Pro Arg Ala Asn Phe Pro180 185 190
权利要求
1.一种融合铁蛋白，是从包括下列融合蛋白的组中选取的在C端与能与铁蛋白融合且不会影响产物融合蛋白聚合组装的蛋白或肽融合的铁蛋白，或在N端与能与铁蛋白融合且不会影响产物融合蛋白聚合组装的蛋白或肽融合的铁蛋白。
2.根据权利要求1的融合铁蛋白，其中融合蛋白形成聚合体。
3.根据权利要求1的融合铁蛋白，其中融合蛋白形成颗粒结构。
4.根据权利要求1的融合铁蛋白，其中与铁蛋白连接的蛋白通过至少由1个氨基酸组成的连接子进行连接。
5.根据权利要求4的融合铁蛋白，其中氨基酸是甘氨酸。
6.根据权利要求5的融合铁蛋白，其中甘氨酸连接子包括1到6个甘氨酸。
7.根据权利要求1的融合铁蛋白，其中与铁蛋白融合的蛋白从下列蛋白中选择血红蛋白，银浓缩多肽，HIV Tat蛋白，HIV Tat小肽，HIV-1 P24蛋白和SARS病毒的病毒蛋白。
8.根据权利要求1的融合铁蛋白，其中与铁蛋白融合的蛋白从下列蛋白序列编号中选择序列编号1，序列编号2，序列编号5，序列编号6和序列编号7。
9.根据权利要求1的融合铁蛋白，其中铁蛋白从包括铁蛋白L链和H链的组中选择。
10.根据权利要求1的融合铁蛋白，其中铁蛋白主要由铁蛋白L链组成。
11.根据权利要求1的融合铁蛋白，其中铁蛋白主要由铁蛋白H链组成。
12.根据权利要求1的融合铁蛋白，其中与铁蛋白融合的蛋白是抗体。
13.一种包括免疫原性量的权利要求1的融合蛋白的疫苗。根据权利要求1，疫苗由免疫原性融合蛋白组成。
14.一种包括权利要求1的融合蛋白和药用可接受的媒介物、赋形剂或载体的药物组合物。
15.根据权利要求14的药物组合物，其可适合对人或动物进行注射，口服，鼻内，皮下，气雾或静脉给药。
16.一种制备病毒疫苗的方法，包括融合铁蛋白，至少一种具有免疫原性的病毒蛋白或肽序列能与铁蛋白的一个链连接且不影响铁蛋白形成融合蛋白的自组装能力。
17.一种增强有用蛋白或肽治疗作用的方法，包括将所述蛋白或肽与铁蛋白融合形成融合蛋白，其中融合蛋白保持与铁蛋白相同的聚合体结构。
18.一种在人体或动物中诱导产生免疫反应的方法，包括给人或动物服用免疫原性量的权利要求1分离的融合蛋白。
19.一种编码权利要求1的融合蛋白的核酸序列或其简并序列。
20.一种增加人或动物内服的蛋白或肽的半衰期的方法，包括所述蛋白或肽与铁蛋白形成融合蛋白，其中融合蛋白保持与铁蛋白相同的自组装能力。
21.一种融合铁蛋白，包括至少与铁蛋白C端融合的一种蛋白或肽和至少与铁蛋白N端融合的一种蛋白或肽，其中所述蛋白或多肽能与铁蛋白融合且不影响产物融合蛋白形成聚合体结构。
22.一种通过重组方法制备如权利要求1中的融合铁蛋白。
23.一种通过重组方法制备如权利要求21中的融合铁蛋白。
24.一种提取金属的方法，包括将含有与铁蛋白融合的金属提取肽的权利要求1的融合蛋白置于含有要提取金属的液体中充分长的时间以使金属与融合蛋白的金属提取肽结合，然后回收结合金属的融合蛋白。
全文摘要
本文涉及分离的融合铁蛋白，即蛋白或肽与铁蛋白连接不影响融合蛋白自组装形成聚合结构，蛋白与铁蛋白C端融合形成颗粒内表达，或与N端融合形成颗粒外表达。融合蛋白能自组装形成多种有用的高级聚合形式，如颗粒或其它聚合体；融合蛋白有多方面应用，包括作为人或兽用疫苗、治疗、血液替代品、图象衬比试剂、金属螯合系统、胶凝剂、蛋白纯化平台、治疗性受体结合蛋白。
文档编号A61K39/385GK1659187SQ03813504
公开日2005年8月24日 申请日期2003年5月12日 优先权日2002年5月10日
发明者丹尼尔·C·卡特, 切斯特·Q·李 申请人:新世纪药品有限公司