专利名称：新城疫新型粘膜疫苗及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种新城疫疫苗以及构建的方法。
现有技术新城疫是危害养禽业的主要传染病之一，被国际兽疫局(OIE)列为A类烈性传染病。目前，我国对于新城疫的防制主要采用各种不同毒力的弱毒疫苗和油乳剂灭活疫苗等传统疫苗进行免疫预防。但是有些弱毒疫苗保留了部分毒性，对雏鸡仍有一定的致死率，而且弱毒苗还能引起鸡呼吸道的温和病变，增强了对其它病原的易感性。灭活疫苗虽然能产生高水平的循环抗体，但是不能刺激机体产生细胞免疫和粘膜免疫，且需要注射免疫，费时费力。另外，常规疫苗生产成本较高，免疫接种还会受到母源抗体的干扰。因此，寻求一种廉价、更为安全有效且使用方便的疫苗，对于新城疫的综合防制具有重要的现实意义。
发明内容
本发明目的在于发明一种可经粘膜途径接种的新城疫新型粘膜疫苗。
新城疫病毒DNA疫苗的DNA长度为4647bp，其DNA排序为gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttcaa 720tatgggctcc agaccttcta ccaggatccc agcacctctg atgctgatca cccggattat 780
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另外，本发明还对具有上述特征的新城疫新型粘膜疫苗提供构建方法，即先通过反转录-聚合酶链式RT-PCR反应，扩增出新城疫病毒融合蛋白F基因；再将F基因与质粒pVAX1进行连接反应，构建DNA疫苗pVAX1-F；最后将质粒pVAX1-F转化进减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中。上述新城疫病毒融合蛋白F基因的扩增引物是上游引物5′taagcttcaatatgggctccagacct 3′下游引物5′cgaattctccacctcttatctgcattcatgc 3′。
本发明采用以减毒鼠伤寒沙门氏菌运送新城疫病毒DNA疫苗，构建新城疫新型粘膜疫苗SL7207(pVAX1-F)。通过口服方式(饮水或拌料)对家禽(鸡、鹅、鸽等)直接进行免疫，较传统的新城疫弱毒疫苗安全，且较传统的新城疫油乳剂灭活疫苗使用方便，可克服母源抗体干扰以及油乳剂灭活疫苗不能产生粘膜免疫应答的缺陷，并能提供对新城疫病毒强毒攻击的保护。
上述新城疫病毒融合蛋白F基因长度为1662bp，其DNA排序为atgggctcca gaccttctac caggatccca gcacctctga tgctgatcac ccggattatg 60
ctgatgttgg gctgtatccg tccgacaagc tctcttgacg gcaggcctct tgcagctgca 120ggaattgtag taacaggaga taaggcagtc aatgtataca cctcgtctca gacagggtca 180atcatagtca agttgctccc gaatatgccc agggataagg aagcgtgtgc gaaagcccca 240ttagaggcat ataacagaac actgactact ttgctcactc ctcttggcga ctccatccgc 300aagatccaag ggtctgtgtc cacgtctgga ggaaggagac aaaaacgctt tataggtgct 360attattggca gtgtagctct tggggttgca acagcggcac agataacagc agctgcggcc 420ctaatacaag ccaaccagaa tgctgccaac atcctccggc ttaaggagag cattgctgca 480accaatgaag ctgtgcatga agtcaccgac ggattatcac aactatcagt ggcagttggg 540aagatgcagc agtttgtcaa tgaccagttt aataatacag cgcgagaatt ggactgtata 600aaaatcacac aacaggttgg tgtagaactc aacctatacc taactgaatt gactacagta 660ttcgggccac agatcacctc ccctgcattg actcagctga ccatccaggc actttataat 720ttagctggtg gcaatatgga ttacttatta actaagttag gtatagggaa caatcaactc 780agctcattaa ttggtagcgg cctgatcact ggttacccta ttctgtacga ctcacagact 840caactcttgg gcatacaagt gaatttgccc tcagtcggga acttaaataa tatgcgtgcc 900acctatttgg agaccttatc tgtaagtaca accaaaggat atgcctcagc acttgtcccg 960aaagtagtga cacaagtcgg ttctgtgata gaagagcttg acacctcata ctgtatagag 1020tccgatctgg atttatattg tactagaata gtgacattcc ccatgtcccc aggtatttat 1080tcctgtttga gcggcaacac atcagcttgc atgtattcaa agactgaagg cgcactcacc 1140acgccgtata tggcccttaa aggctcagtt attgccaatt gtaagataac aacatgtaga 1200tgtacagacc ctcctggtat catatcgcaa aattatggag aagctgtatc cctgatagat 1260agacattcgt gcaatgtctt atcattagat gggataactc tgaggctcag tggggaattt 1320
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2、新城疫病毒基因组RNA的制备1.5ml的新城疫病毒强毒JS5(本室分离)尿囊液沉淀用0.4ml磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮，转移至经DEPC处理过的指形管中，加入50μl经DEPC处理的10％SDS颠倒混匀，再加入500μl饱和酚混匀，于冰水浴中作用5min，4000rpm离心5min，吸取上清置于DEPC处理过的指形管中，分别加入5％体积的2M醋酸钠、5％体积的4M氯化锂及2.5倍体积的无水乙醇，混匀后置-20℃作用1h以上，12000-14000rpm离心15min，弃上清，将指形管置于超净台内挥发1h。
3、反转录用13μl经DEPC处理的超纯水溶解上述挥发干燥的RNA，于65℃水浴作用5min，迅速置冰水浴中作用5min，分别加入AMV RT 5×Buffer 5μl，10mmol/L dNTP 3μl，50pmol/L上游引物1μl，25U/μl AMV反转录酶2μl，40U/μl RNasin 1μl，混匀并短暂离心后，置42℃水浴作用1h，进行PCR。
4、PCRPCR反应体系为50μL反转录产物6μL10×缓冲液5μL上游引物(50pmol/L)1μL下游引物(50pmol/L)1μL高保真DNA聚合酶(2.5U/μL)0.5μL4种dNTP混合物(2.5mmol/L)2μL超纯水34.5μLPCR反应条件为94℃ 45S，46℃ 45S，72℃ 120S，共30个循环，结束后用浓度为0.8％琼脂糖电泳分离，回收长1696bp的F基因。
二、DNA疫苗pVAX1-F的构建回收的F基因用HindIII和EcoRI双酶切，同时用HindIII和EcoRI双酶切质粒pVAX1，然后将F基因与载体进行连接反应，体系如下F基因(HindIII-EcoRI)3μLpVAX1(HindIII-EcoRI)1μL连接缓冲液1μLT4 DNA连接酶(1U/μL)1μL超纯水4μL4℃连接16小时，然后转化大肠杆菌DH5α，涂布含卡那霉素的LB琼脂平板，37℃培养24小时后，挑取生长菌落LB液体培养，提质粒鉴定。
质粒先采用酶切鉴定，用HindIII和EcoRI双酶切，0.8％琼脂糖电泳观察到长约1.7kb的目的条带。然后将质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。测定结果表明，克隆的F基因全长1696bp，编码一个由553个氨基酸组成的前体蛋白F0，与已报道的NDV强毒株F基因的特征相符。证实DNA疫苗pVAX1-F构建正确。
三、新城疫新型粘膜疫苗的构建将DNA疫苗pVAX1-F转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207(美国斯坦福大学Stocker博士赠送)，涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板。37℃培养24小时后，挑取生长菌落LB液体培养，提质粒鉴定。质粒采用酶切鉴定，用HindIII和EcoRI双酶切，0.8％琼脂糖电泳观察到长约1.7kb的目的条带，证实DNA疫苗pVAX1-F已被成功导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中，构成以减毒鼠伤寒沙门氏菌运送的新城疫病毒DNA疫苗，其DNA疫苗的DNA长度为4647bp。
应用实验1、SL7207(pVAX1-F)对雏鸡的安全性试验结果将SL7207(pVAX1-F)分别以108CFU、109CFU、1010CFU口服接种1日龄商品代伊莎褐蛋鸡，每剂量组10只，同时设立口服PBS对照组10只。观察各组试验鸡的健康状况，2周后扑杀所有试验鸡，检查是否出现眼观病变。
实验结果显示，在观察期内，所有接种鸡均无任何不良反应。2周后扑杀，剖检没有发现在肝脏、脾脏等实质脏器上有眼观病变。
2、SL7207(pVAX1-F)对雏鸡的免疫效力试验结果1日龄商品代伊莎褐蛋鸡共分为4组，分别为重组菌SL7207(pVAX1-F)免疫组(109CFU/羽，30羽)，SL7207(pVAX1)免疫组(109CFU/羽，25羽)，油乳剂灭活疫苗免疫组(25羽)，空白对照组(25羽)。细菌免疫以口服方式进行三次，首免于1日龄进行，二免于2周龄进行，三免于4周龄进行，油乳剂灭活疫苗(扬州大学生物制品研究开发中心产品)于1日龄颈部皮下接种0.2ml/羽。各免疫组在首免后第14、28和35天分别经翅静脉采血，每组各采10只，室温静置，分离血清；同时，每组剖杀两只试验鸡采集完整的小肠，去除多余的脂肪，于5ml PBS(含100μg/ml PMSF)中用剪刀将肠道剖开，剪成1cm小段，置于100ml瓶中剧烈摇振5min，4℃ 8000rpm离心20min取上清，制备肠道粘膜样品，通过间接ELISA方法测定F蛋白特异的血清和粘膜抗体效价。分别于第1天和第35天称量各试验组所有鸡只的体重，观察其增重情况。于三免后10天用新城疫标准强毒株F48E8以滴鼻途径对鸡群进行攻毒，攻毒剂量为8×104EID50，攻毒后每天观察鸡的反应，连续观察14天，统计各组的存活数，计算免疫保护率。于攻毒后第14天，扑杀所有存活鸡，观察攻毒后试验鸡的大体病变；采集试验鸡的肠道、气管、法氏囊、胸腺等脏器，以10％中性福尔马林固定，制备上述脏器的石蜡组织切片，部分组织经H.E.染色后，观察相应的病理变化。
实验结果显示，疫苗SL7207(pVAX1-F)免疫不影响鸡的增重。疫苗SL7207(pVAX1-F)免疫既能激发鸡产生血清抗体，又能激发鸡产生局部粘膜抗体，而油乳剂灭活疫苗免疫鸡没有产生局部粘膜抗体。疫苗SL7207(pVAX1-F)免疫能抵抗鸡母源抗体的干扰，并提供鸡对新城疫病毒强毒攻击良好的免疫保护作用，免疫保护率与油乳剂灭活疫苗试验组相当。SL7207(pVAX1-F)免疫组攻毒鸡的腺胃肌胃、肠道、盲肠扁桃体、脾脏、法氏囊、胸腺及气管未见大体病变和组织学病变，而SL7207(pVAX1)空载体组攻毒鸡上述脏器可见明显的大体病变和组织学病变。
附表1 疫苗SL7207(pVAX1-F)免疫对雏鸡增重的影响组别 鸡只数 5周龄平均体重(kg)SL7207(pVAX1-F) 22 0.413±0.047空白对照 16 0.438±0.041SL7207(pVAX1) 17 0.427±0.044油 苗 18 0.403±0.055附表2 疫苗SL7207(pVAX1-F)对商品代伊莎褐蛋鸡的免疫原性试验结果平均ELISA抗体效价组 别血清样品 小肠粘膜样品首免后2周 三免后1周 首免后2周三免后1周SL7207(pVAX1-F) 320.00±195.95 576.00±143.10 128.00 192.00±90.51SL7207(pVAX1)96.00±35.7740.0032.00 32.00油 苗1024.00±350.54 896.00±350.54 48.00±22.6348.00±22.63空 白96.00±35.7736.00±35.77 32.00 32.00
附表3疫苗SL7207(pVAX1-F)对商品代伊莎褐蛋鸡的免疫保护结果组 别 鸡 数 存活数死亡数 保护率(％)SL7207(pVAX1-F) 22 175 77.27SL7207(pVAX1) 17 5 12 29.42油苗 18 153 83.22空白 16 2 14 12.50由上述实验得出1、新城疫疫苗SL7207(pVAX1-F)制备方便，免疫简单易行，适于兽医临床应用。
2、体内实验表明，新城疫疫苗SL7207(pVAX1-F)对鸡具有良好的安全性，且不影响鸡的增重；具有激发机体产生全身性免疫应答和局部粘膜免疫应答的能力；能提供新城疫病毒强毒攻击良好的免疫保护作用，为该疫苗推广使用奠定了坚实的基础。
权利要求
1.新城疫新型粘膜疫苗，其特征在于其DNA疫苗的DNA长度为4647bp，其DNA排序为gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 240ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 480tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 600ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga 660aattaatacg actcactata gggagaccca agctggctag cgtttaaact taagcttcaa 720tatgggctcc agaccttcta ccaggatccc agcacctctg atgctgatca cccggattat 780gctgatgttg ggctgtatcc gtccgacaag ctctcttgac ggcaggcctc 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2.新城疫新型粘膜疫苗的构建方法，其特征在于先通过反转录一聚合酶链式RT-PCR反应，扩增出新城疫病毒融合蛋白F基因；再将F基因与质粒pVAX1进行连接反应，构建DNA疫苗pVAX1-F；最后将质粒pVAX1-F转化进减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中；上述新城疫病毒融合蛋白F基因的扩增引物是上游引物5′taagcttcaatatgg gctccagacct 3′下游引物5′cgaattctccacctcttatctgcattcatgc 3′。
3.根据权利要求2所述新城疫新型粘膜疫苗的构建方法，其特征在于新城疫病毒融合蛋白F基因长度为1662bp，其DNA排序为atgggctcca gaccttctac caggatccca gcacctctga tgctgatcac ccggattatg 60ctgatgttgg gctgtatccg tccgacaagc tctcttgacg gcaggcctct tgcagctgca 120ggaattgtag taacaggaga taaggcagtc aatgtataca cctcgtctca gacagggtca 180atcatagtca agttgctccc gaatatgccc agggataagg aagcgtgtgc gaaagcccca 240ttagaggcat ataacagaac actgactact ttgctcactc ctcttggcga ctccatccgc 300aagatccaag ggtctgtgtc cacgtctgga ggaaggagac aaaaacgctt tataggtgct 360attattggca gtgtagctct tggggttgca acagcggcac agataacagc agctgcggcc 420ctaatacaag ccaaccagaa tgctgccaac atcctccggc ttaaggagag cattgctgca 480accaatgaag ctgtgcatga agtcaccgac ggattatcac aactatcagt ggcagttggg 540aagatgcagc agtttgtcaa tgaccagttt aataatacag cgcgagaatt ggactgtata 600aaaatcacac aacaggttgg tgtagaactc aacctatacc taactgaatt gactacagta 660ttcgggccac agatcacctc ccctgcattg actcagctga ccatccaggc actttataat 720ttagctggtg gcaatatgga ttacttatta actaagttag gtatagggaa caatcaactc 780agctcattaa ttggtagcgg cctgatcact ggttacccta ttctgtacga ctcacagact 840caactcttgg gcatacaagt gaatttgccc tcagtcggga acttaaataa tatgcgtgcc 900acctatttgg agaccttatc tgtaagtaca accaaaggat atgcctcagc acttgtcccg 960aaagtagtga cacaagtcgg ttctgtgata gaagagcttg acacctcata ctgtatagag 1020tccgatctgg atttatattg tactagaata gtgacattcc ccatgtcccc aggtatttat 1080tcctgtttga gcggcaacac atcagcttgc atgtattcaa agactgaagg cgcactcacc 1140acgccgtata tggcccttaa aggctcagtt attgccaatt gtaagataac aacatgtaga 1200tgtacagacc ctcctggtat catatcgcaa aattatggag aagctgtatc cctgatagat 1260agacattcgt gcaatgtctt atcattagat gggataactc tgaggctcag tggggaattt 1320gatgcaactt atcaaaagaa catctcaata ctagattctc aagtcatcgt gacaggcaat 1380cttgatatat caactgaact tggaaacgtc aacaattcaa tcagcaatgc cttggataag 1440ttggcggaaa gcaacagcaa gctagaaaaa gtcaatgtca gactaaccag cacatctgct 1500ctcattacct atattgttct aactgtcatt tctctagttt tcggtgcact tagtctgggt 1560ttagcgtgtt acctgatgat caaacagaag gcacaacaaa agaccttgct atggcttggg 1620aataataccc tcgatcagat gagagccact acaagagcat ga。
全文摘要
新城疫新型粘膜疫苗及其构建方法，涉及一种新城疫疫苗以及构建的方法，先通过反转录—聚合酶链式RT－PCR反应，扩增出新城疫病毒融合蛋白F基因；再将F基因与质粒pVAX1进行连接反应，构建DNA疫苗pVAX1－F；最后将质粒pVAX1－F转化进减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207中，最终获得DNA长度为4647bp的新城疫病毒DNA疫苗。本发明采用以减毒鼠伤寒沙门氏菌运送新城疫病毒DNA疫苗，构建新城疫新型粘膜疫苗SL7207(pVAX1－F)。通过口服方式(饮水或拌料)对家禽(鸡、鹅、鸽等)直接进行免疫，较传统的新城疫弱毒疫苗安全，且较传统的新城疫油乳剂灭活疫苗使用方便，可克服母源抗体干扰以及油乳剂灭活疫苗不能产生粘膜免疫应答的缺陷，并能提供对新城疫病毒强毒攻击的保护。
文档编号A61K48/00GK1616108SQ200410064940
公开日2005年5月18日 申请日期2004年10月10日 优先权日2004年10月10日
发明者焦新安, 潘志明, 黄金林, 张晓明, 张小荣, 殷月兰, 孙林, 刘秀梵 申请人:扬州大学