专利名称：S190多肽疫苗的制备方法及其在抗sars病毒中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物疫苗的制备方法，特别是涉及一种SARS多肽疫苗的制备方法。属于生物疫苗制备技术领域。
背景技术：
严重急性呼吸窘迫征(sever acute respiratory syndrome，SARS)是由SARS冠状病毒引起的一种急性传染病。SARS冠状病毒基因组含有5个主要编码区，包括蛋白复制酶、表面蛋白(S)、衣壳蛋白(E)、膜蛋白(M)及核蛋白(N)，该病毒同时还含有多个小的编码读框。以上结构蛋白在病毒侵入、病毒颗粒形成和释放等方面都发挥着重要作用[1-3]。最近的研究表明，S蛋白可与细胞膜上的ACE2(angiotensin-converting enzyme 2)SARS受体结合，并由此途径感染细胞；N蛋白能与病毒RNA结合，稳定RNA并参与完成病毒颗粒的包装。N蛋白还具有很强的免疫原性，能诱导机体产生很强的保护性细胞免疫反应[4，5]。目前，SARS疫苗的研制是SARS研究的最重要的课题，本研究利用上述S蛋白和N蛋白的生物学特征发现了一种新的SARS疫苗的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的SARS多肽疫苗的制备方法。
本发明是采取以下的技术方案来实现的S190多肽疫苗的制备方法，它包括下列步骤
(1)以SARS冠状病毒基因组中的S蛋白片段(318-510AA)为目标蛋白(称之为S190)；(2)经重组表达获得蛋白的抗原，即S190多肽疫苗；(3)诱导出中和抗体。
本发明还可以采取以下的技术方案来进一步实现前述的S190多肽疫苗的制备方法，其特征在于其中所述的S190多肽疫苗还可以用下述方法进一步处理(1)以SARS冠状病毒基因组中的S蛋白片段(318-510AA)SARS冠状病毒基因组中的N蛋白片段(1-121AA)融合，融合片段称之为NS190；(2)经重组表达获得蛋白抗原NS190，即NS190多肽疫苗；(3)诱导出中和抗体。
前述的S190多肽疫苗在抗SARS病毒中的应用。
前述的NS190多肽疫苗在抗SARS病毒中的应用。
众所周知，任何疫苗的开发和研制，最关键的就是能诱导出抗病毒中和抗体和/或特异性细胞毒T淋巴细胞。在SARS疫苗的研制中，主要有灭活病毒疫苗和基因工程疫苗。据申请人所知我国目前正在研制灭活病毒疫苗，但该方法在制造危险性、免疫效果以及对流行病学免疫检测的干扰方面都存在着局限性。国外正积极地开展基因工程疫苗的研制，其中，美国是将含有S全基因和N全基因以及其他基因组成分通过腺病毒载体[6]，免疫动物后可得到具有保护作用的中和抗体，但该方法也存在有明显的缺点。首先，以腺病毒为载体的疫苗目前还没有成功应用于临床的先例，再者，目前对S全基因和N全基因以及其他基因组的功能尚不完全明了的情况下，该疫苗的应用后的副作用很难预测。因此基因工程多肽疫苗仍为目前较为理想的疫苗方式。对于SARS疫苗的研制，申请人认为如果将能与ACE-2受体结合的S片段(S190)作为疫苗抗原，所得到的抗体应能与SARS病毒表面的S蛋白结合，阻止病毒与靶细胞的结合，封闭病毒感染途径，从而达到预防感染的作用。为了加强S190的免疫原性，将N蛋白片段与S190融合，所得到的融合蛋白具有更强的免疫效果。根据以上结果，申请人提出了本发明的SARS多肽疫苗制备方法。
图1是S190片段的DNA序列及其在大肠杆菌中的表达和纯化蛋白标准-1，纯化S190-2，全菌蛋白-3，对照-4，S190片段的DNA序列-16；图2是S190与N蛋白融合片段(NS190)的基因序列及其在大肠的表达和蛋白纯化未诱导-5，诱导后-6，纯化后-7；图3是抗S190及抗NS190抗体阻断S蛋白与Vero细胞的结合1∶10抗S190抗体--8，1∶50抗S190抗体-9，1∶100抗S190抗体-10，1∶500抗S190抗体-11，1∶10抗NS190抗体-12，1∶100抗NS190抗体-13，1∶1000抗NS190抗体-14，1∶5000抗NS190抗体-14，1∶10对照鼠抗体-17；具体实施方式
如图1-3所示S190多肽疫苗和NS190多肽疫苗的制备方法，它包括下列步骤1、S190基因片段的克隆、表达及纯化
本发明所用的SARS病毒序列均以Tor2的序列为蓝本进行全基因合成和片段扩增。PCR扩增引物为PS15’-CATATGAATATTACAAACTTGTG-3’； PS25’-GGATCCTTAAACCGTGGCCGGTGC-3’，模板为含有S蛋白全基因的pcDNS质粒，经94C3min，[94C30seconds，55C30seconds，72C40seconds]34循环，72C5min。由此扩增得到约570bp的小片段，将该片段克隆入pMD18-T载体中，筛选得到阳性克隆，经测序证实所得序列完全正确，如图一。
将含有S190片段的pMD18-T载体用NdeI/BamH I酶切，释放S190片段，并与pET24a(Nde I/BamH I)载体连接，筛选得到重组克隆，将重组质粒再导入BL21(DE3)大肠杆菌，经IPTG诱导得到高表达的重组S190蛋白。将IPTG诱导后的细菌用常规超声波/8M尿素方法裂解，其裂解液经DEAE-Sephorose FF和CM-Sephorose FF两步纯化得到纯化蛋白，经SDS-PAGE电泳鉴定其纯度，达98％，如图一。
2、S190与N蛋白片段的融合蛋白(NS190)的表达和纯化首先以PS1和PS2(同上)为引物，以pcDNS为模板，用Pyrobest酶扩增出570bp的平端PCR片段，用BamHI单酶切后得到一个粘性末端。用Hind III酶切pETfn质粒[3]经Klenow酶补平后，再用BamHI酶切去除小片段，回收载体片段。将PCR片段与载体片段连接后得到能表达NS190的重组质粒pNS190。经测序证实融合基因得序列正确，如图二。用该质粒转化BL21(DE3)，经IPTG诱导后，获得NS190的高效表达。表达率达30-40％(重组蛋白占全菌蛋白的比例)，如图二。将诱导后的重组菌用超声波/8M尿素的方法裂解细菌，裂解液经DEAE-Sephorose FF和CM-Sephorose FF两步法纯化后，收集目的峰，所得蛋白纯度达98％.
3、S190和NS190诱导中和抗体的产生分别用纯化的S190蛋白和NS190蛋白免疫C3H/He小鼠，实验分4组即，1.S190蛋白组；2.S190+福氏佐剂；3.NS190蛋白组；4.NS190蛋白+福氏佐剂。每组蛋白用量为0.1mg/每鼠/每次，每周注射一次，连续3周。然后，眼球取血，收集血清，用ELISA法检测抗体效价。结果证实单纯S190蛋白和NS190蛋白均能诱导出抗体，效价分别为1∶200-1∶1000和1∶500-1∶4000；用福氏佐剂与蛋白混合免疫后的效价均＞1∶3000，分别为1∶3000-1∶6000和1∶4000-1∶10000.
4、抗S190抗体和抗NS190抗体对S蛋白与ACE2 SARS受体的结合封闭作用用含S190蛋白(0.1mg/ml)的DMEM培养基与Vero细胞孵育，同时加入不同浓度梯度的抗体，孵育30分钟后，用PBS洗涤三次，收集细胞，裂解后采用Western Blot检测S190蛋白在细胞上的结合量.结果显示无关血清不能阻止S蛋白与Vero细胞的结合，而用S190和NS190蛋白免疫得到的抗血清能明显降低S蛋白的结合活性.在血清滴度＜1∶100-1∶500时，几乎可以完全阻断之，如图三。
权利要求
1.S190多肽疫苗的制备方法，它包括下列步骤(1)以SARS冠状病毒基因组中的S蛋白片段(318-510AA)为目标蛋白；(2)经重组表达获得蛋白的抗原，即S190多肽疫苗；(3)诱导出中和抗体。
2.根据权利要求1所述的S190多肽疫苗的制备方法，其特征在于其中所述的S190多肽疫苗还可以用下述方法进一步处理(1)以SARS冠状病毒基因组中的S蛋白片段(318-510AA)SARS冠状病毒基因组中的N蛋白片段(1-121AA)融合；(2)经重组表达获得蛋白抗原NS190，即NS190多肽疫苗；(3)诱导出中和抗体。
3.S190多肽疫苗在抗SARS病毒中的应用。
4.NS190多肽疫苗在抗SARS病毒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种S190多肽疫苗的制备方法及其在抗SARS病毒中的应用，本发明是采取以下的技术方案来实现的(1)以SARS冠状病毒基因组中的S蛋白片段(318－510AA)为目标蛋白；(2)经重组表达获得蛋白的抗原，即S190多肽疫苗；(3)诱导出中和抗体。本发明将能与ACE－2受体结合的S片段(S190)作为疫苗抗原，所得到的抗体能与SARS病毒表面的S蛋白结合，阻止病毒与靶细胞的结合，封闭病毒感染途径，从而达到预防感染的作用。
文档编号A61P31/00GK1608673SQ200410014959
公开日2005年4月27日 申请日期2004年5月20日 优先权日2004年5月20日
发明者朱敏生, 高翔 申请人:南京大学