专利名称：通过选择性诱导晶状体上皮细胞分离和/或死亡来预防后囊浑浊化的治疗溶液及方法
技术领域：
本发明涉及新的治疗溶液和方法，其包括单独或结合有其它试剂的离子转运机制干扰剂，其通过选择性诱导晶状体上皮细胞分离和/或细胞死亡用于预防后囊浑浊化，而不会损伤其它眼部细胞和组织，也不会有冗长的术前治疗。
背景技术：
人眼晶状体的突出作用在于聚焦已经通过角膜和房水进入到视网膜的光线。晶状体的结构和代谢有助于持久保持其完整性和透明度。晶状体完全由不同成熟阶段的上皮细胞组成，由于在成熟过程中组织从未被淘汰因此这是相对罕见的。随着新晶状体细胞的形成，晶状体内部的老细胞便被取代。晶状体很快从直接的供血处分离，这取决于营养和消除通路的水状体和玻璃体液。晶状体的光学特征多数依赖于保持恒定的细胞体积和填塞纤维的密度以减少胞间隙体积的晶状体细胞。因此，保持其精密的结构就成为晶状体的主要特征。晶状体已经通过调节其离子、糖、氨基酸和水的平衡而发展了其唯一的性能去保持恒定的细胞体积。
人眼白内障是由于晶状体透明度丧失而产生的光传播阻断。引起视觉模糊和浑浊的白内障目前是视力低下的最常见原因。浑浊的晶状体能通过手术过程除去，例如关节囊外白内障摘除术(ECCE)。ECCE包括用人工或自动化真空技术除去清除了内皮的临床神经核。后囊和赤道囊作为包膜或袋被完整地保留了下来，在其中嵌入了后房型人工晶状体。如果后囊和小带是完好无损的，那么该晶状体就将在病人的一生中被正常地保留而没有任何并发症。在手术期间，小心地打开晶状体囊的前部，并除去白内障。人工晶状体被嵌入到囊的残存(后)部分。这导致天然晶状体的调节作用丧失。
标准的白内障手术使用了已知的晶状体乳化法。该方法搅动了晶状体的内容物引起晶状体物质破裂，然后通过晶状体乳化探针被将其冲出晶状体囊，同时注入并取出洗涤液。被处理分离的死亡和存活晶状体上皮细胞都将被该冲洗作用洗掉。
一直在进行新治疗方法的开发，其包括前晶状体囊的固位和用可注射的物质取代晶状体内容物。
进行该手术后，视觉得到了恢复，但普遍白内障手术的一个最常见并发症是白内障术后晶状体上皮细胞(LECs)增生。后囊浑浊化(PCO)，也就是已知的继发性白内障，是外囊术后最常见的并发症，有约百分之二十到四十的患者会出现此并发症。在过去的十年中，一些实验性和临床研究结果已经对PCO发病机理给出了更好的理解。
PCO的主要原因是残留LECs向晶状体后囊增生和迁移。尽管外科医生已经小心地摘除了大部分残留晶状体上皮细胞，但是它们很难被除去。因此在手术结束时有许多LECs遗留在晶状体囊袋内。LECs增生使得隔膜或包膜进入放置人工晶状体的部位，并随时间的推移变得混浊。LECs增生在新白内障治疗例如利用可注射的晶状体中也是个主要问题。混浊膜被称为是“后白内障”或PCO。PCO的症状对那些白内障来说是完全相同的，其引起视力逐渐衰退如果不进行治疗最终将导致失明。
已经进行了很多努力去预防PCO或将其减到最低限度。这些努力能广义地分为三个领域手术改进、晶状体设计改进和化学预防。
已经开发了一些手术方案来试图预防PCO。这些包括使用各种手术器械以及应用激光、超声和冷冻技术。一旦出现PCO，那么YAG激光晶状体囊切开术便是一种简单、快速的方法，其中使用激光束在混浊囊中部形成开口。然而，YAG激光晶状体囊切开术极其危险。这主要包括视网膜脱落、青光眼、囊样粒状水肿的发展。
已经有许多努力集中在制造人工晶状体的材料类型上以及人工晶状体边缘的特性。
据报导双凸型和平凸型聚甲基丙烯酸酯以及硅酮板肝人工晶状体和带有尖锐光学边缘的晶状体对PCO有有益效果。Alcon’s Acrys晶状体已经在这个领域中取得了显著性进步。然而这些晶状体相对昂贵并且会引起并发症或受其自身的约束。
已有其它的尝试用化学试剂去摧毁或预防LECs增生。在2001年9月21日申请的英国专利申请0122807.1中，假设通过糖醛还原酶抑制剂调节山梨糖醇通路来降低细胞内山梨糖醇的浓度，就能通过渗透性休克诱导LECs死亡而预防PCO。然而，为了调节山梨糖醇通路，计划的治疗包括手术前预处理晶状体囊袋直至48小时，因此这就不容易并入到当前的白内障手术中。
其它的化学治疗也已经尝试过了。例如，使用LECs特异性免疫毒素结合抗体能降低但不能完全防止PCO发生。参见Clark等人，J.Cataract Refract.Surg.1998年12月；24(12)1614-20和Meacock等人，J.Cataract Refract.Surg.2000年5月；26(5)716-21。使用依地酸、胰蛋白酶和DISPASE(天然蛋白酶)也能用来分离LECs但却会损伤小带和周围组织。参见Nishi，J.Cataract Refract.Surg.1999年1月；25(1)106-17和Nishi等人，Ophthalmic Surg.1991年8月；22(8)444-50。已经用于检测预防PCO的其它试剂包括抑制晶状体上皮细胞迁移和增生的RGD肽；抗有丝分裂药，例如丝裂霉素C和5-氟尿嘧啶。参见Chung HS，Lim SJ，Kim HB.J Cataract RefractSurg.2000年10月；26(10)1537-42；Shin DH，Kim Y.Y.，Ren J.等人，Ophthalmology，1998；1051222-1226。
不幸的是，当使用有效剂量的上述化学试剂时，大部分试剂对包括眼部细胞例如角膜内皮细胞(CEDCs)和视网膜色素上皮细胞(RPECs)在内的周围眼部组织都显示出不能接受的毒性水平。
发明简述根据本发明，上述预防PCO的现有方法的不利之处已经被克服了。本发明通过迅速并选择性地诱导晶状体上皮细胞(LECs)分离和/或细胞死亡来预防PCO，而不会显著损伤其它眼部细胞和组织，其能毫不费力地并入到现存的标准白内障手术和未来有潜力的新型治疗中，并在白内障手术期间或之后很容易地除去残留晶状体上皮细胞。PCO的预防是通过应用治疗溶液或溶液得以实现。治疗溶液在白内障手术之前、期间或之后被应用或导入到晶状体囊袋中。治疗溶液包含离子转运机制干扰剂，其单独或与其它治疗剂例如渗透压剂(osmoticstress agent)和试剂一起建立适宜的pH，选择性地诱导晶状体上皮细胞分离和/或死亡，这样就预防了后囊混浊化。虽然离子转运机制干扰剂能干扰多种细胞的细胞机制和细胞离子分布，但选择干扰剂的浓度以使治疗溶液能选择性地干扰晶状体上皮细胞的细胞机制，而基本上不损伤其它眼部细胞。治疗溶液选择性地诱导了晶状体上皮细胞的细胞死亡和/或分离，而其它眼部细胞则基本上保持未损伤状态，并且没有冗长的术前预治疗。
可以在白内障手术前、期间或之后应用或导入的治疗溶液或溶液可以通过以下方式选择性地并快速地除去LECs(i)通过干扰正常细胞的功能诱导LECs从其基底或膜选择性的分离，引起最终的细胞死亡或至少能容易地除去LECs；(ii)通过干扰正常细胞的功能诱导LECs的选择性死亡；和/或(iii)通过干扰细胞功能诱导LECs对渗透压的敏感性，最终导致细胞分离和/或死亡。本发明容许使用能干扰多种细胞的离子转运机制来特异并唯一地靶向于LECs的化学治疗剂。
眼部治疗溶液和方法通过使用离子转运机制干扰剂来诱导比在其它眼部细胞发生率显著更高的LECs分离和/或死亡，来预防PCO。本发明的离子转运机制干扰剂能直接或间接地干扰调节通过LECs细胞膜的离子流和水流的胞内、胞外和/或胞间机制。这种干扰可以引起细胞皱缩和/或膨胀，导致细胞分离和/或死亡。选择试剂的浓度以使包括离子转运机制干扰剂的治疗溶液能引起晶状体上皮细胞显著分离和/或死亡，其不会引起大百分比的其它眼部细胞死亡和/或分离。更特别的是，离子转运机制干扰剂可以包括协同转运干扰剂、钠泵干扰剂、交换干扰剂或通道干扰剂。
离子转运机制干扰剂本身可以诱导LECs细胞分离和/或死亡，或可以致敏LECs，这样LECs就不能充分应答引起渗透压的其它试剂，选择性地分离和/或杀灭LEC并预防了PCO。这种其它试剂是一种渗透压剂，例如在LECs中诱导渗透性休克引起细胞分离和/或死亡的渗压剂。
本发明的治疗溶液具有适宜的pH，其根据特定渗透压的选择浓度来进行选择。溶液的pH能通过任意酸、碱或其它提高或降低溶液中氢离子浓度的试剂进行调节。
本发明的这些和其它优点以及新颖的特性，还有此处的细节，都将从以下的说明中得到更全面的理解。
几个附图视图的简述
图1是表明导入了包含不同浓度NaCl的溶液后不同眼部细胞(LECs、RPECs和CEDCs)的细胞生存能力图。
图2是表明在不存在(菱形)和存在(圆圈)30μM呋噻米、协同转运干扰剂的情况下，应用提高浓度的NaCl后LECs的细胞生存能力图。
图3是表明在不同pH水平下应用包含提高浓度NaCl的溶液后总LECs的细胞生存能力图。
图4是表明在不同pH水平下应用包含提高浓度NaCl的溶液后RPECs的细胞生存能力图。
图5是表明应用包含≤200mM NaCl、提高浓度的协同转运干扰剂、呋噻米和3μl 5N NaOH的治疗溶液后LECs和RPECs的细胞生存能力图。
图6是表明应用包含≤200mM NaCl、提高浓度的协同转运干扰剂、布美他尼和3μl 5N NaOH的治疗溶液后LECs、RPECs和CEDCs的细胞生存能力图。
图7是表明在洗涤后(A)零、(B)五和(C)十分钟时本发明治疗溶液对原代培养LECs治疗效果的三幅图片。
图8是表明在人器官培养PCO模型中在(A)处理前、(B)处理五分钟后、(C)处理十分钟后和(D)洗涤后本发明治疗溶液对原代LECs治疗效果的四幅图片。
图9是表明使用包含≤200mM NaCl、90μM呋噻米和3μl 5NNaOH的治疗溶液在治疗后(A)零、(B)五和(C)十分钟以及(D)洗涤后对RPECs治疗效果的四幅图片。
图10是表明应用包含≤200mM NaCl、90μM呋噻米和3μl 5NNaOH的治疗溶液后LECs、RPECs和CEDCs的细胞生存能力图。
发明详述当用一个或多个优选实施方案描述本发明时，其将被理解为本发明不限于那些实施方案。反之，本发明包括所有的替换、改进和等同物，其同样可以包括在本说明书结尾部分的权利要求的实质和范围内。
本发明通过单独或与其它试剂一起应用的离子转运机制干扰剂快速并选择性地诱导晶状体上皮细胞从晶状体囊分离和/或死亡来预防PCO，而基本上不会损伤其它眼部细胞和组织，且没有冗长的术前治疗。该选择性分离和/或死亡可以发生在特异的天然LECs，这使其区别于其它眼部细胞。结果是，在使用的试剂剂量和浓度上，LECs被从晶状体分离、杀灭和/或除去，同时其它眼部细胞和组织则没有受到损伤。
在热力学平衡中水能有效地穿过人细胞的质膜。由于实际上所有人细胞的细胞膜都能高度渗透水，因此细胞体积就由渗透活性溶质(电解质和渗压剂)的细胞内容物以及细胞外液的摩尔渗透压浓度和/或张力来确定。通常，胞内和胞外的张力是相同的；在生理条件下，多数哺乳动物细胞都没有暴露在大范围的张力中。体液的摩尔渗透压浓度一般为约285mOsm/kg H2O，其能通过体液内稳态在非常窄的限度内(±3％)进行调节。然而在病理状况下，会出现体液内稳态紊乱。已经发现浆液摩尔渗透压浓度在约220mOsm/kg H2O到约350mOsm/kgH2O范围内。在这些极端的情况下，在不存在调节体积的机制中，身体细胞能分别膨胀和皱缩百分之二十到三十。
和其它细胞一样，晶状体上皮细胞利用细胞体积调节过程来防御胞外摩尔渗透压浓度的变化并保持稳定的细胞体积。先前已经记载了晶状体上皮、纤维和睫状上皮细胞的体积调节机制。参见例如C.W.McLaughlin等人，Amer.J.Phsiol.Cell Physiol.2001年9月；281(3)C865-75；J.J.Zhang等人，Exp.Physiol.1997年3月82(2)245-59；J.J.Zhang等人，Exp.Physiol.1994年9月79(5)741-53；J.J.Zhang等人，J.Physiol.1997年3月1；499(Pt.2)379-89。渗透干扰后，紧接着出现体积调节阶段，其中细胞易于转变为其在等渗介质中的体积。细胞体积的变化激活了特定的代谢和膜转运通道，这导致了渗透活性溶质净堆积或损失。调节体积减小(RVD)是用于减少或保持应答低胞外渗透压或张力的细胞体积的过程。调节体积增加(RVI)是用于提高或保持应答高胞外渗透压或张力的细胞体积的过程。当细胞溶质含量(例如胞内张力)或胞外张力改变时，则出现迅速的跨膜水流以恢复平衡。由于质膜是非常复杂的，因此水流会引起细胞膨胀或皱缩。
细胞改变其胞内离子浓度以建立平衡的一种方法是通过使用位于细胞表面的离子转运机制。这些机制推动离子进或出入细胞，改变胞内的离子强度，结果改变了渗透压。例如，在各类细胞的RVD期间激活的离子转运机制包括传导K+和Cl-的通道(分别传导K+和Cl-转运通路)、K+-Cl-协同转运和功能性偶联的K+-H+以及Cl--HCO3-交换。在各类细胞的RVI期间激活的离子转运机制包括Na+-K+-2Cl-协同转运和功能性偶联的Na+-H+和Cl--HCO3-交换。
在天然的不同细胞类型和离子转运机制的反应中存在令人惊奇的多样性。参见Hoffmann and Simonsen，Physiol Rev.1989年4月；69(2)315-82。例如，细胞有一些特定的没有经历RVD和RVI的体积调定点。不同的细胞具有不同的开启或关闭特定转运机制的体积调定点。参见Parker，J.C Am J Physiol.1993，265C1191-1200；Parker JC等人J Gen Physiol.1995年6月；105(6)677-99。晶状体细胞关闭其RVI和RVD过程的调定点或阈值与其它的眼部细胞不同。细胞的形状和整联蛋白与胞外基质的相互作用在决定细胞分离、存活或在粘附细胞内诱导程序性细胞死亡中是至关重要的。这使LECs与眼部和身体的其它细胞得以区分。
干扰晶状体上皮细胞的离子转运机制防止了这些细胞充分应答低渗或高渗的胞外环境或其它的细胞应激。细胞对这些应激的应答失败触发了即刻或最终的细胞分离和/或细胞死亡。
不能或表现出不能应答应激的晶状体上皮细胞可以具有一些应答。一个应答就是细胞死亡。另一个可能的应答是细胞从基底或膜下面分离。例如，细胞可以皱缩这样细胞便不能再保持其对基底的粘附，这可能与细胞骨架的重排有关。细胞皱缩也可以触发粘附细胞重新排列其局部粘连连接和附着这些连接的细胞骨架。分离最终导致细胞死亡和/或能容易地除去细胞。细胞死亡可以导致细胞从周围细胞和细胞外基质(ECM)中分离，可以出现细胞分离而没有即刻的细胞死亡。例如，胞外基质连接破裂已经显示出能诱导失巢凋亡，一种由细胞从其所属(substation)细胞中分离而诱导的凋亡形式。晶状体上皮细胞的另一种可能的应答是弱化或致敏细胞，这样细胞就变得易受渗透压或休克的攻击。例如，一旦细胞被致敏，那么其就表现出不能正确应答渗透性休克或应激，这样引入休克或应激物来致敏细胞就能引起分离和/或细胞死亡。本发明的治疗溶液和方法通过选择性地并快速地引起至少一种对LECs的应答来预防PCO，而剩下的其它眼部细胞则基本上没有受到损伤。
一方面，本发明的眼部治疗溶液和方法通过离子转运机制干扰剂基本上诱导比对其它眼部细胞例如角膜内皮细胞(CEDCs)和视网膜色素上皮细胞(RPECs)发生率更高的LECs从其基底或膜分离和/或细胞死亡来预防PCO。因此，本发明的显著优势就是用本发明的试剂进行治疗通过从晶状体囊袋上除去大部分LECs来预防PCO，而其它眼部细胞和组织则没有明显损伤。
离子转运机制干扰剂是一种能直接或间接干扰调节离子流和水流穿过或进入晶状体上皮细胞细胞膜的胞内、胞外和/或胞间机制的试剂。离子转运机制干扰剂干扰了正常细胞离子的分布机制，从而干扰了细胞的功能。单独或与其它试剂一起使用的本发明离子转运机制干扰剂扰乱了正常LEC细胞的离子分布，因此选择性地直接或间接诱导了LEC分离和/或死亡以预防PCO。选择试剂的浓度以使治疗溶液能干扰引起LECs分离和/或死亡的LECs离子转运机制，而基本上不会干扰其它眼部细胞的离子转运机制。当LECs可以由于细胞分离和/或死亡而毫不费力地从晶状体囊袋上除去时，其它眼部细胞则基本上没有受到损伤。
离子转运机制干扰剂能在LEC中干扰一种或多种下列细胞机制(1)协同转运机制(例如K+-Cl-协同转运、Na+-Cl-协同转运、Na+-K+-2Cl-协同转运和氨基酸转运)；(2)钠泵；(3)离子交换(例如功能性偶联的Na+-H+和Cl--HCO3-交换；功能性偶联的K+-H+和Cl--HCO3-交换、Cl--Cl-交换、Ca2+-Na+交换)；和(4)离子通道(例如钾通道、氯通道、体积-敏感的有机渗压剂和阴离子通道(VSOAC)以及其它的阴离子通道)。离子转运机制干扰剂可以直接或间接激活或抑制这些细胞机制。
在低张介质中，脊椎动物的细胞最初能由于渗透水平衡而膨胀，而随后通过净损失KCl和伴随的细胞水份损失来调节其体积以恢复正常的细胞体积。细胞膨胀激活了转运通路，这导致了钾、氯和有机渗压剂的净流出。在各种类型细胞的RVD期间被激活的离子转运机制包括传导性K+和Cl-通道(分别传导K+和Cl-转运通路)、K+-Cl-协同转运和功能性偶联的K+-H+和Cl--HCO3-交换。例如，钾和氯最初通过激活K+和Cl-协同转运或分别激活钾和阴离子通道而从细胞中流失。
相反，在高张介质中，脊椎动物的细胞由于渗透水平衡而皱缩，而随后通过净获得KCl和伴随的细胞水份摄取来调节其体积以恢复正常的细胞体积。细胞皱缩激活了转运通路，这导致了氯、钠和钾的净流入。在各种类型细胞的RVI期间被激活的离子转运机制包括Na+-Cl-或Na+-K+-2Cl-协同转运和功能性偶联的Na+-H+和Cl--HCO3-交换。
离子转运机制干扰剂的实例包括但不限于N-乙基顺丁烯二酰亚胺缬氨霉素短杆菌肽儿茶酚胺类钙离子载体A23187(包括例如离子载体A23187加钙)钙调蛋白匹莫齐特袢利尿剂(例如呋噻米、布美他尼、依地尼酸、吡咯他尼、托拉塞米)阿米洛利二-异硫氰基-二磺酰基茋(DIDS)星孢素(SITS)尼氟灭酸茋衍生物(例如4，4’-二硝基茋-2，2’-二磺酸)奎宁细胞松弛素B一般而言，离子转运机制干扰剂有四类(1)协同转运干扰剂；(2)钠泵干扰剂；(3)交换干扰剂；和(4)通道干扰剂。如以下所反映的，我们能够理解离子转运机制干扰剂可以是一种或多种前述四类干扰剂。
协同转运干扰剂是一种能直接或间接干扰细胞协同转运机制的试剂。更特别的是，协同转运干扰剂激活或抑制了LEC的协同转运机制。选择协同转运干扰剂的浓度以使治疗溶液能基本上诱导与其它眼部细胞相比发生率更高的LECs分离和/或死亡。协同转运机制的实例包括K+-Cl-或Na+-K+-2Cl-协同转运。协同转运干扰剂的实例包括N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)(包括例如N-乙基顺丁烯二酰亚胺加铷)碘乙酰胺呋噻米(也就是已知的速尿)布美他尼水银(Hg2+)和能激活或抑制晶状体上皮细胞协同转运机制的任何其它试剂。
钠泵干扰剂是一种能直接或间接干扰已知的钠泵、细胞机制-Na/K/ATP酶泵的试剂。更特别的是，钠泵干扰剂能激活或抑制LEC的Na/K/ATP酶泵。例如，LECs包含不被渗透的阴离子大分子，由扩散离子和水的进入(Gibbis-Donnan平衡)而产生的胶体渗透膨胀则通过以与消耗渗漏进入速率相等的速率排出离子的离子排出泵而被不断地中和。选择钠泵干扰剂的浓度以使治疗溶液能基本上诱导与其它眼部细胞相比发生率更高的LECs分离和/或死亡。钠泵干扰剂的实例包括乌本苷和能激活或抑制晶状体上皮细胞钠泵的任何其它试剂。
而另一类离子交换机制干扰剂是一种交换干扰剂。交换干扰剂是一种能直接或间接干扰细胞离子交换的试剂。更特别的是，交换干扰剂能激活或抑制LEC的离子交换机制，其不仅能导致胞内和胞外离子重新分布，而且还可以改变胞内pH。离子交换机制的实例包括K+-H-和Cl--HCO3-交换和与Cl--HCO3-交换功能性偶联的Na+-H+-交换。例如，任何能通过激活LEC的K+-H-和Cl--HCO3-交换来诱导钾和氯损失的刺激物都是交换干扰剂。交换干扰剂的实例包括星孢素(SITS)阿米洛利二-异硫氰基-二磺酰基茋(DIDS)钙调蛋白(CaM)铜(Cu2+)氢(H+)和能激活或抑制晶状体上皮细胞交换通道的任何其它试剂。
通道干扰剂是一种能直接或间接干扰细胞离子通道的试剂。更特别的是，通道干扰剂能激活或抑制LEC的离子通道。离子通道的实例包括钾、氯和VSOAC转运通路。例如，任何能通过激活钾和氯通道来诱导氯化钾和有机渗压剂损失的刺激物都是通道干扰剂。选择通道干扰剂的浓度以使治疗溶液能基本上诱导与其它眼部细胞相比发生率更高的LECs分离和/或死亡。通道干扰剂的实例包括酮康唑(KETO)5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸(NPPB)1，9，-二去氧弗司扣林(DDF)他莫昔芬维拉帕米奎宁钡(Ba2+)二苯胺-2-羧酸盐(DPC)蒽-9-羧酸indocrinone(MK-196)匹莫齐特和能激活或抑制晶状体上皮细胞离子通道的任何其它试剂。
使用本发明的试剂，选择试剂或试剂们的浓度以使应用治疗溶液能导致LEC细胞的生存能力优选小于约百分之十，更优选小于约百分之五，更加优选接近于百分之零。其它眼部细胞例如RPECs和CEDCs的预期细胞生存能力优选大于约百分之七十，更优选约百分之九十，更加优选接近于百分之百。
在这些情况下，包含试剂的治疗溶液，可能与其它试剂一起使用，选择性地诱导了LECs的分离和/或死亡，并基本上诱导了与其它眼部细胞相比发生率更高的LECs分离和/或死亡。如实施例所示，细胞的分离和/或死亡可以通过观察已经被漂洗、洗涤或用任何搅动方式以使可以去除分离和/或死亡LECs的之前或之后的细胞面积来证实。
本发明的上述试剂(此后指主剂)单独或与其它下述附加剂或其它试剂和/或化学物质一起，选择性地直接或间接诱导了LEC分离和/或死亡。例如，除主剂之外，本发明的眼部治疗溶液和方法可以包含渗透压剂，其中溶液基本上诱导了与角膜内皮细胞和视网膜色素上皮细胞相比发生率更高的晶状体上皮细胞的细胞分离和/或死亡，以预防后囊浑浊化。
渗透压剂是一种能在LEC中诱导渗透性休克的试剂。LEC中的渗透性休克可以通过能改变正常胞内和胞外离子平衡的任何细胞状况而引起。例如，胞外渗透活性溶质浓度的改变和影响包括细胞体积调控(例如激素、生长因子和其它外部刺激物、细胞膜电位和细胞质第二信使)在内的特定离子转运系统的各种刺激物都可以诱导渗透性休克。大量的跨胞离子流出可以使细胞体积的内稳定休克。低渗透压能通过将细胞暴露于低渗溶液或具有低渗摩尔渗透压浓度的溶液中而引起。相反地，高渗透压能通过将细胞暴露于高渗溶液或具有高渗摩尔渗透压浓度的溶液中而引起。渗透活性离子和有机溶质的细胞浓度升高或降低也可以使细胞体积调节休克，并激活包括RVD或RVI应答在内的膜转运过程。
应用或导入渗透压剂是适合的，其中主剂使LEC对渗透性休克(例如通过抑制离子转运机制引起)敏感，其中渗透压剂本身能诱导细胞分离和/或死亡。例如，如果离子转运机制干扰剂抑制了基本的离子转运机制例如钠-钾泵，那么LEC自身就不能防御外部渗透压或休克，因此提高了其对由附加渗透压剂引起的胞外渗透压。LECs应答渗透压或休克的失败可以通过激活死亡-信号传导过程来引发细胞死亡。
然而，我们能够理解主剂也可以是渗透压剂，这样主剂可以选择性地干扰LECs的离子转运机制并诱导渗透性休克。
更特别的是，渗透压剂具有高渗或低渗摩尔渗透压浓度。低渗溶液是一种具有比在正常生理状况下发现的溶质溶度低的溶液；高渗溶液是一种具有比在正常生理状况下发现的溶质溶度高的溶液。换句话说，渗透压剂产生了胞外高张性和低张性。
任何生理上能耐受的电介质和渗压剂，任何促成渗透强度的溶质都是诱导渗透压或休克的适宜物质。渗压剂的实例包括盐(例如NaCl)氨基酸(例如氨基乙磺酸、甘氨酸和丙氨酸)糖(例如甘露醇、肌醇、甜菜碱、甘油磷酰胆碱、甜菜碱、尿素、蔗糖和葡萄糖)和任意其它的有机或无机渗压剂。
应注意，虽然渗压剂可以如上所述是氯化钠，但是氯化物可以被碘化物、溴化物、硝酸盐、硫氰酸盐、氟化物、硫酸盐、羟乙磺酸盐、葡糖酸盐和任何其它可接受的替代品代替；同样的，钠可以被钾、铯、铷、锂、钫和任何其它可接受的替代品代替。
渗透压剂和主剂可以分别、同时或相继应用在PCO治疗中。
治疗溶液可以优选具有约5到11的pH，这取决于使用的试剂和浓度。在一个优选的实施方案中，包含约±200mM NaCl的治疗溶液具有优选在约8到10范围内的pH。治疗溶液的pH可以通过改变主剂或渗透压剂的浓度或通过导入改变pH的附加化学试剂进行调节。pH能通过任何酸或碱或能提高或降低氢离子浓度的任何试剂进行调节。
治疗将与主剂的浓度范围、渗透压剂和pH调节剂共同起作用。根据本发明，选择适宜的试剂浓度以使能干扰大部分细胞机制的试剂选择性地干扰LECs的离子交换机制，从而引起LEC分离和/或死亡。应用治疗溶液能导致大百分比的LECs分离和/或被杀灭，同时使较低百分比的其它眼部细胞受到损伤。在浓度范围的一个末端，治疗溶液的功效被降低，导致长时间地杀灭LEC细胞。在范围的另一个末端，药剂则倾向于损伤其它眼部细胞。应该选择适宜的主剂、渗透压剂和pH调节剂的溶度以使PCO可以通过LECs的选择性细胞死亡和/或分离得以预防，而不会显著损伤其它眼部细胞和眼部组织。优选的是，应该选择试剂或试剂们的浓度以使在应用时，LECs的细胞生存能力小于约百分之十，更优选小于约百分之五，更加优选接近百分之零，其它眼部细胞例如REECs和CEDCs的细胞生存能力大于约百分之七十，更优选大于约百分之九十，更加优选接近百分之百。
上述被引入的试剂和浓度是相互关联的。例如，高pH的治疗溶液将会杀死低摩尔渗透压浓度水平的LECs。在以下实施例中提供了特定试剂适宜浓度的实例。此外，调节浓度以满足主要白内障手术技术的特定需要和患者的需要。
本发明的治疗溶液可以在白内障手术前、期间或之后给予以预防PCO。打开晶状体囊的前部，除去白内障。然后可以在囊的后部嵌入眼内晶状体。或者是，可以用可注射的眼内晶状体取代晶状体核。剩余的LECs可以或不可以用真空或其它手术技术除去。可以使用晶状体乳化法、激光或其它技术除去晶状体内容物。治疗溶液可以在这个过程前、期间或之后的任何时间局部应用或导入。然后可以对眼部区域进行洗涤以除去残留细胞。
如上所述，治疗溶液可以包含主剂、渗透压剂和用于调节溶液pH的任何化学试剂。或者是，包含主剂、渗透压剂和/或调节pH的其它化学试剂的独立溶液可以相继或同时应用或导入以防止PCO。如上所述，主剂也可以是渗透压剂。溶液可以通过注射器、滴管、用于晶状体乳化法的探针或任何适宜或方便使用的其它方式施用。
本发明的其它优点在于治疗溶液能诱导晶状体上皮细胞相对快速地分离和/或死亡，这样本发明的治疗溶液就能不费力地并入到白内障手术中。晶状体上皮细胞的分离可以在应用本发明溶液或试剂约三十分钟内发生，细胞死亡在几小时内发生。优选的是，分离出现在应用约十五分钟内，但这取决于选择的浓度和试剂。
不论是本发明的治疗溶液和方法具有与其它眼部细胞相比发生率更高的LECs细胞分离和/或死亡，还是这种治疗的选择都可以在确定治疗或任何其它可接受的方法以后，通过细胞生存能力比较实验来确定。更特别的是，治疗溶液和方法应该能预防PCO，而仅对其它所述眼部细胞引起最小的生理损害。优选的是，应该选择试剂或试剂们的浓度这样在应用时，LECs的细胞生存能力就小于约百分之十，其它眼部细胞例如RPECs和CEDCs的细胞生存能力就大于约百分之七十。我们能够理解，治疗溶液可以包含附加剂、化学物质、蛋白质和/或物质，可以包含多于一种主剂或渗透压剂。可以加入附加的化学和生物成分以改进治疗溶液的性质，例如生理耐受性、粘度或贮存能力。
治疗溶液可以包裹在药盒或其它包装中或作为单一溶液贮存或，如上所述，贮存在以后使用的单独溶液中。例如，药盒或包装可以包括与包含渗透压剂的溶液分别包装的包含离子转运机制干扰剂的溶液。此外，治疗溶液可以包裹在包含晶状体乳化期间使用的液体的药盒或包装中，或包裹在用于在注射可注射的人工晶状体前除去晶状体内容物的药盒中。
实施例对比实施例1如下所述，将生长于96孔平底板中的LECs、CEDCs和RPECs铺满单层置于不同浓度的NaCl(作为渗压剂)溶液中。在各个孔中分别加入200μl浓度为137mM、170mM、340mM、680mM、1360mM和2000mM的NaCl溶液(按照以下的描述制备)。溶液的pH为8.0±0.4。NaCl的浓度分别相当于约285到4000mOsm/L的最终摩尔渗透压浓度。加入高张NaCl后约五到十分钟内，一些LECs开始以剂量依赖的方式皱缩、聚集并失去对单层的粘附。CEDCs和RPECs中没有明显发现这种作用。
图1显示了应答提高高渗NaCl的LECs、CEDCs和RPECs细胞生存能力(LECs以淡灰菱形显示，RPECs以深灰方形表示，CEDCs以黑菱形表示)。每个点都表示两组实验的平均值。在约1380mM NaCl的高张压力中，有约百分之四十的LECs存活，而大于百分之八十的CEDCs和RPECs存活，这证明了这些细胞间不同的渗透耐受性。
培养人晶状体上皮细胞、人角膜内皮细胞和人视网膜色素上皮细胞的主要和第一通路。使用标准的细胞分离和酶消化技术从死后的眼部分离LECs、CEDCs和RPECs。参见Uebersax ED，Grindstaff RD andDefoe DM Exp Eye Res.2000年3月；70(3)381-90；Wagner LM，Saleh SM，Boyle DJ，and Takemoto DJ.Mol Vis.2002年3月14日；859-66；Cammarata PR，Schafer G，Chen SW，Guo Z和Reeves RE.InvestOphthalmol Vis Sci.2002年2月；43(2)425-33；Rakic JM，Galand A和Vrensen GF.Exp Eye Res.2000年11月；71(5)489-94。在Eagle’s极限必须培养基(MEM)中培养LECs和CEDCs。在补有2mM谷酰胺，25mmol/L Hepes，pH 7.4，10U/mL青霉素和10μg/mL链霉素和15％热灭活胎牛血清(FCS)的Ham’s F10培养基中培养RPECs。在96孔平底盘中以104细胞/孔，对原代培养的LECs、CEDCs和RPECs进行传代培养直至它们达到90％到100％的铺满。这些细胞在带有5％CO2潮湿空气的孵育器中于37℃生长至铺满。实验前这些细胞整晚都保持铺满状态。
首先通过向500ml dH2O中加入58.44克NaCl形成2M NaCl休克溶液来制备NaCl高渗溶液(NaCl由Sigma Chemical co，Dorset，England提供)。然后通过用蒸馏水(dH2O)稀释2M休克溶液制成预期浓度的渗透NaCl溶液。例如，用dH2O以1到10.1的比率稀释2M休克溶液以形成170Mm NaCl高渗溶液，用dH2O以1到4.56的比率稀释2M NaCl休克溶液以形成340Mm NaCl高渗溶液。最终的摩尔渗透压浓度(mOsm/kg/H2O)通过使用Cryoscopic Osmometry的降冰点法进行测定。
治疗后，彻底洗涤被处理的细胞，在评定细胞的生存能力前用新鲜介质培养十二个小时。暴露12-24小时后通过MTT测定法来测定这些细胞在指示的高张压力下的生存能力。
MTT测定法是一种测定线粒体功能的方法，按照Mosmann(Mosmann，T.J Immunol Methods.1983年12月16；65(1-2)55-63记载的方法进行。在磷酸盐的平衡盐(PBS)中溶解四唑盐3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT；由Sigma ChemicalC.提供)成5mg/ml，并通过0.22μm微孔滤膜灭菌。将MTT休克溶液以1到10的比率加入到生长介质中。用该生长介质孵育细胞三到四小时。在加入MTT时是活的细胞中，线粒体脱氢酶将四唑环裂解成了深蓝甲反应产物，其在细胞内构建。在亮视野显微镜下观察MTT-反应培养基，无需其它过程。如果各个孔的细胞完全被反应产物填充(在是非粘附细胞的情况下)或者包含许多从多个灶发出的甲晶体(在是粘附或散布细胞的情况下)，那么就评为MTT-阳性。然后用二甲亚砜(DMSO)溶解与MTT反应培养基，在微板读取器中读数以获得细胞生存能力的测量值。确定在特定浓度下每孔的活细胞数，并以总细胞的百分比表示(示于图1中)。
实施例2用Hank’s平衡盐溶液(HBSS)洗涤LECs铺满单层三次以在实验前除去FCS。和实施例1一样，在96孔板培盘中制备LECs。将这些细胞暴露在200μl/孔的治疗溶液内五到十分钟，其中溶液包含提高浓度(～135mM、～170mM、～340mM、～680mM、～1360mM和～2000mM)的NaCl(作为渗压剂)，其中存在和不存在30μM呋噻米(协同转运干扰剂，离子转运机制干扰剂)。治疗溶液的pH为8.0±0.4。治疗后，彻底洗涤被处理的细胞，并在新鲜介质中进行培养。和实施例1的记载一样，在处理12-24小时后通过MTT测定法来确定被处理LECs的生存能力。
进行该治疗后，和在对比实施例1中观察到的一样，在存在呋噻米的情况下也出现了同样的细胞皱缩和分离现象，但是变化更加显著。图2显示了在不存在呋噻米(以菱形表示)的情况下，用1380mMNaCl快速高张休克后，有约40％的LECs存活。然而，用呋噻米(以圆圈表示)抑制协同转运机制后，LECs的渗透耐受性显著降低，用340mM NaCl快速高张休克后，几乎没有细胞存活。这个结果显示了从用不存在呋噻米的2000mM NaCl进行高张休克变到用存在呋噻米的170mM NaCl进行高张休克后，LECs的生存能力。
每个点都用三组实验的平均值±标准偏差(S.D)表示。先将20mg呋噻米溶解在100μl DMSO中制成30.3mM呋噻米休克溶液，以确保其溶解，然后加入到1.9ml预期浓度的高渗NaCl中。然后将5μL呋噻米休克溶液加入到5ml预期浓度的NaCl溶液中，以得到30μM呋噻米(按照对比实施例1的记载制备)。
对比实施例3本实施例描述了pH对LECs渗透存活的影响。按照对比实施例1的记载制备LECs铺满单层。对照组细胞暴露于pH为7.4±0.3，包含135mM生理NaCl的溶液中。不同组细胞暴露在200μl/孔，具有不同pH(8.0±0.4、8.4±0.5、8.9±0.8和10.6±0.5)包含增加浓度的NaCl(～170mM和～340mM)溶液内十分钟。
在10ml选定的高渗NaCl溶液中(按照实施例1的记载制备)直接加入0、1、3或5μl 5N NaOH休克溶液来调节溶液的pH。用专业pH尺确定相应的最终pH。10ml不加NaOH的NaCl溶液的最终pH读数为约8.0±0.4。具有1μl 5N NaOH的10ml NaCl溶液的最终pH读数为约8.4±0.5。具有3μl 5N NaOH的10ml NaCl溶液的最终pH读数为约8.9±0.8。具有5μl 5N NaOH的10ml NaCl溶液的最终pH读数为约10.6±0.5。
如实施例1的记载，通过MTT测定法12-24小时后处理来确定被处理细胞的细胞生存能力。图3描述了应用溶液后LECs的细胞生存能力。如图所示，灰条代表LECs暴露在135mM生理NaCl中的对照组。黑和白条代表分别暴露在pH渐增的170mM NaCl和340mM NaCl中的LECs。如图所示，LECs对高张压力的敏感性随pH的升高和NaCl溶度的升高而增加。在pH为约10.6±0.5时，有约大于百分之七十的LECs在五分钟内破裂和死亡。在pH为约8.9±0.8时，LECs从其基底有效地分离但没有明显破裂。
对比实施例4本实施例说明了胞外pH对RPECs渗透存活的影响。按照实施例1的记载制备RPECs铺满单层。这些细胞暴露在200μl/孔，具有不同pH(8.0±0.4和0.6±0.5)包含渐增浓度NaCl的溶液(137mM、170mM、340mM、680mM、1360mM和2000mM)内十分钟。按照实施例1的记载制备NaCl溶液。如实施例3的记载，加入1μl和5μl 5N NaCl来调节溶液的pH。
如实施例1的记载，通过MTT测定法12-24小时后处理来确定被处理细胞的细胞生存能力。图4描述了应用溶液后RPECs的细胞生存能力(菱形表示pH为8.4±0.5，圆圈表示pH为10.6±0.5)。每个点都表示三组实验的平均值±标准偏差。如图所示，当pH水平升高时，暴露在高张NaCl中的RPECs存活水平显著提高。
实施例5按照实施例1的记载制备LECs和RPECs铺满单层。将这些细胞暴露在200μl/孔的治疗溶液里十分钟，其中溶液包含(i)≤200mM高渗NaCl；(ii)浓度渐增(10μM、30μM、60μM、90μm和120μM)的协同转运干扰剂，呋噻米和(iii)3μl 5N NaOH。
按照实施例2的记载，通过用≤200mM的高渗NaCl溶液(按照实施例1的记载制备)稀释呋噻米休克溶液来制备包含呋噻米的治疗溶液。例如，将10μL呋噻米休克溶液加到5mL高渗NaCl溶液中以获得具有60μM呋噻米的高渗NaCl溶液。用3μl 5N NaOH调节溶液的pH。
如实施例1的记载，通过MTT测定法12到24小时后处理来确定被处理细胞的细胞生存能力。图5描述了LECs(圆圈)和RPECs(菱形)的细胞生存能力。每个点都代表六组HLECs实验和四组HRPECs实验的平均值±标准误差(s.e.m)。如图所示，在10μM呋噻米中，有大于50％的皱缩LECs损失或死亡。在30μM到120μM呋噻米之间，有约＞90％的LECs被除去或杀灭。另一方面，在30μM到90μM呋噻米之间，有少数RPECs被除去或杀灭。因此，例如在这个pH下，在约200mM高渗NaCl溶液中，约15μM到约100μM是有效溶度，其中RPECs没有明显损伤。
实施例6按照实施例1的记载制备LECs、CEDCs和RPECs铺满单层。将这些细胞暴露在200μl/孔的治疗溶液里十分钟，其中溶液包含(i)≤200mM高渗NaCl；(ii)浓度渐增(14μM、28μM、56μM、112μm和224μM)的布美他尼，协同转运干扰剂和(iii)3μl 5N NaOH。
按照以下记载制备包含布美他尼的治疗溶液。制备1.4M布美他尼休克溶液。然后用1mL高渗NaCl溶液(按照实施例1的记载制备)稀释1μL 1.4M的布美他尼溶液以制成14mM的布美他尼第二休克溶液。用NaCl溶液稀释14mM布美他尼休克溶液，以此获得布美他尼的最终预期浓度，分别得到了约0μM(对照)14μM、28μM、56μM、112μM和224μM的浓度。用3μl 5N NaOH调节溶液的pH。
如实施例1的记载，通过MTT测定法12到24小时后处理来确定被处理细胞的细胞生存能力。图6描述了LECs(圆圈)、RPECs(菱形)和CEDCs(方块)的细胞生存能力。每个点都分别表示六组LECs实验和三组RPECs和CEDCs实验的平均值±s.e.m。如图所示，在28μM、112μM和224μM布美他尼中，在相差显微镜观测下，几乎所有的LECs都皱缩、分离和/或死亡，洗涤后几乎没有细胞残留。几乎100％的细胞都显示了MTT负性应答。另一方面，在这些同样的浓度下，有约小于20％RPECs和30％CEDCs被杀灭或除去。因此，对这些特定的治疗溶液来说，28μM、112μM和224μM布美他尼是合适的治疗浓度。
实施例7按照实施例1的记载制备LECs铺满单层，并在玻璃盖玻片上生长，以此代替96孔平底培养盘。然后彻底洗涤LECs以除去血清。
在35mm深的培养皿中制备十毫升(10mL)包含≤200mMNaCl、90μM布美他尼和3μl 5N NaOH的治疗溶液。
然后将盖玻片转移到包含治疗溶液的培养皿中，在治疗溶液中保留五到十分钟。然后倒出治疗溶液，使用吸入/冲洗探针用具有微弱压力的新鲜HBSS溶液彻底清洗带有分离LECs的盖玻片。用反相相差显微镜立即检测并照像后，将LECs在带有新鲜介质的培养基中保存几天以检测是否有任何残留细胞存活。
图7描述了由反相相差显微镜获得的LECs图像及其在处理期间的渗透应答。照片7A描述了在零分钟时，覆盖了整个区域的铺满LECs。照片7B描述了在处理五分钟后时，聚集和从其基底分离的LECs。照片7C描述了在处理十分钟后和洗涤后，在洗净细胞后基本上清澈的基底。
实施例8为了评定在接近体内的环境中的治疗效果，我们使用了晶状体器官培养PCO模型(模型最初由Liu等人研制(Liu CS，Wormstone IM，Duncan G，Marcantonio JM，Webb SF，Davies，PD.Invest OphthalmolVis Sci.1996年4月；37(5)906-14))。从提供的眼睛上(年龄在19到89岁之间)分离人晶状体，然后粘在定做的不锈钢台上。在手术显微镜下，使用连续曲线撕囊术小心地在晶状体囊100的前部开直径约为6mm的口。然后用HBSS水表达(hydroexpressed)晶状体核，小心除去残留的晶状体纤维。后囊200和赤道囊300作为包膜(袋)被完整地保留下来，贮存在塑料培养盘中(深35mm的培养皿)，用补有10％到15％FCS的Eagle’s极限必需培养基(MEM)覆盖。然后人LECs在器官培养模型中过四到五天以恢复手术创伤。
建立两组器官培养PCO模型。建立作为对照的第一组十个晶状体，保存在器官培养基中，没有进行处理。约四到七天后，所有这些晶状体都在前囊100和后囊200上发育成铺满的单或多层增生LECs。
培养四到五天后，第二组二十个晶状体也有了增生的单层LECs。导入治疗溶液前对该组进行彻底洗涤以除去血清。在35mm深的培养皿中制备十毫升(10mL)包含(i)≤200mM NaCl；(ii)约90μM呋噻米，或约28μM布美他尼，或约112μM布美他尼和(iii)3μl 5NNaOH的治疗溶液。按照其它实施例的记载制备该溶液。然后将器官培养物转移到包含治疗溶液的培养皿中，在治疗溶液中保留五到十分钟。然后用镊子将器官培养物转移到另一个培养皿中。然后使用吸入/冲洗探针用具有微弱压力的新鲜HBSS溶液彻底清洗PCO器官培养物中带有分离LECs的囊。立即检测后，器官培养物在带有新鲜介质的培养基中保留七天，以测定是否有任何残留细胞存活。
在反相显微镜中用相位对比光学装置检测此处理对PCO器官培养模型的效果。用T-Max 400胶卷(柯达)在处理后零、五和十分钟以及十二小时时对它们进行拍照。如图8所示，在五到十分钟的处理时间内，所有的LECs都发生聚集，并失去了对单层和晶状体囊的粘附性。相差显微照片8A描述了在解剖后和治疗前六到七天对前囊100和后囊200进行假(sham)ECCE手术后，低放大倍率下(可见区域为1mm×0.75mm)的增生LECs。相差显微照片8B描述了处理后五分钟开始聚集和从晶状体囊分离的高放大倍率下(可见区域为3.4mm×1.5mm)的LECs。相差显微照片8C描述了处理后十分钟从单层分离的高放大倍率下的大多数被处理细胞。相差显微照片8D描述了在低放大倍率下，处理后十分钟，在洗涤以后，晶状体囊全无LECs。
实施例9在这个实施例中，检测了对原代RPECs的治疗效果。为了评定对其它眼部细胞是否有副作用，我们在6孔平底培养盘中培养原代培养的RPECs，直至它们在补有2mM谷酰胺、25mmol/L Hepes、pH7.4、10U/ml青霉素和10μg/ml链霉素和15％热不活跃胎牛血清(FCS)的Ham’s F10培养基中达到90到100％的铺满。培养物保留在37℃具有5％CO2的潮湿空气的孵育器中，并在实验前整晚保持铺满状态。
彻底洗涤RPEC培养物以在导入治疗溶液前除去血清。按照先前实施例的记载，在35mm深的培养皿中制备二十毫升(20mL)包含(i)≤200mM NaCl；(ii)约90μM呋噻米，或约28μM布美他尼，或约112μM布美他尼和(iii)6μl 5N NaOH的治疗溶液。然后在6孔培养盘中有铺满RPECs的3个孔中加入五毫升(5ml)治疗溶液。约10分钟后，彻底除去溶液，使用吸入/冲洗探针用具有微弱压力的新鲜HBSS溶液彻底清洗被处理的RPECs。立即检测后，原代RPEC培养物在带有新鲜介质的培养基中保留七天，以测定是否有任何残留细胞存活。
在反相显微镜中用相差光学装置检测对这些原代RPECs的治疗效果。在治疗后零、五和十分钟以及十二小时时用T-Max 400胶卷(柯达)对他们进行拍照。暴露在治疗溶液中十分钟没有对RPECs产生明显影响。图9描述了对这些细胞的治疗效果的一个有代表性的实施例。图片9A描述了零分钟时的RPECs。图片9B描述了治疗后五分钟的RPECs。图片9C描述了处理后十分钟的RPECs。图片8D描述了处理后洗涤细胞以后的RPECs。
实施例10为了评定对其它眼部细胞是否有副作用，我们按照实施例1的记载制备了LECs、CEDCs和RPECs的铺满单层。将这些细胞暴露在200μl/孔，包含≥200mM NaCl、90μM呋噻米和3μl 5N NaOH的治疗溶液内十分钟。
按照实施例1的记载，处理12到24小时后通过MTT测定法来确定被处理细胞的细胞生存能力。图10描述了LECs、RPECs和CEDCs对治疗的细胞存活反应。每个点都表示四组实验的平均值±s.e.m。如图所示，治疗后十分钟，治疗溶液诱导了与CEDCs和RPECs相比发生率明显更高的细胞分离和/或死亡(由LECs的细胞生存能力测定)。特别是，处理后有大于百分之七十的CEDCs和百分之八十的RPECs存活。这能与存活率小于百分之十的LECs比较。
实施例11检测对器官培养角膜扣状体的治疗效果以确定治疗是否会在接近体内的环境中引起周围眼部组织损伤。由于角膜的敏感性以及直接暴露于治疗中的危险性，因此要对角膜进行选择。用HBSS洗涤角膜器官培养物，将内皮面向上置于定做的不锈钢台上。然后将它们贮存在包含MEM生长培养基的灭菌培养盘中，其中培养基仅盖过培养盘的底部，其提供了一个潮湿室以防止上皮细胞干燥。然后用补有10％到15％FCS的MEM生长培养基填充内皮角膜的凹面，于37℃，在5％CO2的孵育器中培养。
将器官培养物分成对照组和治疗组。首先用HBSS洗涤培养物三次，然后将其内皮表面暴露在生理NaCl(137mM、293±9mOsm/L)或治疗溶液内十分钟。
对于治疗组，在35mm深的培养皿中制备十毫升(10mL)包含(i)≤200mM NaCl；(ii)约90μM呋噻米，或约112μM布美他尼和(iii)3μl 5N NaOH的治疗溶液。将器官培养物转移到包含治疗溶液的培养皿中，在治疗溶液内保留多于十分钟。然后用镊子将器官培养物转移到包含新鲜HBSS的另一个培养皿内。然后使用吸入/冲洗探针用带有微弱压力的新鲜HBSS彻底清洗角膜器官培养物。处理后，在新鲜介质中孵育角膜器官培养物六小时。
对于对照组，则将新鲜的HBSS用于角膜器官培养物十分钟，以代替上述治疗溶液。
为了评定治疗对角膜内皮细胞的毒性，我们通过使用了相差光学装置的反相显微镜和荧光共聚焦显微镜来检测角膜器官培养物钮。在共聚焦显微镜下检测了角膜内皮细胞肌动蛋白-丝的形态，以建立细胞结构完整的证据。治疗前或治疗后固定这些角膜器官培养物的内皮，用结合了FITC的鬼笔环肽染色。角膜上皮的共聚焦激光扫描图片显示未治疗(对照)和治疗组之间没有显著差异。治疗组的内皮层保持了与未治疗组一样的完整性。角膜内皮细胞以均匀分布的单层形式保留了下来，其在对照以及治疗器官培养物中都保持了其六边形的外观。其对角膜内皮细胞没有明显损伤。
根据上述教导本发明可以有多种改进和改变。例如，除上述的那些详述的离子转运机制干扰剂外，也可以使用其它的离子转运机制干扰剂，例如可能合适的以下物质缬氨霉素、溴、茶碱和其它烷基黄嘌呤、icosanoids、佛波酯(例如TPA)、保钾利尿剂(例如氨苯喋啶、螺内酯和坎利酸钾)、calyculin A、okadaic Acid(OA)、普萘洛尔及其类似物、血管紧张素II、酮康唑(CDC)、花生四烯酸、镧、三氟拉嗪、碘昔酚、2-氨基丁酸、17β-雌二醇、缓激肽、磷脂酰肌醇、4，5-磷酸氢盐(PIP2)、肌醇1，4，5，三磷酸盐(IP3)、前列腺素(PGE2)、腺苷3’5’-环一磷酸盐(cAMP)、鸟苷3’5’-环一磷酸盐(cGMP)、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(S/T-Ppases)、蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶A(PKA)、细胞分裂素活化蛋白激酶(MAPK)、SRC族酪氨酸激酶(SFKs)、多不饱和脂肪酸、磷脂酶C(PLC)、磷酸酶(PP)、G-蛋白、铷、铜(Cu2+)、硝酸盐(NO3-)、钡(Ba2+)、氯(Cl-)、钾(K+)、能改变胞内镁和氢浓度的试剂和能降低胞外钠、氯或钾浓度的试剂。我们应该能意识到还有其它的离子转运机制干扰剂。因此，我们能理解，在附加权利要求的范围内，本发明可以由不同于上下文记载的内容来实施。
权利要求
1.一种包含离子转运机制干扰剂的眼部治疗溶液，其中所述溶液诱导了与角膜内皮细胞和视网膜色素上皮细胞相比发生率显著更高的晶状体上皮细胞分离，以预防后囊浑浊化。
2.一种包含离子转运机制干扰剂和渗压剂的眼部治疗溶液，其中所述溶液诱导了与角膜内皮细胞和视网膜色素上皮细胞相比发生率显著更高的晶状体上皮细胞分离，以防止后囊浑浊化。
3.如权利要求2所述的眼部治疗溶液，其中所述渗压剂包含氨基酸。
4.如权利要求3所述的眼部治疗溶液，其中所述氨基酸选自氨基乙磺酸、甘氨酸和丙氨酸。
5.如权利要求2所述的眼部治疗溶液，其中所述渗压剂包含糖。
6.如权利要求5所述的眼部治疗溶液，其中所述糖选自甘露醇、肌醇、甜菜碱、甘油磷酰胆碱、甜菜碱、尿素、蔗糖和葡萄糖。
7.如权利要求2所述的眼部治疗溶液，其中所述渗压剂包含氯化物。
8.如权利要求2所述的眼部治疗溶液，其中所述渗压剂包含氯化钠。
9.如权利要求2所述的眼部治疗溶液，其中所述渗压剂选自氯化钾、氯化铯、氯化铷、氯化锂和氯化钫。
10.如权利要求2所述的眼部治疗溶液，其中所述渗压剂包含尿素。
11.如权利要求2所述的眼部治疗溶液，其中所述渗压剂包含钠。
12.如权利要求2所述的眼部治疗溶液，其中所述渗压剂选自氯化钠、碘化钠、溴化钠、硝酸钠、硫氰酸钠、氟化钠、硝酸钠、硫酸钠、羟乙磺酸钠和葡糖酸钠。
13.如权利要求2所述的眼部治疗溶液，其中所述渗压剂包含盐。
14.如权利要求1所述的眼部治疗溶液，其还包含渗透压剂。
15.如权利要求14所述的眼部治疗溶液，其中所述溶液具有高渗摩尔渗透压浓度。
16.如权利要求14所述的眼部治疗溶液，其中所述溶液具有低渗摩尔渗透压浓度。
17.如权利要求2所述的眼部治疗溶液，其中所述溶液的pH为约5到11。
18.如权利要求2所述的眼部治疗溶液，其中所述溶液的pH为约8到10。
19.如权利要求17所述的眼部治疗溶液，其中所述离子转运机制干扰剂是协同转运干扰剂。
20.如权利要求19所述的眼部治疗溶液，其中所述协同转运干扰剂选自N-乙基顺丁烯二酰亚胺、碘乙酰胺、呋噻米、布美他尼和水银。
21.如权利要求19所述的眼部治疗溶液，其中所述协同转运干扰剂选自呋噻米和布美他尼。
22.如权利要求2所述的眼部治疗溶液，其中所述离子转运机制干扰剂包含袢利尿剂。
23.如权利要求22所述的眼部治疗溶液，其中所述袢利尿剂选自伊他尼酸、吡咯他尼和托拉塞米。
24.如权利要求2所述的眼部治疗溶液，其中所述离子转运机制干扰剂选自N-乙基顺丁烯二酰亚胺、缬氨霉素、短杆菌肽、儿茶酚胺类、钙、离子载体A23187、钙调蛋白、匹莫齐特、阿米洛利、二-异硫氰基-二磺酰基茋、星孢素、尼氟灭酸、奎宁和细胞松弛素B。
25.如权利要求2所述的眼部治疗溶液，其中所述离子转运机制干扰剂包含茋衍生物。
26.权利要求25的溶液，其中所述茋衍生物是4，4’-二硝基茋-2，2’-二磺酸。
27.如权利要求17所述的眼部治疗溶液，其中所述离子转运机制干扰剂是钠泵干扰剂。
28.如权利要求27所述的眼部治疗溶液，其中所述钠泵干扰剂是乌本苷。
29.如权利要求17所述的眼部治疗溶液，其中所述离子转运机制干扰剂是交换干扰剂。
30.如权利要求29所述的眼部治疗溶液，其中所述交换干扰剂选自阿米洛利、星孢素、二-异硫氰基-二磺酰基茋和钙调蛋白。
31.如权利要求29所述的眼部治疗溶液，其中所述交换干扰剂包含铜。
32.如权利要求29所述的眼部治疗溶液，其中所述交换干扰剂包含氢。
33.如权利要求17所述的眼部治疗溶液，其中所述离子转运机制干扰剂是通道干扰剂。
34.如权利要求28所述的眼部治疗溶液，其中所述通道干扰剂选自酮康唑、5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸、1，9，-二去氧弗司扣林、他莫昔芬、维拉帕米、奎宁、钙、二苯胺-2-羧酸盐、蒽-9-羧酸、indocrinone和匹莫齐特。
35.如权利要求28所述的眼部治疗溶液，其中所述通道干扰剂包含钡。
36.如权利要求2所述的眼部治疗溶液，其还包含能调节所述溶液pH的试剂。
37.如权利要求2所述的眼部治疗溶液，其中所述能调节所述溶液pH的试剂是氢氧化物，其中治疗溶液的pH为约8到10。
38.如权利要求37所述的眼部治疗溶液，其中氢氧化物溶液包含氢氧化钠。
39.使用如权利要求17所述的眼部治疗溶液的方法，其中溶液在白内障手术期间被导入晶状体囊袋内。
40.如权利要求1所述的眼部治疗溶液，其中离子转运机制干扰剂是渗透压剂。
41.如权利要求2所述的眼部治疗溶液，其中所述离子转运机制干扰剂是呋噻米，其中治疗溶液的pH为约8到10。
42.如权利要求41所述的眼部治疗溶液，其中呋噻米以约15μM到约100μM的浓度存在于治疗溶液中。
43.如权利要求2所述的眼部治疗溶液，其中所述离子转运机制干扰剂是布美他尼，其中治疗溶液的pH为约8到10。
44.一种包含能诱导晶状体上皮细胞分离以预防后囊浑浊化的离子转运机制干扰剂的眼部治疗溶液。
45.如权利要求44所述的眼部治疗溶液，其中离子转运机制干扰剂以能有效诱导与角膜内皮细胞和视网膜色素上皮细胞相比发生率显著更高的晶状体上皮细胞分离以预防后囊浑浊化的浓度存在。
46.一种包含能诱导与角膜内皮细胞和视网膜色素上皮细胞相比发生率显著更高的晶状体上皮细胞分离以预防后囊浑浊化的离子转运机制干扰剂的眼部治疗溶液。
47.一种包含能选择性诱导晶状体上皮细胞的细胞死亡以预防后囊浑浊化的离子转运机制干扰剂的眼部治疗溶液。
48.一种包含能选择性诱导晶状体上皮细胞分离以预防后囊浑浊化的离子转运机制干扰剂的眼部治疗溶液。
49.一种包含离子转运机制干扰剂和渗透压剂以防止后囊浑浊化的眼部治疗溶液，所述溶液的pH为约5到11，并且所述溶液迅速诱导晶状体上皮细胞分离。
50.一种预防后囊浑浊化的方法，其包括在晶状体囊袋中导入包含离子转运机制干扰剂和渗透压剂的眼部治疗溶液，其中所述溶液的pH为约5到11，并且所述溶液诱导与角膜内皮细胞和视网膜色素上皮细胞相比发生率显著更高的晶状体上皮细胞分离以预防后囊浑浊化。
51.如权利要求50所述的预防后囊浑浊化的方法，其中所述渗透压剂是渗压剂。
52.如权利要求50所述的预防后囊浑浊化的方法，其还包括在白内障手术期间导入所述的溶液。
53.如权利要求50所述的预防后囊浑浊化的方法，其还包括在白内障手术后通过洗涤除去残留的晶状体上皮细胞。
54.一种预防后囊浑浊化的方法，其包括在晶状体囊袋中导入离子转运机制干扰剂；和在晶状体囊袋中导入渗透压剂以诱导与角膜内皮细胞和视网膜色素上皮细胞相比发生率显著更高的晶状体上皮细胞分离来预防后囊浑浊化。
55.如权利要求54所述的预防后囊浑浊化的方法，其还包括导入可注射的眼内晶状体。
56.如权利要求54所述的预防后囊浑浊化的方法，其还包括应用晶状体乳化法。
57.如权利要求54所述的预防后囊浑浊化的方法，其中同时在晶状体囊袋中导入离子转运机制干扰剂和渗透压剂。
58.如权利要求67所述的预防后囊浑浊化的方法，其中相继在晶状体囊袋中导入离子转运机制干扰剂和渗透压剂。
59.一种眼部治疗溶液，其包含离子转运机制干扰剂以预防后囊浑浊化，所述溶液的pH为约5到约11，并且所述溶液能在应用后约三十分钟内诱导晶状体上皮细胞分离。
全文摘要
在白内障手术前、期间或之后在晶状体囊袋中应用或导入用于预防后囊浑浊化的治疗溶液。治疗溶液包含离子转运机制干扰剂，其单独或与其它治疗剂例如渗透压剂和试剂一起使用以建立适宜的pH，其选择性地诱导了晶状体上皮细胞分离和/或死亡，这样就预防了后囊浑浊化。虽然离子转运机制干扰剂能干扰多种细胞的细胞机制和细胞离子浓度，但要对干扰剂浓度进行选择，这样治疗溶液就能选择性地干扰晶状体上皮细胞的细胞机制，而剩下的其它眼部细胞基本上没有受到损伤。治疗溶液选择性地诱导了晶状体上皮细胞死亡和/或分离，而其它眼部细胞和组织则基本上没有损伤，也没有冗长的术前预治疗。
文档编号A61K31/70GK1700909SQ03825231
公开日2005年11月23日 申请日期2003年8月28日 优先权日2002年9月17日
发明者张金俊 申请人:张金俊