专利名称：抑制丝裂原活化蛋白激酶p38亚族的组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药组合物领域，具体是抑制丝裂原活化蛋白激酶p38亚族(p38MAPK)信号转导通路的组合物及其在制备预防和治疗动脉粥样硬化药物中的应用。
背景技术：
动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)相关性疾病冠心病和脑中风仍然是目前死亡率最高的疾病之一。对动脉粥样硬化机理的深入研究近年来一直是一项国际前沿学科。一般认为，动脉粥样硬化损伤形成的一个最早期过程是来源于血液的单核细胞变成巨噬细胞后在内皮下膜处聚集，然后发展成为含脂质的泡沫细胞。低密度脂蛋白(LDL)经氧化修饰而成的氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)可以诱导多个细胞功能的变化，该变化可能参与到动脉粥样化的形成。在这个动脉粥样硬化的早期阶段，oxLDL可导致血管细胞的增殖、迁移，并能阻碍内皮细胞的再生，且其本身就是一种单核细胞和T淋巴细胞的强烈趋化物。oxLDL可以促进几乎所有的动脉血管细胞中的粘附分子、细胞因子、趋化因子、热休克蛋白和共凝蛋白的表达，并可以抑制内皮细胞来源的舒血管因子、一氧化氮和前列环素的产生，还可诱导出多种促炎症细胞因子和生长因子。
细胞信号转导则是目前国际上一大研究热点。MAPK是细胞内重要的信号转导者，参与了多种生理病理过程的调节，在哺乳动物细胞中已发现和克隆了ERK、JNK/SAPK、ERK5/BMK1T和p38四个亚族。细胞胞外刺激激活MAPK，使其磷酸化后移位入细胞内其他部位，作用相应目标而发挥调节作用(1.Debree FM，brzozowski AM，Gellerfors P，et al.[J].Protein ExprPurif，1998，13(3)319-325。2.姜勇.p38 MAPK信号转导通路.生命科学，1999；11(3)102-106.)。研究结果表明OxLDLs激活血液中的单核细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)p38亚族，即p38 MAPK，通过此细胞信号转导通路，诱导单核细胞积聚至动脉壁(1.QingJing，et al.Lysophosphatidylcholine activates p38 and p42/44mitogen-activated protein kinases in monocytic THP-1 cells，but onlyp38 activation is involved in its stimulated chemotaxis.CirculationResearch，2000(7)52-59.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制p38 MAPK活性的组合物，它可以通过抑制oxLDL介导的THP-1单核细胞p38MAPK磷酸化和激活，阻断p38 MAPK信号转导通路，从而达到预防和治疗动脉粥样硬化的目的。
本发明的目的还在于提供所述组合物在制备治疗和预防高脂血症或动脉粥样硬化药物中的应用。
本发明的抑制丝裂原活化蛋白激酶p38亚族活性的组合物，其特征在于由如下重量配比的原料制成黄芪0-6份，当归0-6份，其中一组分配比不为零。
原料的较佳配比黄芪1-6份，当归1-6份。
原料的最佳配比黄芪5份，当归1份。
所述的组合物可制备治疗和预防高脂血症疾病的药物。
所述的组合物可制备治疗和预防冠心病的药物。
所述的组合物可制备治疗和预防中风疾病的药物。
所述的组合物可制备治疗和预防肾动脉粥样硬化疾病的药物。
制备的药物是针剂或口服制剂，所述口服制剂是如下中的一种或多种硬胶囊、软胶囊、片剂、颗粒剂、散剂、丸剂、袋泡茶、药酒、口服液。可以采用现有通用的方法制备。
本发明与现有技术相比具有如下优点本发明的组合物可以阻断p38MAPK信号转导通路，避免OxLDLs诱导单核细胞聚集现象，从而在高脂血症或动脉粥样硬化病变的早期发展阶段阻断其进程；又可缓解后期病变的发展。
具体实施例方式
实施例1取当归10g，黄芪50g，用清水煎煮并浓缩制成口服液。
实施例2取当归10g，黄芪60g，粉碎制成颗粒。
实施例3取当归60g，黄芪10g，粉碎后压成片剂。
实施例4取当归10g，黄芪10g，包装成袋泡茶。
实施例5当归10g，用清水煎煮并浓缩制成口服液。
实施例6黄芪50g，用清水煎煮并浓缩制成口服液。
临床试验效果试剂KBr(溴化钾广州化学试剂二厂生产，批号2001051502)；EDTA-Na(乙二胺四乙酸二钠)、蛋白测定试剂盒(Lowry法)和DMEM培养基均为上海申能博彩生物科技有限公司出品；p38MAPK测定试剂盒；1.仪器超速冷冻离心机(OptimaTM XL-cook Ultracentrifuge，BeckMAN转头型号70Ti(60000万转，4.5小时))；CO2培养箱(BNA-3210型CO2培养箱，日本ESPEC)，倒置显微镜(日本COIC)；Bio-Rad GS-800校准光密度测定仪(Calibrated Densitometer)，GS-800酶标仪(日本BioRad)；高速冷冻离心机(德国Sigma)；2.动物新西兰兔6只，普通级，雌雄各半，体重平均2kg，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号粤检证字2003A001号。
每兔每日喂以1克胆固醇的饲料，同时1次静脉注射牛血清白蛋白(250mg/kg)，使动脉发生免疫损伤，5周后形成类似人As(动脉粥样硬化)的病变。
3.喂药实施例1制备的药液，分别予新西兰家兔每日分二次灌胃，连续给药3天，第3天灌胃后禁食，次晨灌药1次，灌药后1h心脏无菌条件下采血，分离血清。不灭活组药物血清以0.45μm及0.2μm双层微孔滤膜过滤除菌后，-40℃保存备用；灭活组药物血清以56℃、30min灭活后，再以0.45μm及0.2μm双层微孔滤膜过滤除菌后-40℃保存备用。
4.低密度脂蛋白(LDL)的分离和氧化修饰参照低密度脂蛋白氧化修饰和丙二醛修饰的比较研究.生物化学与生物物理学报，1992，24(6)569，LDL制备采用一次性密度梯度超速离心法制备，利用蛋白测定试剂盒(Lowry法)测定LDL含量。
①LDL制备取健康人血，4℃静置2h后离心分离血清，用溴化钾调整密度至1.30g/mL，置超速离心机，4℃50 000RPM离心5h收集LDL。在PBS中透析48h，超滤除菌后4℃保存备用。
②OxLDL制备在LDL(1mg/mL)中加入终浓度为5μmol/L的CuSO4，37℃温育24h，使其被氧化修饰，再以PBS透析24h，测得硫巴比妥酸反应物(TBARS)值为63.0-78.5nmol/mg，说明LDL已被Cu++氧化。
5.单核细胞(monocyte，MC)的分离取As模型兔血，以EDTA-Na抗凝，利用Percoll细胞分离液分离得到MC，以经明胶和自身血浆处理过的塑料平皿吸附MC，收集吸附的MC，加入DMEM使细胞悬浮，细胞密度为1×106/mL。非特异酯酶染色检测细胞纯度＞95％，台盼蓝拒染试验显示细胞活性＞96％。
6.细胞的分组处理和p38MAPK活性检测兔MC采用10cm培养皿培养，含10mL 1×106/mL细胞，使用含25％血清和5μg/mL百日咳毒素的DMEM培养液。不同处理细胞采用实施例1制成的为含相应药物之血清，对照组和OxLDL组为无药血清。细胞在37℃，5％CO2条件下培养24h后，除对照组外，各组加入OxLDL迅速混匀，作用10min，各处理细胞均弃上清，按p38MAPK活性测定试剂盒方法制备细胞裂解产物，采用Western印迹法进行p38MAPK活性检测。采用光密度测定仪采集X光胶片图像，以Bio-Rad的Quantity One-4.4.1分析软件分析印迹斑点的光密度。结果显示黄芪当归含药血清组p38MAPK活性明显下调，与无p38MAPK活性的对照组基本一样，而黄芪含药血清组、当归含药血清组虽能下调p38MAPK活性，但不明显。因此实施例1制成的口服液能明显抑制p38MAPK活性。
冠心病和脑中风作为目前死亡率最高的心脑血管疾病，其病因均与人体的心、脑动脉粥样硬化密切相关。As所致的心脑血管疾病，其发病率和病死率在世界上多数国家呈逐年上升的趋势。As病理生理机制及其防治对策一直是心血管病学的研究热点。已经证明，当人体血液中血脂含量过高时，血脂中的低密度脂蛋白便会逐渐浸润到血管的内皮下层，单核细胞粘附于血管内皮细胞并迁入内皮、摄取脂质转化为泡沫细胞是动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)形成的早期关键病理变化。
MAPK是细胞内重要的信号转导者，参与了多种生理病理过程的调节，在哺乳动物细胞中已发现和克隆了ERK、JNK/SAPK、ERK5/BMK1T和p38四个亚族。细胞胞外刺激激活MAPK，使其磷酸化后移位入细胞内其他部位，作用相应目标而发挥调节作用。p38参与了多种细胞内信号传递，在介导真核细胞对炎症和应激等的反应中起重要作用。研究表明当血脂中的低密度脂蛋白在血管内皮下层大量积聚并发生氧化修饰时，OxLDL激活血液中p38 MAPK，通过此细胞信号转导通路，诱导单核细胞积聚至动脉壁，并产生细胞毒作用，导致动脉粥样硬化斑块中的泡沫细胞坏死，并能使血管平滑肌细胞分泌胶原等基质减少，造成粥样硬化斑块脆性增加，并易于破碎，从而在血管中形成血栓，导致冠心病和脑中风患者的病情发作。
观察本发明的组合物对OxLDLs激活单核细胞p38 MAPK信号转导通路作用的影响，研究结果显示，OxLDL能使P38 MAPK活性上调，这与文献报导的相一致；单味黄芪、当归对P38MAPK活性无明显影响，本发明组合物明显下调P38MAPK的活性。该结果说明，本发明组合物防治As及其相关疾病的作用机理主要是通过下调p38 MAPK活性，避免了OxLDLs诱导单核细胞聚集到血管内皮，从而在As病变的早期发展阶段阻断其进程，又可缓解后期病变的发展。
权利要求
1.一种抑制丝裂原活化蛋白激酶p38亚族活性的组合物，其特征在于由如下重量配比的原料制成黄芪0-6份，当归0-6份，其中一组分配比不为零。
2.根据权利要求1所述的抑制丝裂原活化蛋白激酶p38亚族活性的组合物，其特征在于由如下重量配比的原料制成黄芪1-6份，当归1-6份。
3.根据权利要求1或2所述的抑制丝裂原活化蛋白激酶p38亚族活性的组合物，其特征在于由如下重量配比的原料制成黄芪5份，当归1份。
4.权利要求1或2或3所述的组合物在制备治疗和预防高脂血症疾病的药物中的应用。
5.权利要求1或2或3所述的组合物在制备治疗和预防动脉粥样硬化疾病的药物中的应用。
6.权利要求1或2或3所述的组合物在制备治疗和预防冠心病的药物中的应用。
7.权利要求1或2或3所述的组合物在制备治疗和预防中风疾病的药物中的应用。
8.权利要求1或2或3所述的组合物在制备治疗和预防肾动脉硬化疾病的药物中的应用。
9.根据权利要求4至8中之一所述的应用，其特征在于制备的药物是针剂或口服制剂，所述口服制剂是如下中的一种或多种硬胶囊、软胶囊、片剂、颗粒剂、散剂、丸剂、袋泡茶、药酒、口服液。
全文摘要
本发明涉及一种抑制丝裂原活化蛋白激酶p38亚族活性的组合物，可用于制备预防和治疗动脉粥样硬化药物，由如下重量配比的原料制成黄芪0－6份，当归0－6份，其中一组分配比不为零；本发明的组合物可以阻断p38 MAPK信号转导通路，避免OxLDLs诱导单核细胞聚集现象，从而在高脂血症或动脉粥样硬化病变的早期发展阶段阻断其进程；又可缓解后期病变的发展。
文档编号A61P13/12GK1660242SQ20041007723
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月10日 优先权日2004年12月10日
发明者徐志伟, 黄水清, 严灿 , 李杰芬, 王剑, 沈晓燕, 韩凌, 王斌 申请人:广州中医药大学