专利名称：一种垂体腺苷酸环化酶激活多肽衍生物及其制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种腺苷酸环化酶激活多肽衍生物，以及该衍生物的生产方法。
背景技术：
垂体腺苷酸环化酶激活肽(英文名称pituitary adenylate cyclase activatingpolypeptide，以下简称PACAP)及其受体广泛分布于中枢神经系统、周围神经系统以及非神经组织内，如脑、脊髓、肾上腺、睾丸、卵巢、肝脏、肾脏、胰腺、松果腺、心脏、脊椎、神经节、呼吸系统和消化系统等。PACAP通过激活靶细胞细胞膜上特异的G蛋白偶联受体，调节靶细胞内第二信史cAMP、IP3和Ca2+的浓度，从而发挥重要的生物学功能。目前已证实PACAP具有神经递质、神经调质、神经营养和保护，调节胰岛素及其它激素的分泌，保护血管上皮细胞，防止动脉硬化，调节生殖细胞的生成等作用。天然的PACAP由38个氨基酸组成，目前大多采用化学合成的方法，成本昂贵且收获率低。因为PACAP的衍生物也具有相同的生物学活性。所以采用基因工程的方法获得PACAP相应的衍生物可以降低生产成本，而且通过对生产方法的摸索，可以有效地提高收获率及其活性、稳定性等指标。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组腺苷酸环化酶激活多肽衍生物；本发明的另一目的在于提供重组腺苷酸环化酶激活多肽衍生物的生产方法；本发明再一目的在于提供重组腺苷酸环化酶激活多肽衍生物在制备治疗相关疾病的药物中的应用。
本发明利用基因工程的方法，通过蛋白内含肽(intein)的自剪切功能制备PACAP的衍生肽-PACAP衍生硫酯(PDT)，其是在天然PACAP的羧基端通过硫酯键连接了一个β-巯基乙醇分子(CH2SHCH2OH、β-mercaptoethanol，BME)，其与天然或化学合成产生的PACAP多肽的区别在于PDT为39个氨基酸，第一个氨基酸为甲硫氨酸，从第2个开始至第39个氨基酸的序列与天然的PACAP相同，但最后的一个氨基酸即赖氨酸(Lys)的羧基上与天然的PACAP不同，详见见图2、图3和图4，即其中本发明提供的PDT的羧基端最后一个氨基酸残基的分子结构为图2，其羧基端为一个β-巯基乙醇分子；而天然PACAP在相应位置处的氨基酸残基分子结构见图3，其羧基端为一个羟基；另化学合成的PACAP在相应位置处的氨基酸残基分子结构见图4，其羧基端为一个氨基。可从以上结果得知，本发明的PACAP的衍生肽--PDT)与天然的PACAP或化学合成的PACAP衍生物是不相同的。
本发明可用于制备治疗相关疾病的药物，该类药物可用于脑损伤、脑缺血、防止神经细胞死亡、抗炎、男性阳痿、性冷淡、不孕不育、神经痛、神经病、神经混乱、焦虑症、记忆损伤、痴呆、认知混乱、中枢神经系统疾病、偏头痛、神经畏缩、心肌缺血、心肌梗死/纤维化、动脉硬化、糖尿病、肌畏缩症、胃溃疡、高血压、内毒性休克、血栓症、视网膜病变、心血管疾病、肾衰竭、心衰竭等疾病的治疗。
以下详细描述本发明的技术方案本发明所提供的PACAP的衍生肽--PACAP衍生硫酯(PDT)，其具体制备路线为首先，用本领域技术人员熟知的方法，设计引物，采用PCR的方法人工合成垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因；其次，将合成的垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因克隆到质粒载体中，构建成功重组表达载体，其中质粒载体较好的是pTYB1，构建而得的重组表达载体命名为pTY-PDT。
再在宿主菌表达由PACAP、intein和几丁质结合域(chitin binding domain，CBD)构成的“三元”融合蛋白，其中所述的宿主菌，较好的是大肠杆菌，优选的是大肠杆菌ER2566；再将表达产物与亲和柱进行亲和层析，该亲和柱优选的是几丁质柱；“三元”融合蛋白通过CBD与亲和柱特异结合，洗去杂蛋白后，用诱导剂诱导intein将目的蛋白PACAP从融合蛋白上切割下来，该诱导剂优选的是β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol，BME)；最后，所制备的衍生肽蛋白羧基端通过硫酯键连接一个β巯基乙醇分子，成为蛋白硫酯，为一种PACAP衍生物，称PACAP衍生硫酯(英文名称PACAPderived thioester，以下简称PDT)。
以上所述的具体制备路线可参考图5。另，目的蛋白PACAP从融合蛋白上切割下来，即PDT的产生机制的示意图见图6。
经检测PDT的活性与天然蛋白相同，但体外活性半衰期比天然蛋白至少长10倍，说明PDT比天然蛋白的稳定性更高。
值得说明的是，PDT在水中会发生水解反应，其通过硫酯键连接的β巯基乙醇分子基团会进一步水解形成-SH、-SOH、-OH、-H等基团，但活性试验证明，这些水解混合物并没有影响其活性。
获得的垂体腺苷酸环化酶激活多肽衍生物PDT由于具有神经递质、神经调质、神经营养和保护，调节胰岛素及其它激素的分泌，保护血管上皮细胞，防止动脉硬化，调节生殖细胞的生成等作用，因此它也可用于进一步制备治疗相关疾病的药物，该类药物可用于治疗包括脑损伤、脑缺血、防止神经细胞死亡、抗炎、男性阳痿、性冷淡、不孕不育、神经痛、神经病、神经混乱、焦虑症、记忆损伤、痴呆、认知混乱、中枢神经系统疾病、偏头痛、神经畏缩、心肌缺血、心肌梗死/纤维化、动脉硬化、糖尿病、肌畏缩症、胃溃疡、高血压、内毒性休克、血栓症、视网膜病变、心血管疾病、肾衰竭、心衰竭等疾病。
以下通过具体实施例和
对本发明作进一步的详细说明，但实施例和附图的内容不用于限定本发明。
图1显示的是一个β-巯基乙醇分子；图2显示的是PACAP的衍生肽(PDT)的羧基端最后的一个氨基酸即赖氨酸(Lys)的分子结构，其的羧基端连接了一个β-巯基乙醇分子；图3显示的是天然PACAP的羧基端最后的一个氨基酸即赖氨酸(Lys)的分子结构，其羧基端末端基团为羟基；图4显示的是化学合成PACAP的羧基端最后的一个氨基酸即赖氨酸(Lys)的分子结构，其羧基端末端基团为氨基；
图5利用内含肽制备PDT的示意图；图6PDT的产生机制；图7PACAP基因合成示意图；图8重组表达质粒pTY-PDT的构建示意图；图9PACAP基因扩增及重组质粒PTY-PDT的PCR鉴定。其中1.PACAP基因；2.3.阴性克隆的PCR结果；4.5.阳性产物PCR的结果；图10PACAP基因的测序图；图11含重组PDT的融合蛋白和重组PDT的SDS-PAGE分析。其中M.蛋白质相对分子质量标准；1.未诱导的PTY-PDT/ER2566表达系统；2.已诱导的PTY-PDT/ER2566表达系统；3.重组PDT；图12重组PDT的Westernblot。其中M.蛋白质相对分子质量标准；1.重组PDT；图13重组PDT的质谱分析图；图14重组PDT和PACAP38促S19901细胞cAmp生成的活性比较；图15重组PACAP38和重组PDT的体外稳定性比较。
具体实施例实施例1PACAP基因的扩增和PTY-PDT质粒的构建根据PACAP成熟肽的氨基酸序列，按大肠杆菌的密码偏好性设计其核苷酸序列。分段合成引物，按图3所示，通过PCR，体外合成PACAP基因。合成PACAP的3条引物F1 5’ATG CAC TCT GAC GGC ATC TTC ACA GAC TCT TAT TCC CGCTAC CGA AAA CAA ATG3’；F2 5’TCC CGC TAC CGA AAA CAA ATG GCT GTC AAG AAA TAC TTGGCG GCC GTG CTA GGG AAA AGG3’；F3 5’TTA CTA TTT GTT TTT AAC CCT CTG TTT ATA CCT TTT CCC TAGCAC GGC CGC3’表达融合蛋白质粒的构建见图8。设计引物，在PACAP基因的上游引入Ndel识别位点，在下游引入Sapl识别位点；将PACAP基因插入PTYB1中，得到表达载体PTY-PDT。表达质粒的PCR鉴定见图9，测序结果见图10。
实施例2重组融合蛋白的表达和目的蛋白的切割表达质粒转化表达宿主菌E.coli Strain ER2566，挑取单克隆摇菌培养过夜，以1∶20接于1L含50mg/L卡那霉素的LB培养基，37℃摇菌至OD为0.5-0.8，加入IPTG至终浓度0.3-0.5mmol/L，30℃诱导3h。离心收集菌体，BufferA(20mMTris.HCl，500mM NaCl，1mM EDTA，pH7.5)重悬，于4℃下超声破碎，离心取上清。
取6mL chitin beads slurry装柱后用60mL Buffer A平衡；以＜＝0.5mL/min的流速将菌体破碎上清上样；按1mL/min流速用不少于100mL的Buffer A洗柱，去除杂蛋白。用18mL的Buffer B(20mM Tris.HCl，500mM NaCl，1mM EDTA，50mM BME，pH7.5)快速洗柱后，4℃放置16h。18mL Buffer A将目的蛋白PDT洗下来。PDT经SDS-PAGE和westernblot鉴定，并用激光飞行质谱测定其分子量。SDS-PAGE蛋白电泳结果见图11，westernblot鉴定结果见图12，质谱结果见图13。
实施例3PDT和PACAP38的活性和稳定性比较取对数生长期的S1990细胞消化脱壁后，调整细胞悬液浓度为1×107个/mL，分别加入相同浓度的PDT和PACAP38，以培养液为对照组；培育5min后，分别自实验组及对照组取出200μL悬液，加入三氯醋酸，充分震荡混匀，离心，取上清0.5mL，用水饱和乙醚将上清洗涤后，蒸干。应用Cyclic AMP EnzymeImmunoassay Kit测定cAMP浓度。
按如上方法测定PDT和PACAP38促S1990胰腺细胞内cAmp生成的活性数据见表1，曲线图见图14，结果显示PDT和PACAP38的活性相当。
表1 实施例4PDT和PACAP38的稳定性测定用生理盐水配置相同浓度的PDT和PACAP，4℃放置，每5天取样测定其活性。以0时活性为100％，绘制活性随时间变化的曲线图，比较两者的体外活性半衰期，数据见表2，曲线图见图15。
按如上方法比较PDT和PACAP38的体外稳定性，发现在室温放置约5天，合成的PACAP38活性衰减50％，PDT室温放置30天，活性仍保留75％，放置约50天，活性衰减为50％。因此PDT比PACAP有至少长约10倍的体外活性半衰期。
表2
序列表<110>暨南大学生物工程研究所<120>pituitary adenylate cyclase activating polypeptide derivedthioester(PDT)<130>no<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>117<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>The codons of PDT gene were modified<400>1atgcactctg acggcatctt cacagactct tattcccgct accgaaaaca aatggctgtc 60aagaaatact tggcggccgt gctagggaaa aggtataaac agagggttaa aaacaaa 117<210>2<211>39<212>PRT<213>Unknown<220>
<223>The last amino acid is modified<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(39)..(39)<400>2Met His Ser Asp Gly Ile Phe Thr Asp Ser Tyr Ser Arg Tyr Arg Lys
1 5 10 15Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Ala Ala Val Leu Gly Lys Arg Tyr20 25 30Lys Gln Arg Val Lys Asn Lys3权利要求
1.一种垂体腺苷酸环化酶激活多肽衍生物PDT，其氨基酸序列如序列表所示，其特征在于它的羧基端通过硫酯键连接一个β-巯基乙醇分子，该分子结构见附图1。
2.一种生产权利要求1垂体腺苷酸环化酶激活多肽衍生物PDT的方法，步骤如下(1)设计引物，采用PCR的方法人工合成垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因；(2)将合成的垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因克隆到质粒载体中，构建成功重组表达载体，在宿主菌中进行表达，其表达产物是由垂体腺苷酸环化酶激活多肽、内含肽和几丁质结合域构成的融合蛋白；(3)收集表达产物，过层析柱进行亲和层析，再洗去杂蛋白，再用诱导剂过层析柱，诱导内含肽切割融合蛋白，得到垂体腺苷酸环化酶激活多肽衍生物或水解产物的混合物。
3.如权利要求2所述垂体腺苷酸环化酶激活多肽衍生物PDT的生产方法，其特征在于人工合成垂体腺苷酸环化酶激活多肽基因，其基因序列如序列表所示。
4.如权利要求2所述垂体腺苷酸环化酶激活多肽衍生物PDT的生产方法，其特征在于所述的质粒载体是pTYB1。
5.如权利要求2所述垂体腺苷酸环化酶激活多肽衍生物PDT的生产方法，其特征在于所述的重组表达载体是pTY-PDT。
6.如权利要求2所述垂体腺苷酸环化酶激活多肽衍生物PDT的生产方法，其特征在于所述的宿主菌是大肠杆菌ER2566。
7.如权利要求2所述垂体腺苷酸环化酶激活多肽衍生物PDT的生产方法，其特征在于所述的层析柱是几丁质柱。
8.如权利要求2所述垂体腺苷酸环化酶激活多肽衍生物PDT的生产方法，其特征在于所述的诱导剂是β-巯基乙醇。
9.权利要求1所述的垂体腺苷酸环化酶激活多肽衍生物PDT在制备治疗脑损伤、脑缺血、防止神经细胞死亡、抗炎、男性阳痿、性冷淡、不孕不育、神经痛、神经病、神经混乱、焦虑症、记忆损伤、痴呆、认知混乱、中枢神经系统疾病、偏头痛、神经畏缩、心肌缺血、心肌梗死/纤维化、动脉硬化、糖尿病、肌畏缩症、胃溃疡、高血压、内毒性休克、血栓症、视网膜病变、心血管疾病、肾衰竭、心衰竭疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种腺苷酸环化酶激活多肽衍生物，该衍生物其氨基酸序列如序列表所示，其特征在于它的氨基端添加一个甲硫氨酸(Met)，羧基端通过硫酯键连接一个β－巯基乙醇分子；该腺苷酸环化酶激活多肽衍生物及其系列水解产物混合物与天然或化学合成的腺苷酸环化酶激活多肽相比，具有相同的活性但有更高的稳定性。本发明还提供了该衍生物的生产方法。
文档编号A61P9/00GK1557835SQ20041001513
公开日2004年12月29日 申请日期2004年1月15日 优先权日2004年1月15日
发明者洪岸, 余榕捷, 洪 岸 申请人:暨南大学