经皮肉毒杆菌毒素组合物的制作方法

专利名称：经皮肉毒杆菌毒素组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有神经毒素的药用组合物。具体地讲，本发明涉及含有诸如肉毒杆菌毒素的梭菌神经毒素的组合物，用于给患者经皮外部使用。
背景肉毒杆菌毒素梭菌属具有超过127个种，这些种是按照它们的形态学和功能分类的。厌氧性的，格兰氏阳性肉毒杆菌能产生有效的多肽神经毒素——肉毒杆菌毒素，它能够在人类和动物身体上导致被称为肉毒中毒的神经瘫痪疾病。发现肉毒杆菌的孢子存在于土壤中，并且能够在家庭式罐头工厂的没有适当消毒和密封的食品容器中生长，它是导致很多肉毒中毒的病例的原因。肉毒中毒的作用，通常在食用了受到肉毒杆菌培养物或孢子感染的食品18-36小时之后出现。所述肉毒杆菌毒素能明显通过肠道的衬里而又不会被减毒，并且侵害外周运动神经元。肉毒杆菌毒素中毒的症状，可以从行走、吞咽、和语言困难发展到呼吸肌的瘫痪和死亡。
A型肉毒杆菌毒素是人类已知的最致命的天然生物学制剂。大约50皮克的市售A型肉毒杆菌毒素(纯化的神经毒素复合物)1是小鼠的LD50剂量(即1个单位)。一个单位的BOTOX含有大约50皮克(大约56attomoles)的A型肉毒杆菌毒素复合物。有趣的是，以摩尔为单位计算，A型肉毒杆菌毒素比白喉的毒性强大约18亿倍，比氰化钠的毒性强大约6亿倍，比眼镜蛇毒素的毒性强大约三千万倍，比霍乱的毒性强大约一千二百万倍。Singh，Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins，pages 63-84(chapter 4)of Natural Toxins II，edited by B.R.Singh等，Plenum Press，New York(1976)(其中，所说的相当于1U的0.3ng的A型肉毒杆菌毒素的LD50是校正过的，因为以下事实大约0.05ng的BOTOX相当于1个单位)。将一个单位(U)的肉毒杆菌毒素定义为在腹膜内注射到重量分别为18-20克的雌性Swiss Webster小鼠体内之后的LD50。
(1购自Allergan，Inc.，ofIrvine，California，商标为BOTOX，100个单位/瓶)
业已鉴定了七种肉毒杆菌神经毒素，它们分别是肉毒杆菌神经毒素血清型A，B，C1，D，E，F和G，它们分别是通过用类型专一性抗体的中和区分的。肉毒杆菌毒素的不同的血清型根据它们所影响的动物的物种以及它们所引起的瘫痪的严重性和持续时间而变化。肉毒杆菌毒素明显以高亲和力与胆碱能运动神经元结合，被转运到神经元中，并且抑制乙酰胆碱的释放。
无论血清型如何，毒素中毒作用的分子机制似乎是类似的，并且包括至少三个步骤或阶段。在所述过程的第一个步骤中，所述毒素通过重链，H链，和细胞表面受体之间的专一性相互作用与目标神经元的突触前膜结合；对于每一种类型的肉毒杆菌毒素和破伤风毒素来说，它们的受体被认为是不同的。H链的羧基末端片段5Hc对于将所述毒素导向细胞表面来说是似乎是重要的。
在第二个步骤中，毒素通过中毒细胞的细胞质膜。所述毒素首先通过受体介导的内吞作用被所述细胞吞噬，并且形成含有所述毒素的核内体。所述毒素随后从核内体中逃出，进入所述细胞的细胞质。该步骤被认为是通过H链的氨基末端片段——HN介导的，它能对大约5.5或更低的pH响应引起所述毒素的构像变化。已知核内体具有质子泵，它能降低核内体内的pH。所述构像改变，暴露出所述毒素内的疏水性残基，这使得所述毒素能将它自身包埋在核内体膜中。然后所述毒素(或者起码是所述轻链)通过核内体膜转运到细胞质中。
肉毒杆菌毒素活性机制的最后一个步骤似乎涉及连接重链——H链，和轻链——L链的二硫键的还原。肉毒杆菌和破伤风毒素的完整的毒性包含在全毒素的L链中；所述L链是锌(Zn++)肽键内切酶，它能选择性地裂解含有神经递质的液泡识别并且停靠质膜的细胞质表面所必需的蛋白，以及液泡与质膜融合所必需的蛋白。破伤风神经毒素，B，D，F，和G型肉毒杆菌毒素能导致小突触泡蛋白(又被称为液泡相关的膜蛋白(VAMP))——突触体膜蛋白的降解。大部分存在于突触液泡的细胞质表面上的VAMP由于所述任意一种裂解事件被清除。肉毒杆菌毒素血清型A和E能裂解SNAP-25。肉毒杆菌毒素血清型C1最初被认为能裂解突触融合蛋白，不过，被证实能裂解突触融合蛋白和SNAP-25。每一种肉毒杆菌毒素能专一性裂解不同的键，B型肉毒杆菌毒素(和破伤风毒素)除外，它能裂解相同的键。
业已将肉毒杆菌毒素用于治疗以机能亢进的骨骼肌为特征的神经肌肉疾病的临床设置。美国食品和药物管理局业已批准了将A型肉毒杆菌毒素复合物(BOTOX)用于治疗脸痉挛，斜视和半面痉挛，颈肌张力障碍，以及治疗唇瓣皱纹。FDA还批准了将B型肉毒杆菌毒素(MYOBLOCTM)用于治疗颈肌张力障碍。与A型肉毒杆菌毒素相比，非A型肉毒杆菌毒素血清型具有明显更低的效力和/或更短的活性时间。外周肌内A型肉毒杆菌毒素的临床作用通常在注射之后1天或几小时内出现。通过一次肌内注射A型肉毒杆菌毒素所导致的症状减轻的典型的持续时间平均为大约3-4个月。
尽管所有的肉毒杆菌毒素血清型表面上都能在神经肌肉接点抑制神经递质乙酰胆碱的释放，它们是通过影响不同的神经分泌蛋白和/或在不同的位点裂解所述蛋白而实现这一目的的。例如，A和E型肉毒杆菌都能裂解25千道尔顿(kD)的突触体相关蛋白(SNAP-25)，不过，它们能靶定该蛋白内的不同的氨基酸序列。B，D，F和G型肉毒杆菌毒素对与液泡相关的蛋白(VAMP，又被称为小突触泡蛋白)起作用，每一种血清型在不同位点裂解该蛋白。最后，业已证实了C1型肉毒杆菌毒素能裂解突触融合蛋白和SNAP-25。在作用机制上的这种差别，可以影响各种肉毒杆菌毒素血清型的相对效力和/或作用的时间。显然，可以从多种不同细胞类型中找到肉毒杆菌毒素的底物。例如，参见Biochem，J1；339(pt1)159-651999，和Mov Disord，10(3)3761995(胰腺胰岛B细胞至少包括SNAP-25和小突触泡蛋白)。
所有七种已知的肉毒杆菌毒素血清型的肉毒杆菌毒素蛋白分子的分子量大约为150kD。有趣的是，肉毒杆菌毒素是以包括150kD肉毒杆菌毒素蛋白分子和相关的非毒素蛋白的复合物形式释放的。因此，梭菌能够以900kD，500kD和300kD形式生产A型肉毒杆菌毒素复合物。B和C1型肉毒杆菌毒素显然是以700kD或500kD复合物形式生产的。D型肉毒杆菌毒素是以300kD和500kD复合物形式生产的。最后，E和F型肉毒杆菌毒素仅仅是以300kD复合物形式生产的。所述复合物(即分子量超过大约150kD)被认为包括非毒素血球凝集素蛋白和非毒素和非毒性非血球凝集素蛋白。这两种非毒素蛋白(它们与肉毒杆菌毒素分子一起构成了相关的神经毒素复合物)可以发挥作用，以便提供克服肉毒杆菌毒素分子的变性的稳定性，和在毒素摄入时针对消化性酸的保护作用。另外，还可能的是，肉毒杆菌毒素复合物越大(大于大约150kD的分子量)，肉毒杆菌毒素离开所述肉毒杆菌毒素复合物的肌内注射部位的速度可能越慢。
在体外研究中业已证实了肉毒杆菌毒素能抑制钾阳离子诱导的乙酰胆碱和去甲肾上腺素从脑干组织的原代培养物中的释放。另外，业已报导了肉毒杆菌毒素能抑制甘氨酸和谷氨酸在脊椎神经元的原代培养物中的释放，并且在大脑突触体制剂中，肉毒杆菌毒素能抑制以下每一种物质的释放神经递质乙酰胆碱，多巴胺，去甲肾上腺素(Habermann E.等，破伤风毒素和肉毒杆菌A和C神经毒素能抑制去甲肾上腺素从培养的小鼠大脑中释放，J Neurochem 51(2)；522-5271988)CGRP，P物质和谷氨酸(Sanchez-Prieto，J.等，肉毒杆菌毒素A能抑制来自豚鼠脑皮层突触体的谷氨酸胞吐作用，Eur J.Biochem 165；675-6811897。因此，在使用适当的浓度时，通过肉毒杆菌毒素抑制了大部分神经递质的由刺激引起的释放。例如，参见Pearce，L.B.，肉毒杆菌毒素的基础科学和医学的药理学鉴定，Toxicon 35(9)；1373-1412 at 1393；Bigalke H.等，肉毒杆菌A神经毒素能抑制在培养中的小鼠脊髓神经元中的非胆碱能突触转运，Neurons in Culture，Brain Research 360；318-3241985；Habermann E.，通过破伤风和肉毒杆菌A毒素抑制大鼠大脑匀浆物释放[3H]去甲肾上腺素和[3H]GABA，Experientia 44；224-2261988，Bigalke H.等，破伤风毒素和肉毒杆菌A毒素能抑制各种转运蛋白的释放和吸收，正如用来自大鼠大脑和脊椎的颗粒状制剂进行的研究所证实的，Naunyn-Schmiedeberg′s Arch Pharmacol 316；244-2511981，和；JankovicJ.等，用肉毒杆菌毒素治疗，Marcel Dekker，Inc.，(1994)，page 5。
A型肉毒杆菌毒素可以通过以下方法获得在发酵罐中建立并且生长肉毒杆菌培养物，然后按照已知方法收获并且纯化发酵的混合物。所有肉毒杆菌毒素血清型最初都是以无活性的单链蛋白形式合成的，所述蛋白必须通过蛋白酶裂解或切口，以便成为能刺激神经的形式。所述细菌菌株能够使肉毒杆菌毒素血清型A和G具有内源蛋白酶，因此，血清型A和G能够主要以它们的活性形式从细菌培养物中回收。相反，肉毒杆菌毒素血清型C1，D和E是通过非蛋白裂解菌株合成的，因此，在从培养物中回收之后通常是无活性的。血清型B和F是通过蛋白裂解和非蛋白裂解菌株生产的，因此，能够以活性或非活性形式回收。不过，即使所述蛋白裂解菌株能产生，例如，B型肉毒杆菌毒素血清型，它只能裂解所产生的毒素的一部分。切口的与未切口的分子的确切比例取决于培养时间和培养温度。因此，任何制剂的特定百分比，例如，B型肉毒杆菌毒素可能是无活性的，这可能是由于与A型肉毒杆菌毒素相比，已知B型肉毒杆菌毒素具有显著更低的效力。
可以用肉毒杆菌的Hall A菌株生产高质量的结晶A型肉毒杆菌毒素，它的特征是≥3×107U/mg，A260/A278低于0.60，以及在凝胶电泳上的独特的带型。可以将已知的Shantz方法用于获得结晶A型肉毒杆菌毒素，正如在以下文献中所披露的Shantz，E.J.等，肉毒杆菌毒素和其他微生物神经毒素在医学上的特性和应用，Microbiol Rev.56；80-991992。一般，A型肉毒杆菌毒素复合物可以通过在合适的培养基中培养A型肉毒杆菌从厌氧发酵液中分离和纯化。还可以使用已知方法，通过分离非毒素蛋白，获得纯的肉毒杆菌毒素，例如纯化的A型肉毒杆菌毒素，分子量大约为150kD，比效力为1-2×108LD50U/mg或更高；纯化的B型肉毒杆菌毒素的分子量大约为156kD，比效力为1-2×108LD50U/mg或更高，并且；纯化的F型肉毒杆菌毒素的分子量大约为155kD，比效力为1-2×107LD50U/mg或更高。
肉毒杆菌毒素和/或肉毒杆菌毒素复合物可以从以下公司获得Allergan Inc(Irvine，California)，Ipsen Beaufour(France)，ElanPharmaceuticals(Ireland)，List Biological Laboratories，Inc.，Campbell，California；the Centre for Applied Microbiology and Research，PortonDown，U.K.；Wako(Osaka，Japan)，Metabiologics(Madison，Wisconsin)以及Sigma Chemicals of St Louis，Missouri。
尽管存在某种不稳定性，可以将纯的肉毒杆菌毒素用于制备药用组合物，同肉毒杆菌毒素复合物如A型毒素复合物一样，容易因为表面变性，加热和碱性条件而发生变性。失活的毒素形成了类毒素蛋白，它可能是免疫原性的。所产生的抗体可能使得患者能够耐受毒素注射。
一般，就酶而言，所述肉毒杆菌毒素(它是细胞内肽酶)的生物学活性，至少部分取决于它们的三维构像。因此，A型肉毒杆菌毒素是通过加热，各种化学表面拉伸和表面干燥解毒的。另外，众所周知的是，通过已知的培养，发酵和纯化获得的毒素复合物，在稀释到远远低于用于药用组合物制剂的毒素浓度，导致了所述毒素的迅速解毒，除非存在合适的稳定剂。将毫克数量的毒素稀释到每毫升含有纳克数量的溶液，存在明显的难度，因为在所述大比例的稀释时，专一性毒性的迅速丧失。由于在制备了含有毒素的药用组合物之后，所述毒素可以在数月或数年后使用，所述毒素可以用诸如白蛋白和明胶的稳定剂稳定化。
一种含有商业化的肉毒杆菌毒素的药用组合物，是以BOTOX为商标出售的(购自Allergan，Inc.，ofIrvine，California)。BOTOX包括以无菌的真空干燥形式包装的纯化的A型肉毒杆菌毒素复合物，白蛋白和氯化钠。A型肉毒杆菌毒素复合物是用生长在含有N-Z胺和酵母抽提物的培养基中的肉毒杆菌的Hall菌株的培养物制备的。A型肉毒杆菌毒素复合物是从所述培养溶液中纯化的，通过一系列的酸沉淀，产生包括活性高分子量毒素蛋白和相关的血球凝聚素蛋白构成的晶体。将所述晶体复合物重新溶解在含有盐水和白蛋白的溶液中，并且消毒过滤(0.2微米)，然后进行真空干燥。将所述真空干燥的产物放在冰箱中或在-5℃下保存。BOTOX可以在肌内注射之前用无菌的，没有防腐剂的盐水重建。每一瓶BOTOX含有大约100个单位(U)的A型肉毒杆菌毒素纯化的神经毒素复合物，0.5毫克的人血清白蛋白和0.9毫克的氯化钠，它是没有防腐剂的无菌的真空干燥形式。
为了重建真空干燥的BOTOX，使用不含防腐剂的无菌的生理盐水(0.9％氯化钠注射液)，包括将适量的稀释剂吸入合适尺寸的注射器中。由于BOTOX可以通过气泡或类似的剧烈搅拌变性，因此需要将所述稀释剂柔和地注入所述小瓶。出于无菌性的考虑，BOTOX优选在所述小瓶从冰箱中取出并且重建之后4小时内使用。在这4小时时间内，可以将重建的BOTOX保存在大约2-大约8℃的冰箱中。业已报导了重建的，冷藏的BOTOX，能保持它的效力至少大约4周时间。Dermatol Surg 1996Jan；22(1)39-43。
业已报导了，将A型肉毒杆菌毒素用于以下临床设施中(1)每一次将大约75-125个单位的BOTOX肌内注射(multiplemuscles)，以便治疗颈肌张力障碍；(2)每次肌内注射5-10个单位BOTOX以便治疗眉间线(眉毛皱眉)(将5个单位肌内注射到降眉间肌，并且将10个单位肌内注射到每一个皱眉肌)
(3)通过耻骨直肠肌的括约肌内注射大约30-80个单位的BOTOX治疗便秘；(4)每块肌肉肌内注射大约1-5个单位的BOTOX以便通过注射上眼睑的侧前跗骨眼轮匝肌和下眼睑的侧前跗骨眼轮匝肌治疗脸痉挛。
(5)通过肌内注射大约1-5个单位BOTOX至眼外肌治疗斜视，注射量根据要注射的肌肉的尺寸和需要的肌肉麻痹程度(即需要的屈光度校正)而改变。
(6)通过将BOTOX肌内注射到五个不同的上肢屈肌中，治疗中风之后的上肢痉挛，以上五个屈肌如下(a)指深屈肌7.5U-30U(b)指浅屈肌(flexor digitorum sublimus)7.5U-30U(c)尺侧腕屈肌10U-40U(d)桡侧腕屈肌15U-60U(e)肱二头肌50U-200U。以上五种标明的肌肉中的每一种都是在相同的治疗期注射的，以便在每一个治疗期，患者通过肌内注射接受90U-360U的上肢屈肌BOTOX。
(7)为了治疗偏头痛，颅骨膜注射(对称地注射到眉间，额头和颞肌)25U的BOTOX与注射赋形剂相比，业已表现出作为预防性治疗偏头痛的显著效果，该效果表现为在25U注射之后3个月时间降低了偏头痛的频率，减弱了最大严重程度，减少了相关的呕吐和急性药物治疗的使用。
另外，业已将肌内肉毒杆菌毒素用于治疗帕金森病患者的颤栗，尽管业已报导了治疗的效果并不理想。Marjama-Jyons，J.等，以颤栗为主的帕金森病，Drugs & Aging 16(4)；273-2782000。
已知A型肉毒杆菌毒素可能具有长达12个月的效力(European J.Neurology 6(Supp4)S111-S11501999)，并且在某些场合下，效力可以达到27个月。The Laryngoscope 1091344-13461999。不过，肌内注射BOTOX常见持续时间通常为大约3-4个月。A型肉毒杆菌毒素在治疗多种临床症状上获得的成功，业已导致了对其他肉毒杆菌毒素血清型的兴趣。例如，参见Eur J Neurol 1999 Nov；6(Suppl 4)S3-S10。
除了在外周部位具有药理学作用之外，肉毒杆菌毒素在中枢神经系统中可能还具有抑制作用。Weigand等，Nauny-Schmiedeberg′s Arch.Pharmacol.1976；292，161-165，和Habermann，Nauny-Schmiedeberg′s Arch.Pharmacol.1974；281，47-56的研究工作业已证实了肉毒杆菌毒素可以通过倒退转运上升到脊髓部位。这样，在外周部位注射，例如肌内注射的肉毒杆菌毒素可以倒退转运到脊髓中。
美国专利号5,989,545披露了修饰过的梭菌神经毒素或它的片段，优选肉毒杆菌毒素，与特定的导向部分化学缀合或重组融合之后，可用于通过在脊髓上使用这种制剂治疗疼痛。
肉毒杆菌毒素最常见的是作为治疗剂通过使用针头或注射器将含有肉毒杆菌毒素的组合物注射到患者体内给药的。不过，业已考虑到肉毒杆菌毒素以及与非肉毒杆菌毒素受体标记结合的肉毒杆菌毒素的其他给药模式。某些给药模式包括肉毒杆菌毒素的外部使用(例如，参见美国专利号6,063,768；美国专利号5,670,484；和德国专利公开号DE 198 52981)。德国专利公开号DE 198 52 981披露了用于治疗多汗症的含有A型肉毒杆菌毒素和50％二甲亚砜(DMSO)溶液的组合物。尽管DE 198 52981披露了可以将肉毒杆菌毒素用于通过外部涂敷在皮肤上治疗多汗症，尚不清楚肉毒杆菌毒素是否能渗透人的皮肤，或者所述作用是由通过汗腺毛孔的肉毒杆菌毒素介导的。无论如何，尽管DE 198 52 981披露了外部使用存在于DMSO溶液中的肉毒杆菌毒素可用于治疗多汗症，但含有DMSO的组合物是不理想的，因为DMSO可能刺激皮肤。另外，尽管美国专利5,670,484披露了外部使用肉毒杆菌毒素可以治疗皮肤病变，但是它没有披露本文所述的含有肉毒杆菌毒素和促进剂的组合物。另外，美国专利5,670,484仅披露了外部使用肉毒杆菌毒素可以抑制细胞增殖。它没有说明通过外部使用肉毒杆菌毒素治疗与胞内分子的神经分泌相关的疾病。还可参见WO 00/15245和Grusser Von O-J.，Die erstensystematischen Beschreibungen und tierexperimentellen Untersuchungen desbotulismus，Sudhoffa Archiv(1986)，70(2)，167-186。
经皮输送人类皮肤包括真皮和表皮。表皮具有若干层组织，即角质层，透明层，颗粒层，棘层，和基底层(从皮肤外表面向内按顺序说明)。角质层构成了药物治疗的经皮输送的最主要的障碍。角质层通常大约为10-15μm厚，并且它包括扁平的，排列成若干层的角化细胞(角质细胞)。角质细胞之间的细胞间隙充满了脂类结构，并且可能在通过皮肤的物质渗透方面发挥重要作用(Bauerova等，用于经皮药物转运的化学促进剂，EuropeanJournal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics，2001，26(1/2)85-94)。角质层下面的表皮的其余部分大约为150μm厚。真皮大约1-2mm厚，并且位于表皮下面。真皮是通过各种毛细管以及神经元过程受神经支配的。
药物的经皮给药一直是企图提供没有与注射和口腔输送相关的不理想的后果的药物治疗的替代给药途径的研究的目标。例如，针头通常会导致局部疼痛，有可能使接受注射的患者接触血液传播的疾病。口服具有药物治疗的低生物利用率的缺陷，它是由于患者胃中的极强的酸性环境造成的。经皮给药技术试图通过提供药物的非入侵性给药克服上述缺陷。通过经皮给药减轻对患者皮肤的损伤是理想的。因此，药物的经皮给药可以减轻或消除与注射相关的疼痛，降低血液污染的可能性，并且在所述药物系统性进入患者体内后提高药物的生物利用率。
有关药物治疗的经皮给药的企图业已尝试了提高角质层的可渗透性。经皮治疗的大部分努力是针对使用药物制剂的，所述药物制剂被整合到患者循环系统中，并因此是通过皮肤系统地给药的。某些尝试业已包括了使用化学促进剂，它能提高分子通过皮肤的可渗透性。某些尝试业已包括了使用机械装置绕过或融化角质层部分。另外，尝试业已包括了使用超声波或离子电渗疗法促进药物通过皮肤的渗透。正如上文所指出的，所述治疗方法的目的是通过皮肤输送药物制剂，通常是小分子，以便制剂能够通过真皮中的毛细血管床，在这里，所述制剂能够系统性地结合到患者体内，以便获得治疗效果。
尽管小分子一直是经皮给药技术的主要焦点，要指出的、重要的是，诸如多肽和蛋白复合物的大分子似乎也适合经皮给药。分子量为大约48kD的促红细胞生成素也已成功地经皮给药(Mitragotri等，超声波-介导的经皮蛋白输送，Science，1995，269850-853；美国专利号5,814,599；和6,002,961)。
因此，需要的是含有治疗有效量的神经毒素的药物组合物或制剂，它使得神经毒素能够渗透患者皮肤，并且保持神经毒素的生物活性，以便产生治疗效果，而又没有与给药神经毒素相关的不希望有的疼痛。
概述本发明满足了这种需求，并且提供了包括神经毒素的药用组合物，该组合物是能够经皮给药的。本发明的组合物可用于将神经毒素输送到皮下结构，如皮肤肌肉，皮下汗腺，或皮下感觉神经元。因此，本文所披露的组合物可用于有效治疗与痉挛肌相关的神经肌疾病，治疗交感神经神经元疾病，如与机能亢进的汗腺相关的疾病，或减轻炎症或与炎症相关的疼痛，因此，可以将神经毒素用作止痛剂。
本文使用了以下定义″大约″表示大致地或接近地，并且在本文所提供的数值或范围中表示所引用或要求保护的数值的10％。
″局部使用″表示将药物直接用在或用于动物身体上或内的部位或附近，在所述部位需要所述药物的生物学作用。局部使用排除了系统性给药途径，如静脉内或口服。外部使用是局部使用的一种类型，其中，将药物制剂使用在人的皮肤上。诸如肉毒杆菌毒素的神经毒素的外部使用，排除了神经毒素的系统使用。换句话说，与常规经皮治疗方法不同，肉毒杆菌毒素的外部使用不会导致大量的，如大部分神经毒素进入患者的循环系统。
″神经毒素″表示对神经元细胞表面受体具有特定亲和力的生物学活性分子。神经毒素包括梭菌毒素，可以是纯的毒素和一种或多种无毒的，与毒素相关的蛋白复合的毒素。
″稳定化的肉毒杆菌毒素″表示仍然具有生物学活性或仍然能够与靶细胞结合的肉毒杆菌毒素，以便肉毒杆菌毒素能够有效减轻或预防如神经递质或肽的胞内分子由细胞的胞吐作用，所述肉毒杆菌毒素结合在所述细胞上。稳定化的肉毒杆菌毒素是没有细胞毒性的。
″促进剂″表示能够促进患者皮肤的可渗透性，以便肉毒杆菌毒素可以被皮肤吸收的制剂，以便取得治疗效果。在本说明书中，促进剂专门排除了二甲亚砜(DMSO)或pluronic lecithin organizer(PLO)和DMSO的组合。促进剂可以包括，但不局限于醇，如短链醇，长链醇，或多元醇；胺和酰胺，如尿素，氨基酸或它们的酯，酰胺，AZONE，AZONE的衍生物，吡咯烷酮，或吡咯烷酮的衍生物；萜烯或萜烯的衍生物；脂肪酸及其酯，大环化合物；表面活性剂；或除了二甲亚砜以外的亚砜，如癸甲基亚砜；脂质体；转化体(transfersome)；卵磷脂液泡；ethosomes；水；表面活性剂，如阴离子，阳离子，和非离子表面活性剂；多羟基化合物；和香精油。
用于本文披露的药用组合物中的神经毒素可以是由细菌生产的神经毒素，例如，神经毒素可以由肉毒杆菌，丁酸梭状芽胞杆菌，或Clostridiumberatti生产。在本发明的某些实施方案中，所述组合物可以包括肉毒杆菌毒素，可以是A型，B型，C1型，D型，E型，F型，或G型肉毒杆菌毒素。所述肉毒杆菌毒素以能导致大约10-3U/kg-大约10U/kg的肉毒杆菌毒素渗透通过皮肤的量存在于所述组合物中。所述组合物可以含有一定量的肉毒杆菌毒素，它能导致治疗效果持续大约1个月-5年。
其他神经毒素包括重组生产的神经毒素，如由大肠杆菌生产的肉毒杆菌毒素。作为补充或替代，神经毒素可以是修饰过的神经毒素，与天然的神经毒素相比，它是具有至少一个氨基酸缺失，修饰或取代的神经毒素，或所述修饰过的神经毒素可以是重组生产的神经毒素或它的衍生物或片段。所述神经毒素仍然能够抑制神经递质释放。
本文所披露的含有神经毒素的组合物是给患者外部使用的。由于神经毒素是外部使用的，优选将所述组合物涂在疼痛部位或因为出汗而潮湿的部位或接近所述部位的部位。例如，如果是由痉挛肌导致的疼痛的话，可以将所述组合物涂在痉挛肌上面的皮肤上，以便对下面的痉挛肌进行化学去神经。或者，如果特定部位发炎，如通过P物质或降血钙素基因相关肽(CGRP)的神经元释放导致的发炎，就可以将所述组合物用在所述发炎部位。另外，如果人的汗腺过度分泌流体的话，可以将所述组合物涂在所述出汗部位附近，以便减少汗腺的神经元的神经分布。例如，可以将所述组合物涂在一个或多个腑窝，手掌或任何其他出汗结构上。
本人业已惊奇地发现，诸如A型肉毒杆菌毒素的肉毒杆菌毒素可以经皮给药，以便减轻人类患者所经历的疾病。所使用的肉毒杆菌毒素的给药量，能够使大约10-3U/kg-10U/kg的肉毒杆菌毒素通过患者皮肤。所述肉毒杆菌毒素的存在量优选是这样的，以便大约10-2U/kg-大约1U/kg的毒素能经皮通过患者皮肤。更优选的是，所述肉毒杆菌毒素的存在量使得大约10-1U/kg-大约1U/kg的毒素通过患者皮肤。最优选的是，所述肉毒杆菌毒素的存在量使得大约0.1单位-大约5个单位的毒素通过患者皮肤，到达皮下目标。重要的是，当给药的是肉毒杆菌毒素的水溶液时，所述组合物中毒素的治疗作用，可以持续大约2个月-大约6个月，当所述肉毒杆菌毒素是以能保持所述毒素，并且在通过皮肤之后缓慢释放毒素的组合物给药时，可以持续大约5年时间。例如，参见美国专利6,312,708。
有利的是，本人业已通过外部使用含有肉毒杆菌毒素的组合物发现，即使在给药较高剂量时也能够避免肉毒中毒的系统性毒性的潜在并发症，因为皮肤的角质层仍然保持某些不可渗透性。因此，肉毒杆菌毒素(包括A，B，C，D，E，F，或G型)的剂量可以低到大约1个单位至高到大约20,000个单位，而不用担心可能威胁患者的副作用。所述特定剂量可以根据要治疗的症状和所使用的具体的促进剂和治疗方案而改变。例如，皮下治疗机能亢进的肌肉可能需要大剂量(例如，1000个单位-20,000个单位)的肉毒杆菌毒素，它是以含有促进剂的组合物形式外部使用的。与之对应的是，神经性炎症或机能亢进的汗腺的治疗，可能需要较小的外用剂量(例如，大约1个单位-大约1,000个单位)的肉毒杆菌毒素。
本发明的实施方案可以是含有稳定化的肉毒杆菌毒素和至少一种促进剂的药用组合物，所述促进剂通过增强患者皮肤的可渗透性促进肉毒杆菌毒素经皮输送到人类患者体内。肉毒杆菌毒素可选自下列一组A，B，C1，D，E，F和G型肉毒杆菌毒素，纯的或纯化的(即大约150kD)肉毒杆菌毒素，以及天然的或重组生产的肉毒杆菌毒素。所述组合物可以包括大约1个单位或-大约20,000个单位的肉毒杆菌毒素，并且所述组合物可以包括足以获得持续1个月-5年的治疗效果的量的肉毒杆菌毒素。
特别是，所述促进剂可以是醇，如多元醇。另外，所述促进剂可以包括转化体。另外，所述组合物可以包括多种促进剂。
本发明的详细实施方案可以包括用在经皮贴剂上的药用组合物，包括稳定化的肉毒杆菌毒素，它能渗透人类患者皮肤，而又不会在肉毒杆菌毒素与经皮贴剂中提供的促进剂相互作用时大量通过血管，以便对与来自细胞的分子的胞吐作用相关的疾病产生治疗作用。“不会大量渗透”表示存在于药用组合物中的肉毒杆菌毒素少于25％，优选少于5％可以在使用所述经皮贴剂时渗透进入血管。
所述组合物中的肉毒杆菌毒素可以在将经皮贴剂贴在患者皮肤上之前以干燥状态提供在所述经皮贴剂上。所述肉毒杆菌毒素可以在将经皮贴剂贴在患者皮肤上之后与促进剂混合。因此，肉毒杆菌毒素可以在将经皮贴剂贴在患者皮肤上之前与涂在患者皮肤上的促进剂混合。
本发明的另一种实施方案包括经皮贴剂，它包括可以药用的组合物，该组合物包括稳定化的肉毒杆菌毒素，和能促进所述肉毒杆菌毒素以生物活性形式经皮给药到人类患者的皮下目标部位而又不会进入患者循环系统的促进剂；以及放置在所述经皮贴剂一侧的黏结剂，以便将所述经皮贴剂可除去地固定在患者皮肤上。可以将所述黏结剂沉积在装有所述药用组合物的贮库周围。
所述经皮贴剂还可以包括从经皮贴剂贴在患者皮肤上的一侧延伸出来的多个针头，其中，所述针头从所述经皮贴剂上延伸穿过皮肤的角质层，而又不会破坏血管。肉毒杆菌毒素能够在经皮贴剂上的贮库中提供，以便施加在经皮贴剂上的压力可以导致肉毒杆菌毒素直接通过所述针头并且到达角质层下面。另外，肉毒杆菌毒素能够以干燥状态在多个孔中提供，每一个孔由可以用流体溶解的膜覆盖，并且，其中，当覆盖孔的膜溶解时，所述促进剂与肉毒杆菌毒素混合，以便促进肉毒杆菌毒素的吸收。
本发明还涉及减少神经递质在患者皮下结构中释放的方法，该方法包括以下步骤非化学地破坏患者皮肤的角质层，以便降低角质层的不可渗透性；和将肉毒杆菌毒素涂在患者皮肤上已在第一个步骤中破坏了其角质层的部位。所述角质层可以通过摩擦除去角质层进行破坏。因此，可以通过将粘性材料涂在患者皮肤上，并且除去涂在患者皮肤上的粘性材料破坏角质层。另外，可以通过以不会对患者皮肤造成永久性损伤的强度施加频率为20kHz-低于10MHz的超声波破坏角质层。或者可以通过让电流从患者皮肤上的第一个点流向患者皮肤上的第二个点破坏角质层。可以让所述电流通过，以便在角质层上产生多个孔，以便促进肉毒杆菌毒素向皮下结构的输送。还可以将肉毒杆菌毒素用在含有促进剂的药用组合物中，所述促进剂增强肉毒杆菌毒素通过皮肤的输送。因此，可以将肉毒杆菌毒素整合在转化体中。
本发明还涉及缓解患者体内由痉挛肌导致的疼痛的方法，该方法包括以下步骤(a)对覆盖痉挛肌的患者皮肤施加频率为大约10kHz-1MHz的超声波；和(b)将肉毒杆菌毒素涂在业已接受了步骤(a)的超声波处理的患者皮肤上。该方法还可以包括摩擦性地除去接受所述超声波的患者皮肤的部分角质层的步骤。
说明本发明的药用组合物能够通过人的皮肤输送肉毒杆菌毒素，如纯化的150kD肉毒杆菌毒素分子或300-900kD肉毒杆菌毒素复合物。所述药用组合物包括能够促进肉毒杆菌毒素渗透通过患者皮肤的促进剂。所述药用组合物适合外部使用，以便所述组合物能够穿透皮肤并且经皮使得下部目标结构不受神经支配，如通过神经元受神经支配的结构。所述组合物可以是经皮贴剂的成分，可以将它粘性固定在皮肤上，以便所述毒素能够从经皮贴剂通过皮肤以使下部目标不受神经支配。
本发明基于以下发现含有肉毒杆菌毒素和促进剂的药用组合物在涂在人的皮肤上时能够成功地治疗与神经递质释放相关的若干种类型的疾病。可以通过外部使用本文所披露的组合物治疗的疾病的例子包括，但不局限于皱纹，如眉毛皱纹，头痛，如偏头痛，头痛，颈肌张力障碍，局部手肌张力障碍，神经性炎症，多汗症，脸痉挛，斜视，半面痉挛，眼睑疾病，大脑性麻痹，局部痉挛，肢体痉挛，抽搐，颤栗，磨牙症，肛裂，纤维肌痛，吞咽困难，流泪，和由肌肉痉挛造成的疼痛。在使用所述毒素时外部使用的所述毒素减轻了患者所经历的疼痛，因为没有必要在患者身上扎针，而扎针有可能激活皮肤下面的感觉疼痛的神经元。本文所披露的组合物提供了由肉毒杆菌毒素产生的局部缓解，而又不会出现系统使用肉毒杆菌毒素的风险。
在本文所披露的发明中所使用的神经毒素是能抑制化学或电信号传递的神经毒素。所述神经毒素优选是对接触所述神经毒素的细胞没有细胞毒性的。所述神经毒素能够通过减弱或防止来自接触神经毒素的神经元的神经递质的胞吐作用抑制神经传递。通过神经毒素提供的抑制作用应当持续较长时间，例如，超过两个月，并有可能持续几年。
用于所述组合物中的神经毒素的例子包括，但不局限于由梭菌属细菌生产的神经毒素，如肉毒杆菌，丁酸梭状芽胞杆菌和Clostridium beratti。另外，用于本发明方法中的神经毒素可以是选自下列一组的肉毒杆菌毒素A，B，C，D，E，F和G型肉毒杆菌毒素。在本发明的一种实施方案中，给患者给药的是神经毒素是A型肉毒杆菌毒素。A型肉毒杆菌毒素是理想的，因为它在人体上的高效性，便于利用性，并且已知在通过肌内注射局部使用时能够治疗骨骼和肌肉疾病。本发明还包括以下神经毒素的用途(a)通过细菌培养，毒素提取，浓缩，保持，冷冻干燥和/或重建获得或处理的神经毒素；和/或(b)修饰过的或重组的神经毒素，它是具有故意去掉的，修饰过的，或取代过的一个或多个氨基酸或氨基酸序列的神经毒素，以上过程是通过已知的化学/生物化学氨基酸修饰方法或通过使用已知的宿主细胞/重组载体重组技术而实现的，以及如此生产的神经毒素的衍生物或片段。所述神经毒素变体应当保持抑制神经元之间的神经传递的能力，并且其中的某些变体可以提供与天然神经毒素相比延长了的抑制作用时间，或提供增强了的对接触神经毒素的神经元的结合专一性。所述神经毒素变体可以通过以下过程选择使用常规分析方法筛选所述变体，以便鉴定具有抑制神经传递的理想的生理学作用的神经毒素。
用于本发明的肉毒杆菌毒素可以以冷冻干燥，真空干燥形式保存在真空压力下的容器中或作为稳定的液体形式保存。在冷冻干燥之前，可以将肉毒杆菌毒素与可以药用的赋形剂，稳定剂和/或载体，如白蛋白混合。冻干的材料可以用盐水或水重建，以便制备给患者给药的含有肉毒杆菌毒素的溶液或组合物。
尽管所述组合物可能只含有一种类型的神经毒素，如A型肉毒杆菌毒素，作为抑制神经传递的活性成分，其他治疗性组合物可以包括两种或两种以上类型的神经毒素，它能提供对疾病的增强了的治疗作用。例如，给患者给药的组合物可以包括A型肉毒杆菌毒素和B型肉毒杆菌毒素。给药含有两种不同神经毒素的一种组合物，可以使得每一种神经毒素的有效浓度低于给所述患者给药一种神经毒素的浓度，但仍然能获得理想的治疗效果。
与神经毒素组合利用在药用组合物中的促进剂可以是任何非-DMSO型促进剂，它能促进皮肤的可渗透性，以便生物活性神经毒素能够作用于理想的目标结构。所述促进剂优选不会损伤皮肤，更优选能暂时渗透皮肤，以便所述神经毒素一旦通过所述皮肤输送，所述皮肤能减弱它对其他因子的可渗透性。
在本发明的一种实施方案中，所述促进剂是醇。醇的例子包括短链醇，如具有大约2-5个碳原子的醇。某些短链醇包括乙醇，异丙醇，甲醇和异丁醇，或它们的组合。所述醇可以在所述组合物中混合，以便醇在该组合物中的浓度为大约10％-大约40％。所述醇可以与甘油混合，以便减轻由较高浓度的醇所导致的潜在刺激。还可以将长链醇用于促进诸如肉毒杆菌毒素的神经毒素的经皮给药。长链醇的例子包括具有大约8-12个碳原子的醇，并且某些具体的例子包括n-dodekano，klenbuterol，和沙丁胺醇。还可以将多元醇与神经毒素一起使用。其例子包括聚丙二醇，甘油，聚乙二醇，和右泛醇，以及它们的组合。
在另一种实施方案中，促进剂可以是能够将神经毒素保存在液泡中的液泡。所述液泡可以通过皮肤扩散，因此将神经毒素输送到目标部位。所述液泡可以是脂类液泡。在一种具体实施方案中，将所述神经毒素整合在转化体中，转化体是含有脂类和膜柔软剂的可变形的载体(例如，Hofer等，用于白介素-1和干扰素-α的有效的经皮使用的新的可超级变形的药物载体理论和实践特征，World J.Surg.24，1187-1189(2000)；和美国专利号6,165,500)。令人吃惊的是，业已发现转化体能够成功地将神经毒素，包括肉毒杆菌毒素复合物转运通过皮肤，以便获得治疗效果。换句话说，所述神经毒素能够被输送到目标部位，并且在通过皮肤扩散之后仍然具有生物活性。
可以将本发明的组合物用于施用装置上，该装置能够将所述组合物施用在皮肤上的目标部位，而又不会将所述组合物施用在皮肤的非目标部位。例如，可以应用装置使用所述组合物，而又不会首先将所述组合物涂在人的手指上，这种接触有可能导致对所述手指的不理想的麻痹。合适的装置包括压舌板，药签，没有针头的注射器，以及粘性贴剂。压舌板或药签或类似装置的使用，可能需要将所述装置插入装有所述组合物的容器中。注射器或粘性贴剂的使用，可以通过用所述组合物填充所述注射器或经皮贴剂实现。然后可以通过压舌板或药签外部涂抹所述组合物，或者可以从注射器中排出涂抹在人的皮肤上。
在本发明的一种实施方案中，含有神经毒素和促进剂的组合物是在粘性贴剂中提供的。粘性贴剂的某些例子是众所周知的。例如，参见美国专利号Des.296,006；6,010,715；5,591,767；5,008,110；5,683,712；5,948,433；和5,965,154。经皮贴剂的一般特征是具有粘性层，该粘性层要贴在人的皮肤上，用于容纳药物制剂的贮库或储存装置，以及防止所述药物从所述贮库中泄露的外表面。所述经皮贴剂的外表面通常是非粘性的。
根据本发明，将神经毒素整合在所述经皮贴剂中，以便所述神经毒素长时间地保持稳定。可以将神经毒素整合到聚合物基质中，它能稳定神经毒素，并且使得神经毒素能够从所述基质以及所述经皮贴剂中扩散。还可以将神经毒素整合在所述经皮贴剂的粘性层中，以便一旦将经皮贴剂贴在皮肤上，所述神经毒素可以通过皮肤扩散。根据所述实施方案，所述黏结剂优选包括本文所披露的促进剂。在一种实施方案中，所述粘性层可以是加热激活的，其中，大约37℃的温度可以导致所述黏结剂缓慢地液化，以便神经毒素通过皮肤扩散。当它在低于37℃的温度下保存时，所述黏结剂保持是粘性的，并且一旦贴在皮肤上，所述黏结剂由于液化而丧失了它的粘性。一旦所述经皮贴剂不再能黏结在皮肤上，所述毒素的给药就结束了。
另外，所述神经毒素可以在设置在经皮贴剂表面附近的一个或多个孔或凹窝中提供，这些部位能接触皮肤。在一种实施方案中，神经毒素以干燥的或冻干的状态储存在所述孔中。在冷却环境(例如大约4℃)中保存所述经皮贴剂，能保持神经毒素的稳定性。可以在需要的时候将经皮贴剂从冷却环境中取出，并且贴在人的皮肤上，在这里，神经毒素在与诸如水或盐水的流体混合之后可以溶解。所述流体可以单独提供，或作为经皮贴剂的成分提供。例如，可以在人的皮肤上提供流体，以便当含有干燥的神经毒素的经皮贴剂与所述流体相互作用时，所述神经毒素接触所述流体并且被溶解。然后溶解了的神经毒素可以被皮肤吸收。作为另一种例子，所述经皮贴剂可以包括一个或多个孔或凹窝，以便将流体保持在所述经皮贴剂上。可以强制所述流体从所述孔或凹窝中流出，导致所述流体与干燥的神经毒素混合。在所述实施方案中，促进剂能够以流体形式提供，以便增强皮肤对所述神经毒素的可渗透性。例如，所述流体能够在经皮贴剂上的凹窝中提供。施加在经皮贴剂上的压力导致所述凹窝破裂并且释放所述流体，以便它与干燥的神经毒素混合。因此，含有神经毒素的组合物可以通过患者皮肤扩散。作为另一种例子，包括凝胶和含有水的乳液的流体可以涂在皮肤的目标部位。然后可以将含有干燥的神经毒素的经皮贴剂贴在所述皮肤上，在这里所述流体与神经毒素混合，并且该组合物扩散到皮肤中。
在包括具有干燥的神经毒素的孔的经皮贴剂上，最好密封所述孔，以便所述神经毒素保留在所述孔中，直到使用所述神经毒素。因此，用以下膜或薄膜密封所述孔它能够防止干燥状态的神经毒素从孔中扩散，但允许溶解了的神经毒素从所述孔中扩散。所述膜可以是有孔的或无孔的。在一种实施方案中，所述膜包括纤维素或淀粉，并且更具体地讲，所述膜可以包括聚乙烯醇，聚环氧乙烷，和羟丙基甲基纤维素。所述膜是薄的(厚度为大约1μm-大约1mm)，并且在接触流体时溶解。因此，放置在人的皮肤上的流体或直接来自经皮贴剂上的凹窝中的流体可以接触纤维素膜，并且导致所述膜溶解。在溶解之后，所述流体与干燥的神经毒素混合，并且溶解所述神经毒素。然后所述组合物扩散通过患者皮肤。
另外，经皮贴剂可以包括多个延伸通过角质层的小的针头，不过，它不会延伸到真皮中以便破坏血管。在从经皮贴剂的真皮表面上延伸时，所述针头的长度为20μm-1mm。因此，所述针头延伸通过角质层，但是，在到达具有毛细管床的真皮之前停止。所述针头可以是实心的或空心的。空心针头可以具有沿它们的长度分布的空腔，以便所述组合物能够从经皮贴剂上的贮库输送到表皮中的针头的末端。可以使用实心针头，以便使所述组合物沿针头的外表面扩散到表皮中。令人吃惊的是，业已发现这种针头长度是最佳的，能够减轻由较长的针头激活感觉疼痛纤维导致的疼痛。因此，含有神经毒素的组合物可以皮下使用，而又不会使患者产生明显的疼痛(如果有的话)。
因此，抑制神经递质在皮下结构中释放的方法可以包括以下步骤破坏角质层，以便减弱角质层的不可渗透性，并且将肉毒杆菌毒素涂在业已破坏了角质层的皮肤部位上。破坏角质层表示从患者皮肤的一部分上完全除去角质层，或从患者皮肤上的某一部位部分除去部分角质层，以便存在较小的无角质层的部位。所述皮肤可以用任何合适的方法破坏，而又不会对患者造成明显的疼痛。在所述方法的优选实施方案中，角质层是非化学破坏的。例如，可以摩擦擦洗角质层，以便破坏角质层的层状屏障。或者可以通过将诸如粘性胶带或蜡的黏结剂涂在皮肤上，然后将所述黏结剂从所述皮肤上除掉破坏角质层。由于这种破坏角质层的方法可能造成某些疼痛，可能需要提供对皮肤的外部麻醉，如利多卡因霜剂，以便暂时减轻由所述破坏所导致的任何疼痛。
能够以非化学方式增强皮肤通透性的其他经皮方法包括低频率超声波(20kHz-1MHz)。超声波被定义为频率为大约20kHz-10MHz，强度为0-3W/cm2的声波。本文所说的低频率超声波表示频率低于1MHz，优选20kHz-40kHz的声波。超声波是以脉冲形式发送的，例如，频率为1Hz的100毫秒的脉冲。超声波的强度可以在0-1W/cm2之间变化，并且频率在12.5mW/cm2-225mW/cm2之间变化。接触超声波的典型时间为大约1-大约10分钟。在施加超声波时不会导致皮肤温度上升超过1℃。可以单独使用低频率超声波，或与所述组合物组合使用，以便提高皮肤对神经毒素的可渗透性。用于改善皮肤可渗透性的超声波技术的例子可以参见美国专利号6,002,961和5,814,599。令人吃惊的是，业已发现低频率超声波在与含有肉毒杆菌毒素的组合物组合使用时，可以透化皮肤，但又不会明显改变诸如纯化的肉毒杆菌毒素或肉毒杆菌毒素复合物的神经毒素的三维构像。因此，保持了神经毒素的生物活性，并且明显治疗了所述疾病。
另外，超声波可以在将肉毒杆菌毒素涂在皮肤上之前发送。业已发现，当低频率超声波在外部涂敷肉毒杆菌毒素之前使用时，能暂时破坏角质层，以便随后外部涂敷肉毒杆菌毒素能获得治疗效果。换句话说，通过超声波导致的破坏持续几分钟，例如大约10-30分钟，以便使肉毒杆菌毒素比较容易经皮输送到患者体内。在大约30分钟之后，角质层开始恢复它的天然结构，并且角质层的可通透性暂时减弱。因此，本发明的一种方法包括以下步骤对皮肤的一个或多个部位施加低频率超声波，然后将肉毒杆菌毒素外部涂敷在皮肤的进行了低频率超声波处理的这些部位，其中，肉毒杆菌毒素是以含有促进剂的组合物形式提供的，它能促进肉毒杆菌毒素向患者体内的长时间的渗透。
其他方法包括离子电渗疗法，它可以通过让电流经过含有包括肉毒杆菌毒素的组合物的经皮贴剂帮助将肉毒杆菌毒素输送到皮下目标部位。在一种实施方案中，可以将一个电极安装在经皮贴剂的外表面上，并且将接地电极放置在患者皮肤的其他部位。通过放置在经皮贴剂上的电极施加小的直流电流，以便迫使所述组合物中的肉毒杆菌毒素通过患者皮肤。电流的量通常小于1mA/cm2，并且在优选实施方案中，电流是以0.3mA/cm2-0.7mA/cm2施加的。由于肉毒杆菌毒素通过皮肤的经皮输送的效果至少部分取决于肉毒杆菌毒素的极性，可能需要提高所述组合物的酸度，以便降低该组合物的pH，并且赋予肉毒杆菌毒素电荷，以便促进通过皮肤转运毒素的电流的效果。可以将含有肉毒杆菌毒素的组合物的pH降低到4，而又不会明显破坏所述分子的生物活性；不过，优选的pH在5.5-7.2之间变化。另外，让电流从电极中通过的时间不会对皮肤造成永久性破坏(例如烧伤)。例如，通电时间可以为大约1分钟-15分钟。对于较长时间的应用来说，需要脉冲电流，以便减弱由电流所导致的潜在的破坏作用。
神经毒素可以通过主治医生所认为的任何合适的方法外部使用。所述给药方法可以将神经毒素局部应用在特定的目标组织。给药方法包括用所述组合物涂敷皮肤，以便所述组合物至少覆盖所述目标部位的一部分。给药方法还包括将经皮贴剂贴在皮肤的目标部位上，并且导致经皮贴剂中的神经毒素扩散到皮肤中。为了长时间使用，使用了粘性经皮贴剂，以便组合物能够缓慢扩散到皮肤中，而不用反复使用经皮贴剂。例如，经皮贴剂可以包括微处理器，它能提供神经毒素从经皮贴剂中的定期释放。微处理器经皮贴剂在具有上文所述的微型针头或低频率超声波装置的经皮贴剂中可能是特别有利的。所述微处理器可以根据要治疗的特定症状提供组合物的定时释放。控制药物治疗装置的微处理器的例子可以参见美国专利号6,334,856。
肉毒杆菌毒素生物学活性在组织中的扩散似乎受剂量的影响，并且可以是逐步的。Jankovic J.，等，用肉毒杆菌毒素治疗，Marcel Dekker，Inc.，(1994)，page 150。因此，可以控制肉毒杆菌毒素的扩散，以便减弱可能影响患者疾病的潜在的不希望的副作用。例如，可以使用神经毒素，以便神经毒素主要影响与炎症相关的感觉神经元，而又不会影响其他皮下目标。在这种情况下，所述组合物可以使用较短的时间(例如，1-4小时)，以便只能局部扩散到患者的真皮中，其中，感觉神经元止于真皮。因此，神经毒素可作用于感觉神经元，以便减弱P物质或CGRP的释放，以便减轻炎症或与炎症相关的疼痛。
并不希望受任何特定理论的约束，可以提出用本发明的组合物获得的治疗效果的机制。本文所披露的促进剂似乎能溶解表皮的角质层，并提高神经毒素的流动性，因此在它到达皮下目标时保持所述神经毒素的生物活性。重要的是，本发明的局部使用神经毒素的组合物和方法可以将神经毒素用于患者身上，而又不会导致系统性毒性。正如本文所指出的，现有技术的经皮给药非-肉毒杆菌毒素治疗剂的方法，解决了治疗剂通过皮肤的系统使用。另外，在患者身上外部使用肉毒杆菌毒素的现有技术方法不包括使用本文所使用的促进剂。
正如上文所指出的，本人业已发现了含有神经毒素和促进剂的组合物令人吃惊地提供了对靠近患者皮肤的神经元活性相关的疾病的有效的和长时间的治疗，因此减轻了与所述疾病相关的症状。在它的最优选的实施方案中，本发明是通过外部使用A型肉毒杆菌毒素实现的。
实施例下面的实施例提供了本发明所涉及的用于治疗患者的特定的组合物和方法，但是这些实施例并是是用于限定本发明的范围的。例如，尽管以下实施例涉及含有A型肉毒杆菌毒素的组合物，本人业已发现B，C，D，E，F和G型肉毒杆菌毒素在本文所提供的组合物中经皮给药时具有同样的效果。应当指出的是，特定类型的肉毒杆菌毒素的剂量，可以根据需要相对本文所披露的特定剂量进行调整，正如本领域普通技术人员所能理解的。如上文所述，本文所披露的经皮给药方法可以给药较大范围浓度的肉毒杆菌毒素，而又不会危害患者的健康。
实施例1将100个单位的A型肉毒杆菌毒素溶解在1mL水中，并且与1mL的90％乙醇和1mL的聚乙二醇混合。用肉毒杆菌毒素的组合物填充注射器。将粘性溶液从注射器中排放到抱怨手掌出汗的患者的手掌上。用压舌板将该溶液涂布在整个手掌表面上。用塑料袋覆盖患者的手，形成空气密封大约1小时时间，以便降低所述组合物的蒸发速度。除去所述塑料袋，并且患者清洗他的手。大约2天之后，患者发现接受治疗的手不再出汗，而未治疗的手仍然出汗。出汗减少维持了大约6周时间，然后逐步恢复。在2只手上重复以上过程，并且在此后的大约2天时间内都表现出出汗的明显减少。
实施例2用85.8mg天然磷脂酰胆碱和14.2mg胆酸钠制备1mL10％的转化体悬浮液。添加大约0.9mL的磷酸缓冲液，以便溶解所述脂。对所述悬浮液进行若干次过滤，以便获得具有大致均匀的大小的液泡的悬浮液。将大约1000个单位的A型肉毒杆菌毒素(BOTOX)添加到所述液泡上，在4℃的温度下储存至少2天，最多大约30天。
具有眉毛皱纹的患者请求用肉毒杆菌毒素减少皱纹。让所述患者躺下。将上文所述的BOTOX和转化体的悬浮液外部使用在患者的前额上。大约1小时之后，所述悬浮液业已蒸发。大约6小时之后通知患者洗脸。大约2-3天之后，患者开始注意到前额皱纹的数量减少。大约第7天的时候，所述皱纹消失。BOTOX的效果持续了大约4个月时间。
实施例3在位于经皮粘性经皮贴剂的皮肤一侧的多个孔中提供冻干的BOTOX。所述经皮贴剂的尺寸为大约2英寸×3英寸(5cm×7.5cm)。所述孔在经皮贴剂的皮肤一侧(即经皮贴剂的靠近皮肤的一侧)排列成大约1cm2是网格状。每一个网格包括大约100个孔。所述经皮贴剂的皮肤一侧是用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)制造的。每一个孔容纳有大约50-100个单位的冻干的BOTOX。这些孔用可溶解的膜密封，所述膜是用聚乙烯醇，聚环氧乙烷，和羟丙基甲基纤维素制成的。在所述网格周围提供粘性边界。所述粘性边界的宽度大约为1cm，并且包括橡胶粘合剂，如购自B.F.Goodrich Co.的R-1072。在多个孔中装有冻干的BOTOX的经皮贴剂可以在4℃下保存几个月的时间，而又不会影响所述毒素的生物活性。
将上文所述的经皮贴剂贴在患者后背下部脊髓的任一侧的表现出脊柱肌肉机能亢进的部位。在涂敷之前，通过用95％乙醇清洗所述部位准备所述皮肤。将含有水，80％乙醇，和聚乙二醇的凝胶涂在脊髓任意一侧的大约1×2英寸的部位。将每一个经皮贴剂粘性贴在存在所述凝胶的背部。让所述经皮贴剂在所述位置上保持5-7天时间。所述凝胶溶解所述膜，并且溶解所述孔中的肉毒杆菌毒素。大约4天之后，患者注意到他的后背下部的肌肉松弛了，并且减轻了与肌肉收缩相关的疼痛。到第7天，患者发现疼痛完全消失。所述疼痛缓解作用持续了大约5个月时间。
实施例4患有颈肌张力障碍的患者接受四个经皮贴剂，每一个经皮贴剂具有大约2英寸×3英寸的尺寸，将所述经皮贴剂贴在覆盖僵硬肌肉的皮肤上。所述经皮贴剂包括一个干燥BOTOX的贮库和一个含盐水的凹窝。将超声波装置放置在所述经皮贴剂上。以15kHz的频率对所述经皮贴剂和患者皮肤施加超声波10分钟时间。所述超声波能量是脉冲的，以便减弱对患者皮肤的损伤。大约10分钟之后，医生拿走了所述超声波装置，并且对经皮贴剂施加压力，以便导致装有盐水的凹窝的破裂。从凹窝中排出的盐水与肉毒杆菌毒素混合，以便溶解所述毒素。所述组合物通过扩散经过皮肤输送。让经皮贴剂在原位保持大约5小时时间。在治疗大约2-3天之后，患者经历了疼痛的某些减轻和肌肉的放松。在治疗大约7天之后，疼痛几乎完全消除。治疗效果持续了大约3个月时间。
实施例5患有手掌多汗症的患者要求肉毒杆菌毒素治疗。医生对患者进行了评估，并且确定所述患者是肉毒杆菌毒素治疗的合适的候选者。医生用浮石摩擦擦洗患者的手掌。在大部分皮肤已经变粗糙之后，医生将含有大约10个单位BOTOX的基于盐水的凝胶涂在患者的手掌上。让患者的手保持在业已沿患者手腕密封的塑料袋中，以防凝胶的迅速蒸发。让患者的手在塑料袋中保持大约4小时。在治疗大约2天之后，患者注意到他的手掌多汗症的减轻。到第7天，出汗现象完全消失，并且患者没有报导肌肉活性的任何明显丧失。多汗症缓解作用持续了大约6-8周时间。
实施例6在通过用浮石摩擦擦洗皮肤进行准备之后，将含有大约1000个单位BOTOX的经皮贴剂贴在患者的发炎的眉毛上。在擦洗皮肤之后，在贴上经皮贴剂之前，将凝胶涂在眉毛上。将经皮贴剂贴在眉毛上的弯曲部位。所述凝胶溶解经皮贴剂的纤维素膜，并且溶解其中所包含的肉毒杆菌毒素。在将经皮贴剂贴在眉毛上大约1小时——这一时间足以使所述膜溶解并且溶解毒素——之后，将电极放置在经皮贴剂的外表面上。将接地电极连接在患者躯干上。让电流以0.5mA/cm2的强度通过所述电极5分钟时间。在停止2分钟之后，再次让电流通过所述电极5分钟时间。患者离开医生的诊所，并且被要求让经皮贴剂在原位保持大约4天时间。大约2天之后，患者注意到炎症的减轻，同时伴随着疼痛的减轻。到大约第7天，疼痛几乎完全消除。通过肉毒杆菌毒素所提供的缓解作用持续了大约4个月时间。
本文所披露的含有肉毒杆菌毒素的经皮组合物和给药所述组合物的方法具有很多好处和优点，包括以下优点1.可以明显减轻症状，如与神经元系统的机能亢进相关的症状，所述神经元系统与痉挛肌，炎症，或多汗症相关。
2.在皮肤上每使用一次神经毒素对症状的减轻可以持续大约2-大约5个月，并且在使用缓释组合物和经皮贴剂时可以持续大约1年-大约5年。
3.给药神经毒素表现出少有或没有从皮下部位扩散或转运走的倾向。
4.外部给药神经毒素少有或没有明显的不理想的副作用。
5.所述组合物的抑制作用可能产生以下积极的附加效果患者活动能力增强，态度更乐观，并且改善了生命质量。
6.可以用很长时间将大的治疗剂量的神经毒素输送到皮下目标组织，而又没有系统毒性。
尽管业已结合某些优选方法对本发明进行了详细说明，在本发明范围内的其他实施方案，形式，和改进是可行的。例如，可以将多种神经毒素有效地用于本发明的组合物和方法中。
在上面所提供的所有文献、文章、专利、专利申请和出版物，均全文引入。
因此，以下权利要求的构思和范围并不局限于上面所提供的对优选
权利要求
1.药用组合物，包括稳定化的肉毒杆菌毒素；和至少一种促进剂，用于通过增强患者皮肤的通透性，促进肉毒杆菌毒素向人类患者体内的经皮输送。
2.如权利要求1的组合物，其中，所述肉毒杆菌毒素选自下列一组A，B，C1，D，E，F和G型肉毒杆菌毒素。
3.如权利要求1的组合物，其中，所述肉毒杆菌毒素是A型肉毒杆菌毒素。
4.如权利要求1的组合物，其中，所述肉毒杆菌毒素是纯化的肉毒杆菌毒素。
5.如权利要求1的组合物，其中，所述组合物包括大约1个单位-大约20,000个单位的肉毒杆菌毒素。
6.如权利要求1的组合物，其中，所述组合物包括一定量的肉毒杆菌毒素，以便获得持续1个月至5年的治疗效果。
7.如权利要求1的组合物，其中，所述促进剂是醇。
8.如权利要求7的组合物，其中，所述醇是多元醇。
9.如权利要求1的组合物，其中，所述促进剂包括转化体。
10.如权利要求1的组合物，其中，所述组合物包括多种促进剂。
11.用于经皮贴剂中的药用组合物，所述药用组合物包括稳定化的肉毒杆菌毒素，它能穿透人类患者皮肤，而又不会大量渗透通过血管，当所述肉毒杆菌毒素与经皮贴剂中的促进剂相互作用时，导致了与来自细胞的分子的胞吐作用相关的疾病的治疗作用。
12.如权利要求11的组合物，其中，所述肉毒杆菌毒素是在将经皮贴剂贴在患者皮肤上之前以干燥状态提供在经皮贴剂中的。
13.如权利要求11的组合物，其中，所述肉毒杆菌毒素是A型肉毒杆菌毒素。
14.如权利要求11的组合物，其中，所述肉毒杆菌毒素是在将所述经皮贴剂贴在患者皮肤上之后与所述促进剂混合的。
15.如权利要求14的组合物，其中，所述肉毒杆菌毒素与促进剂混合，所述促进剂是在将所述经皮贴剂贴在患者皮肤上之前涂在患者皮肤上的。
16.一种经皮贴剂，包括药用组合物，该组合物包括稳定化的肉毒杆菌毒素；和促进剂，它能促进所述肉毒杆菌毒素以生物活性形式经皮给药到人类患者的皮下目标部位，而又不会使用到患者的循环系统中；和放置在经皮贴剂一侧的黏结剂，以便将所述经皮贴剂可除去地固定在患者皮肤上。
17.如权利要求16的经皮经皮贴剂，其中，所述黏结剂放置在装有所述药用组合物的贮库周围。
18.如权利要求16的经皮贴剂，它还包括从贴在皮肤上的所述经皮贴剂的一侧延伸出来的多个针头，其中，所述针头延伸通过所述经皮贴剂，以便穿透所述皮肤的角质层，而又不会破坏血管。
19.如权利要求18的经皮贴剂，其中，所述肉毒杆菌毒素是在所述经皮贴剂上的贮库中提供的，以便施加在所述经皮贴剂上的压力导致肉毒杆菌毒素定向通过所述针头和下面的角质层。
20.如权利要求16的经皮贴剂，所述肉毒杆菌毒素是以干燥状态提供在多个孔中的，每一个孔用可以通过流体溶解的膜覆盖，并且，其中，在所述覆盖孔的膜被充分溶解之后，所述促进剂与肉毒杆菌毒素混合，以便促进肉毒杆菌毒素的吸收。
21.如权利要求16的经皮贴剂，其中，所述肉毒杆菌毒素是A型肉毒杆菌毒素。
22.一种减弱患者皮下结构中神经递质释放的方法，该方法包括以下步骤(a)非化学破坏患者皮肤的角质层，以便降低所述角质层的不渗透性；和(b)将肉毒杆菌毒素涂在患者皮肤上步骤(a)中已破坏了其角质层的部位。
23.如权利要求22的方法，其中，所述角质层是通过摩擦去掉角质层破坏的。
24.如权利要求22的方法，其中，所述角质层是通过在患者皮肤上贴上粘性材料，并且将贴在皮肤上的粘性材料去掉破坏的。
25.如权利要求22的方法，其中，所述角质层是通过以不会对患者皮肤造成永久性伤害的强度施加频率为20kHz至低于10MHz的超声波方式破坏的。
26.如权利要求22的方法，其中，所述角质层是通过让电流从患者皮肤上的第一个点流向患者皮肤上的第二个点的方式破坏的。
27.如权利要求26的方法，其中，让所述电流通过，以便在角质层上产生多个孔，从而促进肉毒杆菌毒素向皮下结构输送。
28.如权利要求22的方法，其中，所述肉毒杆菌毒素选自下列一组A，B，C，D，E，F，和G型肉毒杆菌毒素。
29.如权利要求22的方法，其中，将所述肉毒杆菌毒素应用在含有促进剂的药用组合物中，以便促进所述肉毒杆菌毒素通过皮肤的输送。
30.如权利要求22的方法，其中，所述肉毒杆菌毒素被掺入转化体中。
31.一种缓解由痉挛肌导致的患者疼痛的方法，该方法包括以下步骤(a)对覆盖所述痉挛肌的患者皮肤施加频率为约10kHz-1MHz的超声波；和(b)将肉毒杆菌毒素涂在已接受了步骤(a)中的超声波处理的患者皮肤上。
32.如权利要求31的方法，还包括摩擦除去患者皮肤上接受了超声波处理的部分的角质层。
33.如权利要求31的方法，其中，所述肉毒杆菌毒素是A型肉毒杆菌毒素。
34.如权利要求31的方法，其中，所述肉毒杆菌毒素是以含有促进剂的组合物形式给药的，所述促进剂能促进肉毒杆菌毒素穿透患者皮肤。
35.如权利要求31的方法，其中，所述肉毒杆菌毒素在贴在患者皮肤上的经皮贴剂中施用。
全文摘要
用于给患者经皮给药神经毒素的药用组合物，该组合物包括诸如肉毒杆菌毒素的神经毒素，和促进剂，它能促进神经毒素通过患者皮肤的吸收，并且不会消除与神经毒素相关的生物活性。所述药用组合物通常涂在患者身体外部，并且可以在经皮贴剂中提供。
文档编号A61K38/00GK1668327SQ03816398
公开日2005年9月14日 申请日期2003年7月8日 优先权日2002年7月11日
发明者S·多诺万 申请人:阿勒根公司