胆酸衍生物修饰的胰岛素及其制备方法

专利名称：胆酸衍生物修饰的胰岛素及其制备方法
技术领域：
本发明涉及采用胆酸衍生物对胰岛素进行化学修饰，制备得到可以用于治疗糖尿病的口服药物胰岛素类似物及其制备方法。
背景技术：
糖尿病是一种常见的多发性代谢疾病，国内外发病率均呈上升趋势。据不完全统计，全国现有糖尿病患者3000万人以上，糖尿病的发病率已高达3.2％。糖尿病是引起人类死亡占第三位的主要原因。胰岛素是治疗糖尿病的特效性多肽激素化合物，迄今为止尚无更有效的替代药物。但是，由于胰岛素是一种蛋白质，易被胃肠道蛋白水解酶降解而失活，因此只能注射，不能口服。胰岛素依赖型糖尿病人必须每日使用胰岛素以降低血糖，维持生命的正常代谢。频繁注射用药，给需终身用药的病人带来极大的痛苦和不便。因此研究开发安全、方便而有效的胰岛素非注射给药途径已经成为世界各国医药界广泛关注的重要课题。
口服胰岛素一直是医生和糖尿病患者梦寐以求的药物，但迄今尚未取得突破性进展。为了解决给药途径，延缓胰岛素在体内的降解或排泄，近年来国内外对胰岛素新剂型开展了广泛研究，有经口服、鼻腔、舌下、眼部、直肠、透皮吸收等多种途径给药，其中口服给药是最受病人欢迎的途径，成为目前倍受亲睐的研究热点，但国际上至今尚无较好的口服制剂。
化学修饰是口服胰岛素的重要研究课题之一。现有技术通过对胰岛素进行化学修饰，增强胰岛素抵抗蛋白水解酶的破坏作用，进而研制出适于口服的胰岛素。Kuraray Co.，Ltd.的专利EP 0 511600 A2合成了[protein][Z]n的衍生物，其中[protein]为多肽蛋白质包括胰岛素，[Z]为-CO-W-COOH，式中W为长链的可含杂原子的碳水基团。N.Ekwuribe等人(专利PCT Int.Appl.WO 0078302)将一种低聚物共价连接到重组人胰岛素上得到胰岛素类似物M2，其口服降糖作用起效快，降糖效果与皮下注射相当，剂量为皮下注射的2倍，美国Protein Delivery公司正进行临床试验。Novo Nordisk A/S申请的专利WO 95/07931以及EliLilly公司的两个专利EP 0 712861 A2及EP 0 712862 A2也分别介绍了化学修饰胰岛素的合成方法。但有关给药安全性及患者进餐前后对用药的影响等仍在研究之中，迄今尚无临床试验成功的报道。本研究组曾申请了发明专利“治疗糖尿病的口服药脂肪二酰氨基酸胰岛素及其合成方法”(专利申请号011284998.6)，该项发明采用的修饰剂为脂肪族二元羧酸的单氨基酸衍生物，得到的修饰胰岛素可提高其抗酶解能力，但该修饰剂的活化中间体合成产率较低。胆酸的衍生物如去氢胆酸、酰化胆酸等，作用与胆汁相似，是肝细胞的生理刺激物，可刺激肝脏分泌大量粘度较低的胆汁，增加溶量(胆酸及其色素的总含量不变)，可使胆道通畅，起利胆作用，对脂肪的消化及吸收有促进作用，可用于胆囊及胆道功能失调，胆囊切除后综合症，慢性胆囊炎，胆石症及慢性肝炎等。这类胆酸衍生物的利胆作用比胆酸更加显著，且毒性比胆酸小得多。这类胆酸衍生物作为化学修饰基团不仅可以保护胰岛素易受胰蛋白酶进攻的位点，而且可增加胰岛素的脂溶性，促进胰岛素的吸收。本发明的化学修饰胰岛素目前尚未见报道。

发明内容
本发明旨在合成一类可以抵抗肠道胰蛋白酶水解的化学修饰胰岛素，以用于制备直接口服的胰岛素制剂。其特点是将胆酸衍生物共价结合到胰岛素的特定部位，得到胰岛素类似物。所选修饰剂胆酸存在于动物体内分泌的胆汁中。
本发明的关键在于采用化学修饰的方法在胰岛素的合适部位共价结合一个胆酸衍生物保护胰岛素易被胰蛋白酶进攻的位点，使胰岛素能够抵抗胰蛋白酶的降解作用。该物质的化学通式为DHch-CO-Ins或(RCO)3-ch-CO-Ins。
式中DHch-CO-为去氢胆酸酰基，其结构式如下
(RCO)3-ch-CO-为三脂肪酰胆酸酰基，其结构式如下 RCO-为C2～C18的直链脂肪酰基，Ins为胰岛素。
DHch-CO-Ins合成路线如下 具体合成步骤如下①将一定量胆酸溶于丙酮，再向其中加入四丁基溴化铵(TBAB)，TBAB与胆酸的质量百分比为2％；将重铬酸钠缓慢溶于浓硫酸；在30～35℃水浴下，边搅拌边向胆酸溶液中缓慢滴加重铬酸钠硫酸溶液；胆酸、丙酮、重铬酸钠、浓硫酸的摩尔比为1∶2∶1.1∶1.5。滴加完毕后，30～35℃保温反应3～4小时；反应完毕，将反应混合物缓慢倾入3～4倍量水中，边加边搅拌，析出沉淀，减压抽干，滤饼用水洗至白色。将所得滤饼用5％碳酸钠溶液溶解并使pH值为8～8.5，再加热至60～70℃，然后冷却，抽滤；在搅拌下向滤液中缓缓加入20％醋酸溶液，使pH达3～4，析出白色沉淀，抽滤；滤饼水洗至中性，抽干，80℃左右干燥，得去氢胆酸(I)粗品，用75％～95％乙醇重结晶得纯品；②将去氢胆酸(I)溶于丙酮，加入与(I)等摩尔的苯并三唑搅拌溶解；0℃下滴加与(I)等摩尔的二环己基碳二亚胺(DCC)的丙酮溶液，加毕，0℃搅拌反应2～4小时，然后在20℃继续反应4～5小时。停止反应后，减压过滤，滤除白色不溶物，得澄清透明滤液。将滤液减压浓缩后，冷却结晶。过滤，得白色粉状物，置50～60℃干燥至恒重，即得去氢胆酰苯并三唑(II)，产率约60％；③胰岛素的酰化反应在水和N-甲基-吡咯烷酮的混合溶剂中进行。在0℃下将一定量的胰岛素溶解在有机溶剂N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶剂中，水的体积百分含量为25％～75％，再加入摩尔数约为胰岛素用量30～50倍的TEA；有机溶剂还可以是四氢呋喃(THF)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等。
④将摩尔数为胰岛素用量的2～3倍的去氢胆酰苯并三唑(II)，溶解于N-甲基-吡咯烷酮中，将(II)的N-甲基-吡咯烷酮溶液加入到步骤③制备的胰岛素溶液中，在0℃下搅拌反应2.5～3.5小时；⑤向反应混合物中加入丙酮至有沉淀生成，冷冻离心，去掉上清，沉淀经冷冻干燥至恒重，得到去氢胆酰胰岛素(III)(DHch-CO-Ins)。
(RCO)3-ch-CO-Ins合成路线如下
具体合成步骤是①胆酸与酰氯(或酸酐)反应，使胆甾环上的三个羟基发生酯化。将胆酸溶于四氢呋喃(THF)，加入摩尔数三倍于胆酸的三乙胺(TEA)，再在10～15℃下，边搅拌边向其中滴加酰氯的THF溶液，酰氯摩尔数为胆酸的三倍。滴加完毕后，调温至20～25℃，继续搅拌反应4～5小时。停止反应后，冷却，减压过滤，得大量白色固体物。将所得白色固体物用乙醚溶解，滤去不溶物。将过滤所得乙醚提取液冷却，析出白色沉淀，过滤得三脂肪酰胆酸(IV)，产率60～80％。
②将(IV)溶于乙醚(或THF)中，加入与(IV)等摩尔的苯并三唑，搅拌溶解。冰浴下，缓慢滴加与(IV)等摩尔的DCC的乙醚(或THF)溶液。滴加完毕后，0℃下继续搅拌反应2～3h。然后，升温至20℃，继续搅拌2～3h。停止反应后，减压过滤除去白色不溶物，得澄清透明滤液。将滤液减压浓缩后，冷却结晶。过滤，得白色粉状物，真空干燥至恒重，即得酰化胆酸苯并三唑(V)，产率约60％；③在0℃下将一定量的胰岛素溶解在有机溶剂N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶剂中，水的体积百分含量为25％～75％，再加入摩尔数约为胰岛素用量30～50倍的TEA；有机溶剂还可以是四氢呋喃(THF)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等。
④将摩尔数为胰岛素用量的2～3倍的(V)溶解于有机溶剂N-甲基-吡咯烷酮中，将(V)的N-甲基-吡咯烷酮溶液加入到上述胰岛素溶液中，在0℃下搅拌反应2.5～3.5小时；⑤向上述反应混合物中加入丙酮至有沉淀生成，冷冻离心，去掉上清。沉淀经冷冻干燥至恒重，得到脂肪酰胆酸酰化胰岛素(VI)(RCO)3-ch-CO-Ins。产率(按胰岛素的加入量计)为85～95％。
所得修饰胰岛素用反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析。色谱系统为Agilent 1100，色谱柱为Phenomenex公司的Jupiter C18反相柱(250×4.6mm，5μm，30nm)；流动相A为磷酸盐缓冲液(pH3.0)，流动相B为乙腈，梯度洗脱，流速1ml/min，进样量20μl，柱温30℃，检测波长214nm。流动相梯度如下0min 74％A-26％B4min 70％A-30％B8min 70％A-30％B14min 64％A-36％B25min 64％A-36％B相同的色谱条件下，未修饰的猪胰岛素的保留时间(tR)为9.5min，而修饰胰岛素的tR均大于9.5min。
动物实验考察修饰胰岛素的降血糖效果，并与胰岛素对照；同时用胰蛋白酶对修饰胰岛素进行体外降解试验。
用正常小鼠考察所得修饰胰岛素的降血糖活性，并与天然胰岛素对照。取24只体重约30g昆明小鼠，禁食12小时，随机分成四组。将修饰胰岛素和胰岛素分别用磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)配成0.18IU/ml的注射液，小鼠腹膜皮下注射0.1ml/只(0.6IU/kg体重)。空白组注射等量的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)。尾静脉采血，测定不同时间的血糖值。结果证明，与胰岛素相比，修饰胰岛素不仅保持降糖活性，而且起效快，在体内持续作用时间延长，如图1所示。
将上述修饰胰岛素用磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)配成36IU/ml，加入一定量的胰蛋白酶(胰岛素∶胰蛋白酶＝25∶1)，在37℃下保温2h、4h、6h、8h、10h、12h，取体重约30g禁食12小时的正常昆明小鼠(每组不少于6只)，皮下注射0.1ml/只(0.6IU/kg体重)，尾静脉采血，测定注射后60min的血糖值。体外抗酶解实验结果表明，所得修饰胰岛素抵抗胰蛋白酶降解作用的能力提高，即使酶解12h仍然有一定的降糖作用；而未修饰的胰岛素酶解4h基本失去生物活性，如图2所示。


图1胰岛素(Ins)和修饰胰岛素(去氢胆酸-胰岛素与乙酰胆酸-胰岛素)的降血糖作用纵坐标为实测血糖平均值(P＜0.05)，单位为mmol/L；横坐标为时间，单位为分钟(min) ○记的曲线为空白组，●标记的曲线为胰岛素组，■标记的曲线为去氢胆酸-胰岛素，▲标记的曲线为乙酰胆酸-胰岛素。
图2酶解时间对胰岛素(Ins)和修饰胰岛素(去氧胆酸-胰岛素与乙酰胆酸-胰岛素)降糖能力的影响纵坐标为相对降糖率(％)，横坐标为酶解时间，单位为小时(h) ●标记的曲线为胰岛素组，■标记的曲线为去氢胆酸-胰岛素，▲标记的曲线为乙酰胆酸-胰岛素。
相对降糖率指已酶解的胰岛素(或修饰胰岛素)注射后60min引起的血糖降低值除以未酶解的胰岛素(或修饰胰岛素)注射后60min引起的血糖降低值。
具体实施例方式
例1去氢胆酰胰岛素(DHch-CO-Ins)的制备将2.01g去氢胆酸溶于100ml丙酮，加入0.595g苯并三唑，搅拌溶解。0℃下滴加1.04gDCC的丙酮溶液(1.04gDCC溶于30ml丙酮)。加毕，0℃搅拌反应3.5h。再在20℃继续反应2h。然后室温放置过夜。次日滤除白色不溶物，得澄清透明滤液。将滤液减压浓缩至约80ml后，冷却结晶。过滤，得白色粉状物，真空干燥至恒重，即得去氢胆酰苯并三唑，产率约60％。
在0℃下，将100mg猪胰岛素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.7ml二次水的混合溶剂中，搅拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1mol/L去氢胆酰苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下搅拌反应200min。停止反应，向无色透明的反应混合物中加入22.5ml冰冷的丙酮，冷冻离心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷冻干燥，得白色粉状物，即去氢胆酰胰岛素，产率约95％。RP-HPLC测得DHch-CO-Ins的保留时间为18.8min。
例2去氢胆酰胰岛素(DHch-CO-Ins)的制备将2.01g去氢胆酸溶于100ml丙酮，加入0.595g苯并三唑，搅拌溶解。0℃下滴加1.04gDCC的丙酮溶液30ml。加毕，0℃搅拌反应3h。再在20℃继续反应4h。停止反应，滤除白色不溶物，得澄清透明滤液。将滤液减压浓缩至约80ml后，冷却结晶。过滤，得白色粉状物，真空干燥至恒重，即得去氢胆酰苯并三唑，产率约60％。
在0℃下，将100mg猪胰岛素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.7ml二次水的混合溶剂中，搅拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1mol/L去氢胆酰苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下搅拌反应180min。停止反应，向无色透明的反应混合物中加入22.5ml冰冷的丙酮，冷冻离心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷冻干燥，得白色粉状物，即去氢胆酰胰岛素，产率约95％。RP-HPLC测得DHch-CO-Ins的保留时间为18.8min。
例3去氢胆酰胰岛素(DHch-CO-Ins)的制备将2.01g去氢胆酸溶于100ml丙酮，加入0.595g苯并三唑，搅拌溶解。0℃下滴加1.04gDCC的丙酮溶液30ml。加毕，0℃搅拌反应3h。再在20℃继续反应4h。停止反应，滤除白色不溶物，得澄清透明滤液。将滤液减压浓缩至约80ml后，冷却结晶。过滤，得白色粉状物，真空干燥至恒重，即得去氢胆酰苯并三唑，产率约60％。
在0℃下，将100mg猪胰岛素溶于1.5mlN-甲基吡咯烷酮及0.5ml二次水的混合溶剂中，搅拌下加入0.1mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1mol/L去氢胆酰苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下搅拌反应180min。停止反应，向无色透明的反应混合物中加入22.5ml冰冷的丙酮，冷冻离心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷冻干燥，得白色粉状物，即去氢胆酰胰岛素，产率约95％。RP-HPLC测得DHch-CO-Ins的保留时间为18.8min。
例4乙酰胆酸酰化胰岛素[(CH3CO)3-ch-CO-Ins]的制备称取4.08g胆酸(0.01mol)，加入10mlTHF，然后加入4.6g乙酸酐(0.045mol)，加热搅拌至全溶。90℃回流反应4h。反应混合物无色透明。停止反应后，蒸馏回收THF。余液粘稠透明，转入烧杯，加100ml蒸馏水，立即出现无色油状粘性物质。倾去水层。油状透明粘性液体继续用蒸馏水洗涤两次后，冷冻干燥，得无色粉状物4.6g，即乙酰胆酸，产率94％。
称取2.67g乙酰胆酸(5mmol)溶于25ml无水乙醚，加入0.595g苯并三唑(5mmol)，搅拌溶解。然后，在0℃下缓慢滴加1.04gDCC的乙醚溶液(1.04gDCC溶于30ml乙醚中)。滴加完毕后，继续在0℃下搅拌反应3h。再调温至20℃，搅拌反应4h。然后，室温放置过夜。次日过滤除去白色不溶物。将无色透明滤液浓缩后，置冰箱冷冻。数日后，倾去上清液，瓶底白色沉淀物于40～45℃烘干，得白色粉状物，即乙酰胆酸苯并三唑，产率约10％。
在0℃下，将100mg猪胰岛素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.7ml二次水的混合溶剂中，搅拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M乙酰胆酸苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0C下搅拌反应200min。停止反应，向无色透明的反应混合物中加入22.5ml冰冷的丙酮，冷冻离心(-8℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷冻干燥，得白色粉状物，即乙酰胆酸酰化胰岛素，产率92％。RP-HPLC测得(CH3CO)3-ch-CO-Ins的保留时间为10.68min。
例5乙酰胆酸酰化胰岛素[(CH3CO)3-ch-CO-Ins]的制备称取4.08g胆酸(0.01mol)，加入20mlTHF，然后加入4.6g乙酸酐(0.045mol)，加热搅拌至全溶。80℃回流反应5h。反应混合物无色透明。停止反应后，蒸馏回收THF。余液粘稠透明，转入烧杯，加100ml蒸馏水，立即出现无色油状粘性物质。倾去水层。油状透明粘性液体继续用蒸馏水洗涤两次后，冷冻干燥，得无色粉状物4.5g，即乙酰胆酸，产率92％。
称取2.67g乙酰胆酸(5mmol)溶于25ml无水乙醚，加入0.595g苯并三唑(5mmol)，搅拌溶解。然后，在0℃下缓慢滴加1.04gDCC的乙醚溶液(1.04gDCC溶于30ml乙醚中)。滴加完毕后，继续在0℃下搅拌反应2h。再调温至20℃，搅拌反应4h。然后，室温放置过夜。次日过滤除去白色不溶物。将无色透明滤液浓缩后，置冰箱冷冻。数日后，倾去上清液，瓶底白色沉淀物于45℃烘干，得白色粉状物，即乙酰胆酸苯并三唑，产率约10％。
在0℃下，将100mg猪胰岛素溶于1.5mlN-甲基吡咯烷酮及0.5ml二次水的混合溶剂中，搅拌下加入0.1mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M乙酰胆酸苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下搅拌反应180min。停止反应，向无色透明的反应混合物中加入25ml冰冷的丙酮，冷冻离心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷冻干燥，得白色粉状物，即乙酰胆酸酰化胰岛素，产率95％。RP-HPLC测得(CH3CO)3-ch-CO-Ins的保留时间为10.68min。
例6硬脂酰胆酸酰化胰岛素[(C17H35CO)3-ch-CO-Ins]的制备将4g胆酸溶于100mlTHF。10℃水浴下，边搅拌边缓慢滴加8.9g硬脂酰氯与25mlTHF的混合物，同时缓慢滴加4mlTEA。滴加完毕，继续搅拌2h。然后调温至20℃，继续搅拌反应3h。停止反应后，冷却，减压过滤，得大量白色固体物。将所得白色固体物用乙醚溶解，滤去不溶物。将过滤所得乙醚提取液冷却，析出白色沉淀，过滤得硬脂酰胆酸2.98g。
称取2.42g硬脂酰胆酸(2mmol)溶于65ml无水乙醚，加入0.238g苯并三唑(2mmol)，搅拌溶解。然后，在0℃下缓慢滴加0.52gDCC的乙醚溶液(0.52gDCC溶于15ml乙醚中)。滴加完毕后，再调温至20℃，继续搅拌反应6h。停止反应，过滤除去白色不溶物。将无色透明滤液置冰箱冷冻，析出白色沉淀物。抽滤得白色粉状物1.58g，即硬脂酰胆酸苯并三唑，产率59.8％。
在0℃下，将100mg猪胰岛素溶于1.4mlTHF及0.7ml二次水的混合溶剂中，搅拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M硬脂酰胆酸苯并三唑的THF溶液。0℃下搅拌反应180min。停止反应，向反应混合物中加入25ml冰冷的丙酮，冷冻离心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷冻干燥，得白色粉状物，即硬脂酰胆酸酰化胰岛素，收率90％。RP-HPLC测得硬脂酰胆酸酰化胰岛素的保留时间为19.5min。
权利要求
1.一种化学修饰的胰岛素，其化合物通式为DHch-CO-Ins，式中DHch-CO-为去氢胆酸酰基，其结构式如下 Ins为胰岛素。
2.权利要求1的化学修饰胰岛素的制备方法，合成路线和具体合成的步骤如下 ①将一定量胆酸溶于丙酮，再向其中加入四丁基溴化铵(TBAB)；将重铬酸钠缓慢溶于浓硫酸，在30～35℃水浴下，向胆酸溶液中滴加重铬酸钠硫酸溶液，滴完后，30～35℃保温反应3～4小时；反应完，将反应混合物缓慢倾入3～4倍量水中，析出沉淀，将所得滤饼水洗，用5％碳酸钠溶液溶解并使pH值为8～8.5，再加热至60～70℃，然后冷却，抽滤；在搅拌下向滤液中加入20％醋酸溶液，使pH达3～4，析出沉淀；滤饼水洗至中性，抽滤，干燥，即得去氢胆酸(I)粗品，重结晶得纯品；②将去氢胆酸(I)溶于丙酮，加入苯并三唑，搅拌溶解；0℃下滴加二环己基碳二亚胺(DCC)的丙酮溶液，加毕，0℃搅拌反应2～4小时，然后在20℃继续反应4～5小时；过滤，得澄清透明滤液，并浓缩冷却结晶；再过滤，干燥，即得去氢胆酰苯并三唑(II)；③0℃下将一定量的胰岛素溶解在有机溶剂N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶剂中，再加入三乙胺(TEA)；④将去氢胆酰苯并三唑(II)溶解于N-甲基-吡咯烷酮中，将式(II)化合物的N-甲基-吡咯烷酮溶液加入到步骤③的胰岛素溶液中，在0℃下搅拌反应2.5～3.5小时；⑤向反应混合物中加入丙酮至有沉淀生成，冷冻离心，沉淀经冷冻干燥至恒重，即得去氢胆酰胰岛素(III)(DHch-CO-Ins)。
3.按照权利要求2的化学修饰胰岛素的制备方法，步骤①所述的四丁基溴化铵(TBAB)与胆酸的质量百分比为2％；所述的胆酸、丙酮、重铬酸钠、浓硫酸的摩尔比为1∶2∶1.1∶1.5；所述的重结晶采用75％～95％的乙醇；步骤②所述的苯并三唑和二环己基碳二亚胺(DCC)与氢胆酸(I)的用量是等摩尔；步骤③所述的N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶剂，水的体积百分含量为25％～75％；所述的三乙胺摩尔数约为胰岛素用量的30～50倍；所述的有机溶剂还可以是四氢呋喃(THF)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)；步骤④所述的去氢胆酰苯并三唑(II)的摩尔数用量为胰岛素的2～3倍。
4.一种化学修饰的胰岛素，其化合物通式为(RCO)3-ch-CO-Ins，(RCO)3-ch-CO-为三脂肪酰胆酸酰基，其结构式如下 RCO-为C2～C18的直链脂肪酰基，Ins为胰岛素。
5.权利要求4的化学修饰胰岛素的制备方法，合成路线和具体合成的步骤如下 具体合成步骤是①将胆酸溶于四氢呋喃(THF)，加入三乙胺(TEA)，在10～15℃下边搅拌边滴加滴加酰氯的THF溶液；然后升温至20～25℃，继续搅拌反应4～5小时；停止反应后，冷却，过滤，乙醚溶解滤得的固体，再过滤，将过滤所得乙醚提取液冷却，析出的沉淀，即得三脂肪酰胆酸(IV)；②将三脂肪酰胆酸(IV)溶于乙醚中，加入的苯并三唑，搅拌溶解；冰浴下，缓慢滴加二环己基碳二亚胺(DCC)的乙醚溶液；滴完后，0℃下继续搅拌反应2～3小时，然后，升温至20℃，继续搅拌2～3小时，停反应后，过滤除去不溶物，将滤液浓缩后冷却、结晶、过滤、干燥得酰化胆酸苯并三唑(V)；③在0℃下将一定量的胰岛素溶解在有机溶剂N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶剂中，再加入三乙胺(TEA)；④将酰化胆酸苯并三唑(V)溶解于有机溶剂N-甲基-吡咯烷酮中，将式(V)的化合物N-甲基-吡咯烷酮溶液加入到步骤③的胰岛素溶液中，在0℃下搅拌反应2.5～3.5小时；⑤向上述反应混合物中加入丙酮至有沉淀生成，离心；将沉淀冷冻、干燥，得产物脂肪酰胆酸酰化胰岛素(VI)(RCO)3-ch-CO-Ins。
6.按照权利要求5的化学修饰胰岛素的制备方法，步骤①所述的三乙胺、酰氯用量的摩尔数为胆酸的三倍；步骤②所述的乙醚也可用四氢呋喃(THF)取代；所述加入的苯并三唑和二环己基碳二亚胺(DCC)与三脂肪酰胆酸(IV)等摩尔。步骤③所述的N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶剂，水的体积百分含量为25％～75％，所述的三乙胺摩尔数约为胰岛素用量的30～50倍；所述的有机溶剂还可以是四氢呋喃(THF)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)；步骤④所述的酰化胆酸苯并三唑(V)的摩尔数为胰岛素的2～3倍。
7.权利要求1和4的化学修饰胰岛素在用于制备治疗糖尿病的口服药物中的应用。
全文摘要
一种可以用于治疗糖尿病的口服药物——胆酸衍生物修饰的胰岛素及其制备方法。这类胆酸衍生物作为化学修饰基团不仅可以保护胰岛素易受胰蛋白酶进攻的位点，而且可增强胰岛素的脂溶性，促进胰岛素的吸收。合成方法是将胆酸衍生物共价结合到胰岛素的特定部位得到胰岛素类似物DHch－CO－Ins或(RCO)
文档编号A61K38/28GK1528788SQ20031011124
公开日2004年9月15日 申请日期2003年10月17日 优先权日2003年10月17日
发明者黄涛, 黄开勋, 徐辉碧, 黄 涛 申请人:华中科技大学