专利名称：作为预防和治疗各种神经退行性疾病(特别是老年性痴呆症)药物的丹参素及其钠盐的制作方法
背景技术：
神经退行性疾病包括老年性痴呆症(阿尔茨海默氏病)、帕金森氏病、Huntington氏病等。随着人口的老龄化，神经退行性疾病，特别是老年性痴呆症发病率日渐升高，已经发展成为人类公共卫生的重大难题之一。
预防和治疗老年性痴呆症的药物有胆碱能前体物质，胆碱酯酶抑制剂、胆碱能激动剂、儿茶酚胺类药物、5-羟色胺能药物、多种类型的神经递质、神经肽类、雅片类拮抗剂(如纳络酮)、抗氧化剂和神经保护剂、神经营养物、激素(如他克林、雌激素)、代谢增强药、生物膜调节剂、抗炎药、解毒剂、抗淀粉样蛋白药物等，中药有效成分如石杉碱甲、银杏叶提取物、儿茶酸、芹菜甲素、人参皂苷、绞股兰皂苷等。但迄今为止，没有任何药物、任何疗法取得满意的疗效。因此，寻找新的有效预防和治疗老年性痴呆症的疗法或药物是一项迫切的任务。
本发明涉及作为预防和治疗各种神经退行性疾病(特别是老年痴呆症)的药物使用的丹参素及其钠盐。
丹参素(Danshensu)，D-(+)β-(3，4-二羟基苯基)乳酸，3-(3，4-dihydroxyphenyl-2-hydroxy-Propanoic acid，结构式如
图1，分子式C5H10O5，相对分子量162.14。丹参素苯环上的两个羟基是功能基，可清除自由基，抑制氧化反应和自由基反应。
丹参素为白色长针状结晶，熔点84-86℃。其钠盐丹参素钠为白色针状结晶，熔点255～258℃。丹参素钠较稳定，丹参素转化为丹参素钠后制备时纯度容易提高。
丹参素的制备1、常采用水煮醇沉法自唇形科植物丹参(Salviamiltiorrhiza Bge.)中提取分离；2、化学合成先用乙烯酮类化合物乙酰化的方法合成1-(3，4-二羟基苯基)乳酸，而后采用Clemmensen还原法将α-酮酸还原为α-羟基酸而制备丹参素；3、丹参素衍生物的合成丹参素为酚酸，易氧化，不稳定，故采用合成丹参素衍生物的方法克服之。用相应的芳香醛和乙酰甘氨酸反应得到噁唑酮，继而经酸催化开环，水解得到取代苯基丙酮酸，再经Clemmensen还原法得到相应取代苯基乳酸。
作为一种活血化瘀中药的有效成分，中国学者已对丹参素的药理作用进行了广泛深入的研究，其主要成果归纳如下。
丹参素及其钠盐显著增加离体豚鼠的冠状血流量，舒张离体猪冠状动脉，对抗吗啡及心得安的缩血管作用，对抗或显著保护由垂体后叶素引起的大鼠S-T段缺血性心电变化，明显缩小狗心肌梗塞的范围和改善左心室功能，促进缺血性心肌损伤细胞的修复，改善心脏及外周微循环障碍；丹参素及其钠盐抑制ADP诱导的兔血小板聚集，使血小板粘附性降低，降低血液粘度，抑制血小板的合成，显示抗血栓形成和抗凝血作用；丹参素及其钠盐激活纤溶，促进纤维蛋白(原)降解，抑制由氯化钾激发的红细胞的钙内流，稳定红细胞膜，具有抗溶血作用；丹参素及其钠盐可抑制环核苷酸磷酸二酯酶的活力，提高脑内环核苷酸的水平，产生中枢镇静作用，使小鼠安静、自主活动减少，与巴比妥类及非巴比妥类合用可增强其催眠效果，可对抗苯丙胺的精神运动性兴奋作用；丹参素能直接刺激肝细胞增殖，且其作用显示一定的量效依赖关系；丹参素及其钠盐对D-半乳糖胺引起的肝细胞损伤及自由基毒性作用研究表明，丹参素具有稳定细胞膜、清除自由基的作用。丹参素及其钠盐已经作为复方丹参制剂或丹参制剂中的主要成分广泛应用于心、脑血管疾病的防治。
丹参素的药代动力学血浆中丹参素回收率平均为(76.470±2.427)％(cv＝3.174％，n＝20)；血药浓度-时间(1gc-t)曲线显示，丹参素的药代动力学为单室模型，其清除速率常数和生物半衰期为kel＝(0.0456±0.0141)/min；t1/2＝(16.580±5.768)min。用HPLC法对丹参素在家兔体内组织分布进行的研究表明，静脉注射丹参素在各组织分布的平均值为肾14.15μg·g-1，肝17.69μg·g-1，肺19.73μg·g-1，心12.30μg·g-1，脑5.15μg·g-1，脾4.66μg·g-1。
发明概要本发明涉及丹参素及其钠盐作为预防和治疗各种神经退行性疾病的药物组合物，该药物组合物包括丹参素及其钠盐和可药用的载体。
本发明涉及如权利1要求所定义的药物的组合物的制备方法，该方法包括丹参素及其钠盐与可药用的载体混合或溶解。
丹参素及其钠盐可与任何可药用的载体混合或溶解，如经皮肤、粘膜、胃肠内和胃肠外给药的可药用载体。该药物以常规药用制剂的形式使用，如固体形式的片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂、扁囊剂、拴剂等，或半固体形式的油膏、软膏等，或结晶性粉末状针剂和液体形式的针剂、悬浮剂、糖浆剂、乳剂及搽剂，该药物中使用可药用的赋形剂和添加剂，这些可药用的赋形剂和添加剂包括无毒的可相容的填料、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、矫味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂、稳定剂等。如乳糖、柠檬酸、硬脂酸、硬脂酸镁石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、花生油、可可脂、乙二醇、葡萄糖、盐酸普鲁卡因、盐酸利多卡因及抗坏血酸等。该药物可按各种制剂的常规工艺制备。
本发明涉及丹参素及其钠盐作为预防各种神经退行性疾病(特别是老年性痴呆症)的药物，可作为食品添加剂加入到食品中。本发明涉及丹参素及其钠盐作为治疗各种神经退行性疾病，如老年性痴呆症等的药物。所制成的各种口服药物中丹参素及其钠盐钠的剂量为每日每kg体重大约0.1-100mg，优选约0.05-50mg，更优约0.1-20mg，最佳约1-5mg。每日分2-4次服用，10-30天为一疗程，一般用药3-10个疗程，每个疗程间隔5-30天。所制成的注射用药物，可供肌肉注射、静脉注射及静脉点滴，其中丹参素及其钠盐钠的剂量为每日每kg体重0.01-50mg，优选约0.05-25mg/kg，更优约0.1-10mg，最佳约1-3mg。每日分1-3次使用，10-30天为一疗程，一般用药3-10个疗程，每个疗程间隔5-30天。然而，精确的剂量及持续时间应由医生确定，主要取决于病人的年龄、体重、病情及反应等。
下面列举实验研究的内容及其结果，作为丹参素及其钠盐可用于制备预防和治疗神经退行性疾病(特别是老年性痴呆症)药物的证据。
1.丹参素钠对谷氨酸单钠(MSG)诱导海马神经元损伤的保护作用。
材料和方法药物MSG，丹参素钠。
海马神经元的培养基培养基(种植液)为Dulbecco’smodified Eagle’s medium(DMEM)，补充胎牛血清10％、马血清10％、谷氨酰胺1％。饲养海马神经元的培养基为DMEM，补充马血清10％，N-21％，B-272％，谷氨酰胺1％。
海马神经元的分离和培养取当天新生Wistar大鼠，剥离海马，剪成1-2mm组织块，用含0.25％胰蛋白酶的解剖液在37℃消化30分钟，吹打，使之均匀分散，制成细胞悬液。加入适量种植液，将细胞按1×105/ml的密度接种在事先涂有多聚赖氨酸的35mm培养皿中，置于36℃ 10％CO2的培养箱中培养。24h后将种植液换为2mL饲养液。以后每3日半量换液1次。为抑制非神经元过度增殖，在培养的第3日向培养基中加入阿糖胞苷3μg·mL-1。
谷氨酸对神经元的毒性和丹参素钠的保护作用将对数生长期细胞消化后，制成细胞悬液接种于96孔培养板，每孔90μl(含2×104细胞).培养24h，前后隔1h加入不同浓度的丹参素钠和MSG溶液10μl，对照组加入同体积神经元培养液，每组设4个平行孔。充分混匀后，继续培养24、48、72h，MTT法、荧光显微术(PI-Hoechst双染法)、吖啶橙/溴乙锭(AO/EB)荧光染色、流式细胞术、DNA断裂片段分析术等判断细胞存活及细胞凋亡情况。
结果 丹参素钠能部分、大部甚至几乎全部抵消MSG对神经元的毒性损伤及其诱导的细胞凋亡作用，丹参素钠的此种保护作用取决于剂量及其作用时间。
2.丹参素钠对β-淀粉样蛋白诱导的大鼠PC12细胞损伤的保护作用。
材料和方法药物MSG，丹参素钠，β-淀粉样蛋白(Aβ)，Aβ25-35。Aβ贮备液以0.1％三氟乙酸配制成10mg/ml的溶液保存。
PC12细胞株起源于大鼠嗜铭细胞瘤，可分化为交感神经样细胞，在形态、生理、生化方面接近于神经元。PC12细胞具有神经分泌细胞和神经元的性质，广泛用于神经元死亡方式及神经毒方面的研究。
PC12细胞的培养用RPMI-CM培养基常规培养。RPMI-CM为补充以10％胎牛血清，5％马血清，1％谷氨酰胺的RPMI-1640。以含100ng/ml神经生长因子(mNGF 2.5s)的RPMI-CA培养6天，PC12细胞即分化为具有神经元表型的细胞。加入β-淀粉样蛋白(Aβ)的全长(Aβ1-40)及其氨基酸残基25-35之间的细胞毒序列Aβ25-35。
Aβ25-35对神经元的毒性和丹参素钠的保护作用分化的PC12细胞制成细胞悬液接种于96孔板，以不同浓度的Aβ1-40或Aβ25-35和丹参素作用不同时间，MTT法、荧光显微术(PI-Hochest双染法)、流式细胞术、DNA断裂片断分析术等判断细胞存活及细胞凋亡情况。
结果丹参素钠能部分、大部分甚至几乎全部抵消Aβ25-35对分化的PC12细胞的损伤，丹参素钠的此种保护作用依赖于其作用时间及剂量。
3.丹参素钠对MSG诱导的成年小鼠脑损伤的保护作用材料动物昆明种小鼠，雌雄各半，8周龄。
药物MSG，丹参素钠。。
仪器Y-迷宫，DMS-Z型Morris水迷宫仪，XDB-Z小鼠洞板实验仪，ZIL-Z小鼠自主活动程序自动控制仪，上述仪器均购自中国医学科学院药物研究所。
方法小鼠随机分为正常对照组、MSG组、药物对照组、实验组，每组14只动物。MSG组按MSG 3mg/g体重灌胃，药物对照组按60mg/kg体重腹腔注射丹参素钠，实验组在按MSG 3mg/g体重灌胃的同时按0.06mg/kg体重腹腔注射丹参素钠，上述处理每天1次，共计10天。末次注射后12h从每组随机取4只动物，腹腔注射戊巴比妥钠(0.06mg/kg体重)麻醉，用10％福尔马林溶液作心脏灌流牺牲小鼠。断头取脑，置相同浓度福尔马林溶液中固定1周。石蜡包埋，作10m连续切片，每100m取1片。焦油紫染色，光镜检查。各组剩下的小鼠于末次注射后的第1日、第31日、第61日和第91日分别进行4次行为学检查，检查小鼠的学习记忆能力，自主活动及其类型，探究行为，爬绳能力等。
结果行为检查结果显示，正常对照组与药物对照组小鼠的学习记忆和爬绳能力，自主活动及探究行为4次检查均明显无差别；MSG组小鼠的学习记忆、爬绳能力及探究行为，前3次检查，较之对照组都显著降低，差异非常显著(P＜0.05)，第4次(即第91日)检查有一定提高，但差异仍显著(P＜0.05)，与之相反，MSG小鼠的自主活动前3次检查都明显增加，差异非常显著(P＜0.01)，第4次(即91日)检查则接近正常(P＞0.05)。值得注意的是，4次行为检查结果都显示，实验组(MSG+丹参素钠)小鼠的各种行为学检查指标与正常对照小鼠无明显差别(P＞0.05)。形态学检查结果显示，药物对照组小鼠海马区神经细胞形态与正常对照组无明显差别， MSG组小鼠海马区神经细胞则明显变性，坏死，而MSG+丹参素钠处理的实验组小鼠海马区细胞形态与正常组小鼠的接近，无明显差别。
4.丹参素钠对Aβ25-35诱导的小鼠脑损伤的保护作用材料动物昆明种雄性小鼠，28±2克。
药物MSG；Aβ25-35(sigma公司)，1mg加生理盐水1ml溶解；丹参素钠。
仪器DM5-Z型Morris水迷宫仪，中国医学科学院药物研究所制造。方法Aβ25-35在37℃孵化箱中老化96小时，使之成为毒性凝胶态Aβ。动物随机分为4组假手术组，模型组(Aβ25-35组)、三种剂量(0.01mg/kg，0.04mg/kg，0.08mg/kg)丹参素钠组。假手术组小鼠侧脑室注射生理盐水3μl，其他四组小鼠侧脑室注射凝聚态Aβ25-353μl。丹参素组在Aβ25-35注射后1h开始每日腹腔注射不同剂量的丹参素钠溶液，连续给药20天，假手术组和模型组每天腹腔注射等量生理盐水。小鼠侧脑室注射Aβ25-35后第16天开始对小鼠进行Morris水迷宫测试，连续5天，每天训练两个时限。实验时温度保持在24-25℃。Morris水迷宫中加入奶粉2斤，用热水冲开，再用水加至高过安全平台1cm，务使奶水中不能见到安全平台，并使水温保持在22℃。
结果用Morris水迷宫测定小鼠定向学习记忆能力，即寻找安全台的潜伏期。结果发现，在1-4天训练期，给药组与假手术组，模型组间无明显差异，第5天后表现出的差异即相当明显。丹参素钠腹腔注射对Aβ25-35对小鼠脑的损伤呈现明显的保护作用，且这种保护作用呈剂量依赖性。
表1丹参素钠对Aβ25-35诱导的小鼠定向学习记忆损害的保护作用
*与Aβ25-35组比较5.丹参素钠对MSG+Aβ诱导的成年小鼠脑损伤的保护作用动物昆明种小鼠，雌雄各半，8周龄。
药物同4。
仪器DM5-Z型Morris水迷宫仪，中国医学科学院药物研究所制造。
方法动物随机分为4组假手术组，Aβ+MSG组，Aβ+MSG+丹参素(0.02mg/kg)组，Aβ+MSG+丹参素(0.06mg/kg)组。假手术组小鼠侧脑室注射生理盐水3μl，其他4组小鼠侧脑注射凝聚态Aβ25-353μl，Aβ+MSG组则在Aβ25-35注射后8小时灌胃给予MSG溶液，Aβ+MSG+丹参素组则在MSG给予后1h腹腔注射丹参素钠溶液(0.02mg/kg、0.06mg/kg)。Aβ25-35仅给药1次，MSG、丹参素钠共给药8天，每日1次。Aβ25-35给药后第9天开始对小鼠进行Morris水迷宫测试，条件同4。
结果发现在1-4天训练期给药组与假手术组、模型组无明显差异，第5天后表现出的差异即相当明显，丹参素钠可保护MSG+Aβ25-35对小鼠脑的损伤，且该作用呈剂量依赖关系。
6.丹参素钠对脑缺血小鼠学习记忆和记忆获得功能的影响动物昆明种小鼠，28±2g。
药品丹参素钠。
仪器程控小鼠避暗实验仪。
方法小鼠随机分为假手术组，手术组，实验(手术+给药)组。在小鼠清醒状态下阻断双侧颈总动脉5分钟(造成全脑缺血！)，在阻断颈总动脉前5分钟实验组按0.04mg/kg腹腔注射丹参素钠，手术组和假手术组则腹腔注射同体积生理盐水，以后每日注射1次，共注射10次。末次注射后饲养24小时进行第一次训练。训练时将小鼠面部背向洞口放入明室，同时启动记时器。动物穿过洞口进入暗室受到电击(AC，36V)，记时自动停止。取出小鼠，记录每鼠从明室进入暗室遇到电击所需的时间，此即潜伏期。24小时后重作测验，记录进入暗室的动物数，潜伏期和5分钟内的电击数。
结果假手术组的学习和记忆获得功能与正常无明显差异；手术组的记忆获得功能障碍非常明显，表现为潜伏期短，错误次数多；实验(手术+给药)组小鼠潜伏期延长，错误次数减少，接近假手术组。
表2 丹参素对小鼠脑缺血所致学习记忆障碍的保护作用
*与相应的对照组比较，P＜0.017.丹参素钠治疗老年性痴呆症的临床初步观察药物丹参素钠胶囊(50 mg/粒)。
诊断标准按照美国精神疾病诊断和统计手册第IV版(DSM-IV)(1994)诊断标准确诊病例，根据国际疾病分类第十版，简易精神状态检查和CDR量表作出痴呆(轻、中和重)严重程度的诊断。
观察对象汉族，男10人，女10人，年龄60-70岁，轻度痴呆12人，中度痴呆8人。
试验方法按双盲法进行试验。上述确诊病人按病情配对分为2组，一组服安慰剂，另一组服用丹参素钠胶囊(50mg/粒)，每次1粒，每日3次，连续1月，停药1周后再继续下一疗程。所有病人均治疗3个疗程，整个观察治疗过程持续6月。治疗前后按长谷川量表进行认知功能检查，按日常生活功能水平量表(ADL)进行生活能力检查，按Hamilton抑郁量表检查抑郁量。
结果服药组除个别病人(1/10)的病情停留在原水平外，其余(9/10)病人的病情都有不同程度的改善认识功能检查得分增加，生活能力增强，睡眠改善。未发现不良药物反应。服安慰剂组病人病情未见改善迹象。
典型病例介绍郭××，男，61岁，近记忆障碍，表现为辅助记忆障碍，间隔5分钟后不能复述3个词或三件物品名称，远记忆不受影响。认知功能损害还表现为找词困难，一分钟内能说出的动物名称数少于十个。身体生活自理能力和工具性日常生活自理能力评分为1级(完全可以由自己完成)。Hamilton抑郁量检量(5级4分法)抑郁情绪(轻度，在访谈时自发陈述)；入睡困难(上床半小时不能入睡)、入睡不深(睡眠浅，多恶梦)、半夜多次醒来、早醒等多种睡眠障碍；对活动、工作兴趣减低；检查中发现轻度阻滞(思想和言语缓慢，注意力难以集中，主动性减退)；问及时才诉述精神焦虑，出现口干、腹胀、尿频等躯体性焦虑症状；上述认知功能障碍明显干扰了其职业和社交活动；上述损害不能用其他的精神和情感性疾病(如抑郁症、精神分裂症等)来解释；CT检查发现轻度脑萎缩。郭××在确诊后即开始口服丹参素钠胶囊(50mg/粒)，每次1粒，日服3次。1周后睡眠改善，上床后半小时内能入睡，睡眠深，半夜不醒或只上一次厕所，无早醒；半月后精神焦虑及躯体焦虑症状(口干、腹胀、尿频)等消失；丹参素钠治疗4个疗程，即6个月后检查，近记忆障碍有改善，间隔5分钟能复述3个词或3件物品名称，找词困难减轻，一分钟能说出动物名称12-15个。对活动、工作的兴趣恢复；注意力集中，主动性恢复，惟思想和言语仍较缓慢。一年后检查病情稳定，CT检查仍为轻度萎缩。
实施例下面的配方举例说明了本发明的剂型。
实施例1片剂NO 组分 用量mg/片mg/片1丹参素钠 50 1002乳糖USP 122 1233玉米淀粉，食品级，呈 30 4010％的纯水浆状物4米淀粉，食品级 95 1305硬脂酸镁 37合计 300 400制造方法在适当的混合机中混合第1项和第2项组分15分钟，第3组分与混合物粒化。如果需要，通过一个初筛研磨潮湿的颗粒，并使之干燥。如果需要，将干燥的颗粒过筛，并与第4项混合10-15分钟。加入第5项混合1-3分钟。在适当的压片机中将混合物压成适当的尺寸和重量。
实施例2胶囊剂NO组分 用量mg/粒mg/粒1 丹参素钠501002 乳糖USP 106 1203 玉米淀粉，食品级40734 硬脂酸镁NF 4 7合计 200 300制造方法将第1、2和第3项在适当的混合机中混合10-15分钟，加入第4项混合1-3分钟。在适当的包囊机上将该混合物装入适当的胶囊中。
实施例3注射液丹参素钠 100g或250g葡萄糖 400g或250g注射用水 加至10000ml
权利要求
1.丹参素及其钠盐用于制备预防和治疗各种神经退行性疾病(特别是老年痴呆症)的药物。
全文摘要
本发明涉及丹参素及其钠盐用于制备预防和治疗各种神经退行性疾病(特别是老年痴呆症)的药物。丹参素，分子式C
文档编号A61K31/185GK1679528SQ200410033198
公开日2005年10月12日 申请日期2004年4月6日 优先权日2004年4月6日
发明者于廷曦, 马润娣, 于立坚 申请人:于廷曦