专利名称：新型胰岛素衍生物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及糖尿病用胰岛素，另外还提供其制 备方法。二背景技术：
糖尿病是一种常见的多发性代谢疾病，国内外的发病率均呈上升趋势。据不完全统计，全国现有糖尿病患者3000万人以上，糖尿病的发病率高达3.2%。 虽然许多疾病都能导致人死亡，但糖尿病是引起人死亡的第三位的主要原因。胰岛素是治疗糖尿病的特效多肽激素化合物，迄今为止尚无更有效的替代 药物。但是，由于胰岛素是一种蛋白质，容易被胃肠道中的蛋白酶水解而失去 活性，因此只能注射使用，不能够以其他方式给药。对于胰岛素依赖型的病人 来说，要维持生命的正常代谢，必须频繁注射用药，这就给该类病人带来极大 痛苦和不便。为了解决给要困难，延缓胰岛素在体内的降解和排泄，近年来国内外对胰 岛素的新剂型开展了广泛研究，化学修饰的方法是制备胰岛素新剂型的重要研 究课题之一。对于糖尿病的病人来说，有效的治疗方法涉及两种外源胰岛素的应用，饮 食使用的速效胰岛素和长效的基础胰岛素。目前胰岛素衍生物的长效机理基本上分为三种第一种是改造胰岛素的一级结构的氨基酸序列，使之形成不溶的多聚体晶 态，利用这种不溶态在体内的缓慢释放，来达到长效作用；第二种是用化学修饰的方法在胰岛素的某一个氨基酸残基的侧链上共价 结合一条脂肪链，通过连接的脂肪链在体内与白蛋白的作用增加循环半寿期来 达到长效；第三种就是通过化学方法在胰岛素的某些氨基酸残基的官能团上连接一 条或数条高分子物质，以增加胰岛素的循环半寿期而达到长效的目的。采取上述第一种长效机理的胰岛素制剂的代表是Ultralente， Lente，和 半-Lente。但现已表明这些长效制剂的不溶性会引起剂量反应的不一致，以及 在所述时间作用方面不可预测的问题，导致了血糖控制的不稳定，从而容易产 生危及生命的低血糖症状，因此仍需要可溶的长效基础胰岛素以得到成功的强 胰岛素替代疗法。用脂肪链修饰胰岛素的方法，人们进行了许多研究。通常的办法是使用活 化的脂肪酸修饰胰岛素的N-末端氨基或e -氨基，称之为酰化胰岛素。由于胰 岛素(猪，人)具有三个可被修饰的氨基A1-Na， B1-Na， B29-N e 。因此 脂肪酸修饰的只能是这三个氨基。Muranishi和Kiso (日本专利申请1-254699)公开了猪，牛，人胰岛素的 酰化，具体公开了下列化合物B29- Ne—棕榈酰胰岛素和B1，B29- Na， N e -二棕榈酰胰岛素。Hashimoto 等人在药理学研究 (Pharmaceutical Research ) 6: 171 176(1989)中报道了Bl-Na-棕榈酰胰岛素(N末端的a氨基被酰化)和Bl， B29的二酰化胰岛 素。Hashimoto的研究表明Bl-N a -—棕榈酰胰岛素只在高剂量时有降血糖作 用，而B1，B29- Ncc， Ne-二棕榈酰胰岛素基本无降血糖作用。丹麦的诺和诺德公司的B29-e-N单酰化胰岛素具有较好的降血糖作用， 并已上市，商品名在国内叫做"地特胰岛素"。这说明，只有B29- Ne的单修 饰胰岛素才有可利用的降糖活性，但根据该药物的专利，使用特别方法修饰胰' 岛素，得到的B29- Ne单酰化胰岛素的产率也只有73%，而且分离起来比较困 难。迄今为止，胰岛素的脂肪链修饰仅限于修饰侧链或N末端氨基，还没有人 进行过羧基修饰，并得到超过80%的产率的单一修饰物。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种新型胰岛素衍生物，是经化 学修饰胰岛素，另外还其供新型胰岛素衍生物的制备方法，酶促合成，胰岛素' 与所要修饰的化学基团的连接是位点专一的和高效的。本发明为实现上述目的所采用的技术方案是其化合物通式为C H2n+1NH-X-D，式中n-14-22， CnH2n+1NH为直链饱和脂肪氨基；X为遗传编码的 脯氨酸以外的天然氨基酸或者一氨基一羧基的非天然氨基酸；D为脱去B30 氨基酸残基的天然猪胰岛素或脱去B30氨基酸残基的人胰岛素。 所述X为苏氨酸。所述CnH2n+1NH与X的羧基之间为酰胺键连接；X的氨基与D的C末端B29 赖氨酸的羧基之间是酰胺键连接。 ' 本发明新型胰岛素衍生物的制备方法，具体合成步骤为第一步脂肪胺的制备将一定量的通式为CnH2 +10H的直连饱和脂肪醇
(n=14-22)加入到甲苯中，加热共沸除去水分，余下的溶液加入与脂肪醇等 摩尔量的吡啶，回流反应并滴加2倍脂肪醇摩尔量的氯化亚砜(S0C12)，滴加 完毕后再于80°C反应2-6小时，冷却过滤除去结晶物，然后减压蒸馏除去甲 苯，得到的产物为CnH2n+1Cl，将该物质放入反应釜中，以少量无水甲醇溶解， 然后加入过量的液态氨，密闭下60°C反应12-24小时，开釜后减压除去过量 的氨和甲醇，得到通式为CUH2的脂肪胺(n=14-22)，备用；
第二步CnH2n+1NH-X的制备:取一定量的氨基用Fmoc保护了的氨基酸衍生物， 其化学通式为Fmoc-HN-X-(COOH)， X为氨基酸残基，溶于二氯甲烷(CH2C12) 与二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶液中，加入Fmoc-HN-X-(COOH)等摩尔量的备 用的aUH2，再加入2倍Fmoc-HN-X-(C00H)摩尔量的碳二亚胺(DCC)， 0-10 °(:搅拌反应12-24小时，然后过滤除去副产物DCU，得到的溶液中加入过量的 哌啶，搅拌反应脱掉Fmoc保护基，得到CnH2n+1NH-X，备用，此时X的羧基与脂 肪胺形成酰胺连接，氨基为游离状态； '
第三步去掉B30氨基酸残基的胰岛素中间体D的制备在PH8. 3的碳酸氢 铵溶液中加入天然的猪胰岛素或人胰岛素，使之溶解，然后加入催化量的羧肽 酶A，在37。C水浴中作用2小时，然后加酸终止反应，反应液用S印hadexG50 分离，冻干，得到脱掉B30氨基酸的胰岛素中间体，其B链N末端为B29-Lys， 备用；
第四步新型胰岛素衍生物的制备首先将一定量备用的脱掉B30氨基酸残 基的胰岛素中间体用0.5-2N的醋酸溶液溶解，得溶液1;然后将备用的 C凡^NH-X溶于无水乙醇与二甲基甲酰胺(Et0H /画F )的1: 1-1: 6体比积混合溶液中，得溶液2，原料胰岛素中间体与CnH2n+1NH-X的摩尔比为1:20-1:100;
最后溶液1和2合并并调节pH至6-7，加入催化量的胰蛋白酶，在20-35°C的
水浴中反应12-24小时，即可得到本发明的终产物一B30的氨基酸残基的羧
基被脂肪胺修饰的新型胰岛素衍生物。
所述第一步脂肪胺的制备中滴加吡啶完毕后反应时间为4小时。 所述第一步脂肪胺的制备中加入液态氨反应时间为18小时。 所述第二步CnH2n+lNH-X的制备反应温度为4°C，反应时间为18小时。 所述第四步新型胰岛素衍生物的制备中溶解脱掉B30氨基酸残基的胰岛素
中间体的醋酸溶液浓度为1N。
所述第四步新型胰岛素衍生物的制备中原料胰岛素中间体与CJk"NH-X的
摩尔比为1:60。
所述第四步新型胰岛素衍生物的制备中溶液1和2合并并调节pH值为6. 8。 本发明胰岛素衍生物是在天然胰岛素或其类似物母体B链的C末端残基的 a -羧基上连接一条脂肪链所形成的新型衍生物。其做法是以天然的猪胰岛素 或人胰岛素为起始原料，使用羧肽酶A在适当的溶液中将上述胰岛素B链C末' 端第一个氨基酸残基切掉，然后在适当的溶液中以胰酶为催化剂，将一个连有 脂肪链的氨基酸衍生物通过酶促反应连接到上述的去掉C末端第一个氨基酸的 胰岛素上(此时C末端为赖氨酸)使之成为B链C末端上连接了脂肪链的新型 胰岛素衍生物。该衍生物具有潜在的口服功能及长效功能。
本发明胰岛素制备方法独特，通过有机相的酶促反应将事先合成好的脂肪 胺氨基酸衍生物连接到除掉B30氨基酸残基的人胰岛素或猪胰岛素的中间体 上，胰岛素与所要修饰的化学基团的连接是位点专一的和高效的，该有机相酶'促反应的产率在本专利中达到90%以上，最高达到99%。并且最后的结果是脂 肪链被连接到胰岛素的B30氨基酸残基的a羧基上，该连接为酰氨键，高产， 禾急定。
得到的产物的结构式为CnH2n+1NH-X-D，当X为苏氨酸时，此结构式代表一 条脂肪链以酰胺键连接到人胰岛素的B30氨基酸的羧基上；当X为丙氨酸时， 此结构式表示一条脂肪链以酰胺键连接到猪胰岛素的B30氨基酸的羧基上。不 论起始原料是猪胰岛素还是人胰岛素，当X为苏氨酸时，通过本发明提供的方 法，最后都得到B链C末端羧基修饰了一条脂肪链的人胰岛素。由于胰酶在有 机相中催化的合成反应只要求B29为赖氨酸，因此，不论X为何种氨基酸，都 不影响最后修饰物的产率。
四
图1是本发明脂肪链修饰胰岛素与未修饰人胰岛素的电泳行为对照图。
采用聚丙烯酰胺自然连续电泳，凝胶浓度为10%，凝胶内pH8.9 电极缓冲液pH为8.3，考玛斯亮蓝R250染色。 图2为本发明产品C18H37NH-Thr-D的质谱图。
五具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进下的详细说明，但不限子具体实施例。
实施例1:制备新型胰岛素衍生物d晶7NH-Thr-D: 步骤1.脂肪胺C18H37NH2的制备
取18醇(C18H37OH) 27克(0. l摩尔)，加入装有300毫升甲苯的500毫升 圆底烧瓶中，加热并蒸出IOO毫升甲苯以带出醇中的水分。余下的溶液加入与 脂肪醇等摩尔量的吡啶，回流反应并滴加2倍脂肪醇摩尔量的氯化亚砜(S0C12)，滴加完毕后将温度降到90。C继续反应4小时，冷却，过滤除去结晶 物，然后减压蒸去甲苯，残余物用水和乙醇重结晶，抽滤真空干燥得到25克 产物，此为Cuft7Cl。将此产物溶于少量无水甲醇加入到可密闭并可承受一定压-力的反应釜中，加入过量液态氨密闭，6(TC反应24小时，打开反应釜，反应 液旋转蒸发除去氨和甲醇，得到饱和直链脂肪胺C18H37NH2。 步骤2. C18H37NH-Thr (NH2)的制备
取实施例1中制备的d晶7NH2 2.6克(8毫摩尔)，溶于CH2Cl2/DMF (1:3) 的混合溶液中，加入2.73克(8毫摩尔)市售的氨基保护的Fmoc-Thr(Fmoc-苏氨酸)，然后加入DCC3.3克(16毫摩尔)，4。C下搅拌反应24小时，过滤除 去DCU沉淀，然后加入过量的哌啶脱掉Fmoc保护基，溶液加入水沉淀产物， 过滤，洗涤，真空干燥，得到d^7NH-Thr(NH》。 步骤3.除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体的制备
取100毫克人胰岛素(通化东宝公司提供)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳 酸氢铵溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37。C保温2小时，然后加入 冰醋酸终止反应，将得到的溶液经过S印hadexG50 (110cm， 1. 6cmlD)分离除 去酶蛋白，收集110 160毫升组分冻干，得到除去B30氨基酸残基的胰岛素中 间体D，收率为97%。
步骤4. C18H37NH-Thr-D (此即为权利要求中通式CnH2n+1NH_X-D的一种)的制备
(1) 步骤3中制备的除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体30毫克，加入 0. 15毫升1N冰醋酸溶解，得到溶液l，
(2) 取0.6毫升DMF/EtOH (1:1)混合液溶解步骤2中制备的 C18H37NH-Thr (NH2)，此为溶液2,(3) 合并溶液l、 2，用TEA(三乙胺)调节至pH6.5，再加入与胰岛素中间 体1:200重量比的胰蛋白酶，3(TC反应24小时。
(4) 反应完成后，将体系用HAc调节pH3.0，得到的溶液用S印hadexG50 分离除去胰蛋白酶，得到的修饰组分冻干。
(5) 将冻干物分别进行凝胶电泳分析、反相高效液相色谱分析、质谱分 析，结果证实，得到了C,晶7NH-Thr-D，产率在95%以上。
所得产品电泳图如图l所示，由图l可以看出，脂肪链修饰胰岛素与未 修饰人胰岛素的电泳行有明显差异，这是因为在凝胶中，带电粒子靠电荷的 差异由负极向正极移动，移动方向如图；脂肪链修饰了胰岛素的B链C末端 的羧基后，修饰的胰岛素比未修饰的胰岛素少了一个正电荷，因此其泳动速 度比未修饰胰岛素慢，在电泳胶片上显示了不同的两个区带，如图中泳道l 和泳道3所示。
图2C18H37NH-Thr-D的质谱图，在其MOLDI-TOF图上，显示出其分子量为 6031. 8，符合其分子式所代表的胰岛素衍生物的质量。 实施例2: C14H29NH-Ala-D的制备 步骤l.脂肪胺d4H29NH2的制备
取14醇(C14H290H) 18. 5克(0. l摩尔)，加入装有300毫升甲苯的500毫 升圆底烧瓶中，加热并蒸出IOO毫升甲苯以带出醇中的水分。余下的溶液加入' 与脂肪醇等摩尔量的吡啶，回流反应并滴加2倍脂肪醇摩尔量的氯化亚砜 (S0C12)，滴加完毕后将温度降到9(TC继续反应4小时，冷却，过滤除去结晶 物，然后减压蒸去甲苯，残余物用水和乙醇重结晶，抽滤真空干燥得到17克 产物，此为CwH29Cl。将此产物溶于少量无水甲醇加入到可密闭并可承受一定压力的反应釜中，加入过量液态氨密闭，6(TC反应24小时，打开反应釜，反应 液旋转蒸发除去氨和甲醇，得到饱和直链脂肪胺C14H29NH2。 步骤2. C14HJH-Ala(NH2)的制备
取实施例1中制备的"H具l. 84克(10毫摩尔)，溶于CH2C12/DMF (1:5) 的混合溶液中，加入1.64克(IO毫摩尔)市售的氨基保护的Fmoc-Ala(Fmoc-丙氨酸)，然后加入DCC4. 1克(20毫摩尔)，10°C下搅拌反应24小时，过滤 除去DCU沉淀，然后加入过量的哌啶脱掉Fmoc保护基，溶液加入水沉淀产物， 过滤，洗涤，真空干燥，得到(:14仏9丽-Ala(NH》。 步骤3.除去B30氮基酸残基的胰岛素中间体的制备
取100毫克人胰岛素(通化东宝公司提供)溶于5毫升p朋.3的0. 1M碳 酸氢铵溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37。C保温2小时，然后加入 冰醋酸终止反应，将得到的溶液经过S印hadexG50 (110cm， 1. 6cmlD)分离除 去酶蛋白，收集110 160毫升组分冻干，得到除去B30氨基酸残基的胰岛素中 间体D，收率为97%。
步骤4. C14H29NH-Thr-D (此即为权利要求中通式CnH2n+1NH-X-D的一种)的制备
(1) 步骤3中制备的除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体30毫克，加入0. 15 毫升1N冰醋酸溶解，得到溶液l
(2) 取0.6毫升DMF/EtOH (2:1)混合液溶解步骤2中制备的 CI4H29NH-Ala(NH》，此为溶液2。
(3) 合并溶液1、 2，用TEA(三乙胺)调节至pH6.8，再加入与胰岛素中间体 1:200重量比的胰蛋白酶，3(fC反应24小时。
(4) 反应完成后，将体系用HAc调节pH3. 0，得到的溶液用S印hadexG50分离除去胰蛋白酶，得到的修饰组分冻干。
(5)将冻干物分别进行凝胶电泳分析、反相高效液相色谱分析、质谱分析，
结果证实，得到了d4^NH-Ala-D，产率在95%以上。具体见
。 实施例3: C1SH33NH-Gly-D的制备 步骤1.脂肪胺C16H33NH2的制备
取22醇(C16H33OH) 24. 2克(0.1摩尔)，加入装有300毫升甲苯的500毫 升圆底烧瓶中，加热并蒸出IOO毫升甲苯以带出醇中的水分。余下的溶液加入 与脂肪醇等摩尔量的吡啶，回流反应并滴加2倍脂肪醇摩尔量的氯化亚砜 (S0C12)，滴加完毕后将温度降到9(TC继续反应4小时，冷却，过滤除去结晶 物，然后减压蒸去甲苯，残余物用水和乙醇重结晶，抽滤真空干燥得到22克 产物，此为CwH33Cl。将此产物溶于少量无水甲醇加入到可密闭并可承受一定压 力的反应釜中，加入过量液态氨密闭，6CfC反应24小时，打开反应釜，反应 液旋转蒸发除去氨和甲醇，得到饱和直链脂肪胺C16H33NH2。 步骤2. C16H33NH-Gly (NH2)的制备
步骤1中制备的C16H33NH2 2. 4克(10毫摩尔)，溶于CH2C12/DMF (1:5)的 混合溶液中，加入1.23克(IO毫摩尔)市售的氨基保护的Fmoc-Gly(Fmoc-甘 氨酸)，然后加入DCC3.3克(20毫摩尔)，0。C下搅拌反应24小时，过滤除去 DCU沉淀，然后加入过量的哌啶脱掉Fmoc保护基，溶液加入水沉淀产物，过滤， 洗涤，真空干燥，得到d晶3NH-Gly(NH2)。
步骤3.除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体的制备 取100毫克人胰岛素(通化东宝公司提供)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳 酸氢铵溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37。C保温2小时，然后加入冰醋酸终止反应，将得到的溶液经过S印hadexG50 (110cm， l^cmlD)分离除 去酶蛋白，收集11(T160毫升组分冻干，得到除去B30氨基酸残基的胰岛素中 间体D，收率为97%。
步骤4.d晶3NH-Gly-D (此即为权利要求中通式CnH2n+NH-X-D的一种)的制备
(6) 步骤3中制备的除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体30亳克，加入 0. 15毫升1N冰醋酸溶解，得到溶液1
(7) 取0.6毫升DMF/EtOH (1:1)混合液溶解步骤2中制备的. C16H33NH-Gly(NH2)，此为溶液2。
(8) 合并溶液l、 2，用TEA(三乙胺)调节至pH7.0，再加入与胰岛素中间 体1:100重量比的胰蛋白酶，3(TC反应24小时。
(9) 反应完成后，将体系用HAc调节pH3.0，得到的溶液用S印hadexG50 分离除去胰蛋白酶，得到的修饰组分冻干。
(10) 将冻干物分别进行凝胶电泳分析、反相高效液相色谱分析、质谱分 析，结果证实，得到了 CieH33NH-Gly-D，产率在95%以上。具体见附图说 明。
实施例4
C12H25NH-Leu-D的制备具体原料为脱掉B30的胰岛素中间体D，脂肪醇为 C12H25OH，氨基酸为亮氨酸，按照实施例1所述的工艺步骤及工艺条件制备。 实施例5
C12H25NH-Leu-D的制备具体原料为脱掉B30的胰岛素中间体D，脂肪醇为 C12H25OH，氨基酸为亮氨酸，按照实施例1所述的工艺步骤及工艺条件制备。. 实施例6C13H27NH-Phe-D的制备具体原料为脱掉B30的胰岛素中间体D，脂肪醇为 C13H270H，氨基酸为苯丙氨酸，按照实施例1所述的工艺步骤及工艺条件制备。 实施例7
C14H29NH-Trp-D的制备具体原料为脱掉B30的胰岛素中间体D，脂肪醇为 C14H290H，氨基酸为色氨酸，按照实施例1所述的工艺步骤及工艺条件制备。 实施例8
C15H31NH-lie-D的制备具体原料为脱掉B30的胰岛素中间体D，脂肪醇为 C15H310H，氨基酸为异亮氨酸，按照实施例l所述的工艺步骤及工艺条件制备。. 实施例9
C16H33NH-Ser-D的制备具体原料为脱掉B30的胰岛素中间体D，脂肪醇为 C16H330H，氨基酸为丝氨基酸，按照实施例1所述的工艺步骤及工艺条件制备。 实施例10
C17H35NH-Met-D的制备具体原料为脱掉B30的胰岛素中间体D，脂肪醇为 C17H350H，氨基酸为甲硫氨酸，按照实施例1所述的工艺步骤及工艺条件制备。 实施例11
C18H37NH-Cys-D的制备具体原料为脱掉B30的胰岛素中间体D，脂肪醇为 C18H370H，氨基酸为半胱氨酸，按照实施例1所述的工艺步骤及工艺条件制备。 实施例12
C12H25NH-Glu-D的制备具体原料为脱掉B30的胰岛素中间体D，脂肪醇为 C12H25OH，氨基酸为谷氨基酸，按照实施例1所述的工艺步骤及工艺条件制备。 实施例13
C13H27NH-Gin-D的制备具体原料为脱掉B30的胰岛素中间体D，脂肪醇为.C13H270H，氨基酸为谷氨酰胺，按照实施例1所述的工艺步骤及工艺条件制备。
实施例14
C14H29NH-Asp-D的制备具体原料为脱掉B30的胰岛素中间体D，脂肪醇为 CMH290H，氨基酸为天冬氨酸，按照实施例1所述的工艺步骤及工艺条件制备。 实施例15
C12H25NH-Asn-D的制备具体原料为脱掉B30的胰岛素中间体D，脂肪醇为 C12H250H，氨基酸为天冬酰胺，按照实施例l所述的工艺步骤及工艺条件制备。 实施例16
C15H31NH-Arg-D的制备具体原料为脱掉B30的胰岛素中间体D，脂肪醇为. C15H31OH，氨基酸为精氨酸，按照实施例1所述的工艺步骤及工艺条件制备。 实施例17
C16H33NH-Val-D的制备具体原料为脱掉B30的胰岛素中间体D，脂肪醇为 C16H330H，氨基酸为缬氨酸，按照实施例1所述的工艺歩骤及工艺条件制备。 实施例18
C17H35NH-His-D的制备具体原料为脱掉B30的胰岛素中间体D，脂肪醇为 C17H35OH，氨基酸为组氨酸，按照实施例1所述的工艺步骤及工艺条件制备。 实施例19
UH37NH-Tyr-D的制备具体原料为脱掉B30的胰岛素中间体D，脂肪醇为 C18H37OH，氨基酸为酪氨酸，按照实施例1所述的工艺步骤及工艺条件制备。
1权利要求
1. 新型胰岛素衍生物，其特征是其化合物通式为CnH2n+1NH-X-D，式中n＝14-22，CnH2n+1NH为直链饱和脂肪氨基；X为遗传编码的脯氨酸以外的天然氨基酸或者一氨基一羧基的非天然氨基酸；D为脱去B30氨基酸残基的天然猪胰岛素或脱去B30氨基酸残基的人胰岛素。
2、 根据权利要求1所述的新型胰岛素衍生物，其特征是其中X为L-苏氨酸。
3、 根据权利要求1所述的新型胰岛素衍生物，其特征是其中的CnH2n+1NH 与X的羧基之间为酰胺键连接。
4、 根据权利要求1所述的新型胰岛素衍生物，其特征是其中X的氨基 与D的C末端B29赖氨酸的羧基之间是酰胺键连接。
5、 新型胰岛素衍生物的制备方法，其特征是具体合成步骤为 第一步脂肪胺的制备将一定量的通式为C H2n+10H的直连饱和脂肪醇(n=14-22)加入到甲苯中，加热共沸除去水分，余下的溶液加入与脂肪醇等 摩尔量的吡啶，回流反应并滴加2倍脂肪醇摩尔量的氯化亚砜(S0C1》滴加完 毕后再于8(TC反应2-6小时，冷却过滤除去结晶物，然后减压蒸馏除去甲苯， 得到的产物为CnH2 +1Cl，将该物质放入反应釜中，以少量无水甲醇溶解，然后 加入过量的液态氨，密闭下60°C反应12-24小时，开釜后减压除去过量的氨 和甲醇，得到通式为C H2n+1NH2的脂肪胺(n=14-22)，备用；第二步Uk+,NH-X的制备:取一定量的氨基用Fmoc保护了的氨基酸衍生物，其化学通式为Fmoc-HN-X-(C00H) ， X为氨基酸残基，溶于二氯甲垸(CH2C12) 与二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶液中，加入Fmoc-HN-X-(COOH)等摩尔量的备 用的CJUNH2，再加入2倍Fmoc-HN-X-(C00H)摩尔量的碳二亚胺(DCC)， 0-10 。C搅拌反应12-24小时，然后过滤除去副产物DCU，得到的溶液中加入过量的 哌啶，搅拌反应脱掉Fmoc保护基，得到Qk+1NH-X，备用，此时X的羧基与脂肪胺形成酰胺连接，氨基为游离状态；第三步去掉B30氨基酸残基的胰岛素中间体D的制备在pH8. 3的碳酸氢 铵溶液中加入天然的猪胰岛素或人胰岛素，使之溶解，然后加入催化量的羧肽 酶A，在37°(]水浴中作用2小时，然后加酸终止反应，反应液用S印hadexG50 分离，冻干，得到脱掉B30氨基酸的胰岛素中间体，其B链N末端为B29-Lys， 备用；第四步新型胰岛素衍生物的制备首先将一定量备用的脱掉B30氨基酸残 基的胰岛素中间体用0.5-2N的醋酸溶液溶解，得溶液1;然后将备用的 Ok+,NH-X溶于无水乙醇与二甲基甲酰胺(Et0H / DMF )的1: 6体比积 混合溶液中，得溶液2;原料胰岛素中间体与CnH2 +1NH-X的摩尔比为1:20-1:100， 最后溶液l和2合并并调节pH至6-7，加入催化量的胰蛋白酶，在20-35。C的 水浴中反应12-24小时，即可得到本发明的终产物——B30的氨基酸残基的羧 基被脂肪胺修饰的新型胰岛素衍生物。
6、 根据权利要求4所述的新型胰岛素衍生物的制备方法，其特征是第 一步脂肪胺的制备中滴加吡啶完毕后反应时间为4小时。
7、 根据权利要求4所述的新型胰岛素衍生物的制备方法，其特征是第 一步脂肪胺的制备中加入液态氨反应时间为18小时。
8、 根据权利要求4所述的新型胰岛素衍生物的制备方法，其特征是第 二步CnH2n+1NH-X的制备反应温度为4°C，反应时间为18小时。
9、 根据权利要求4所述的新型胰岛素衍生物的制备方法，其特征是第 四步新型胰岛素衍生物的制备中溶解脱掉B30氨基酸残基的胰岛素中间体的醋 酸溶液浓度为1N。
10、 根据权利要求4所述的新型胰岛素衍生物的制备方法，其特征是第 四步新型胰岛素衍生物的制备中原料胰岛素中间体与CnH2n+1NH-X的摩尔比为 1:60。
11、 根据权利要求4所述的新型胰岛素衍生物的制备方法，其特征是第 四步新型胰岛素衍生物的制备中溶液1和2合并并调节pH值为6. 8。
全文摘要
本发明涉及生物领域。新型胰岛素衍生物，其特征是其化合物通式为C<sub>n</sub>H<sub>2n+1</sub>NH-X-D，式中n＝14-22，C<sub>n</sub>H<sub>2n+1</sub>NH为直链饱和脂肪氨基；X为遗传编码的脯氨酸以外的天然氨基酸或者一氨基一羧基的非天然氨基酸；D为脱去B30氨基酸残基的天然猪胰岛素或脱去B30氨基酸残基的人胰岛素。本发明胰岛素衍生物是在天然胰岛素或其类似物母体B链的C末端残基的α-羧基上连接一条脂肪链所形成的新型衍生物。其做法是以天然的猪胰岛素或人胰岛素为起始原料，使用羧肽酶A将上述胰岛素B链C末端第一个氨基酸残基切掉，然后胰蛋白酶为催化剂，将一个连有脂肪链的氨基酸衍生物通过酶促反应成为B链C末端上连接了脂肪链的新型胰岛素衍生物。该衍生物具有潜在的口服功能及长效功能。
文档编号C07K14/62GK101298477SQ200810011479
公开日2008年11月5日 申请日期2008年5月20日 优先权日2008年5月20日
发明者何明磊 申请人:大连民族学院