专利名称：抑制肿瘤生长的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及对于治疗癌症和HIV疾病具有增强活性的新桦木酸衍生物，一种制备这些新桦木酸衍生物的方法及其用作药物的用途。同桦木酸一样，本发明化合物适于临床应用于人类和动物以抑制不同肿瘤(黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、鳞状细胞癌和下文提及的其他肿瘤)的生长，还能够治疗HIV疾病，并且由于它们具有抗炎活性其还可用于治疗非特异性炎性疾病。
发明概述本发明涉及具有通式(I)结构的新桦木酸衍生物 其中R1代表羟基、氨基、被保护羟基或被保护氨基。适合的保护基团在现有技术中是已知的，例如“Protective Groups in OrganicSynthesis”，T.W.Greene and P.G..M.Wuts，3rdEdition，John Wiley &Sons，Inc.(1999)第2章和第7章所公开的内容，这些公开的内容在此引用作为参考；和R2＝ 特别是，本发明涉及具有上文所述通式(I)结构的新桦木酸衍生物，其中R1代表羟基、氨基或下述被保护羟基或被保护氨基之一 R2如上文所述。
本发明化合物是新的桦木酸衍生物，它们具有增强的活性并且在极性溶剂中具有更好的溶解性，因此显著提高了应用选择性。当然地，本发明化合物任何可能的盐及包合物均被涵盖在前述通式(I)的范围内。
本发明进一步涉及一种制备通式(I)化合物的方法，其中被取代基R1适当保护的桦木酸卤化物，特别是桦木酸氯化物，与被适当取代的醇或胺反应以获得取代基R2。如果需要，制得的通式(I)化合物可以通过现有技术中已知的方法对选择的保护基团进行去保护，以获得其中R1基团代表羟基或氨基的通式(I)化合物，其中所述通式(I)化合物中的R1基团本来代表被保护的羟基或氨基。
用作本发明化合物起始和对照化合物的天然桦木酸是上世纪初就被分离出的一种三萜烯。名字起源于作为桦树成分的醇桦木素，其在桦树中的数量很多。桦木酸具有抗疟疾、抗炎、抗HIV和抗肿瘤作用，这在很多不同的出版物中已经被报道过了。作为一种化学治疗剂，桦木酸诱导了各种器官肿瘤细胞(例如黑素瘤细胞)中所谓的程序性细胞死亡，也称作细胞调亡。在人和小鼠模型中，体内和体外均检测到了对黑素瘤中的抗增殖作用。特别是在黑素瘤细胞中，虽然黑色素细胞对这种物质具有很强的抵抗性，桦木酸仍能够特异性诱导凋亡细胞在肿瘤细胞中毁灭。对于数据，几乎没有获得任何数据能够证明桦木酸和其他细胞抑制剂之间存在可能的协同作用。S.Fulda(儿童医院，Ulm)研究组特别详细地研究了初期肿瘤(尤因肉瘤，成神经管细胞瘤)和成胶质细胞瘤中的分子作用机理。
桦木酸及其已知衍生物在科技文献中已报道的其它已知作用包括能够抑制HIV病毒复制、和受体结合的拮抗HIV病毒的活性，以及具有抗炎作用，这一点例如可以通过小鼠耳炎症模型进行说明。由于其抗增殖作用能够抑制各种肿瘤(黑素瘤、神经外胚层瘤、肉瘤)，动物试验和细胞培养都证明了这一点，因此桦木酸是一种非常令人感兴趣的物质，它既能够单独使用也可能与其他细胞生长抑制活性物质以及细胞死亡调节物质联合应用，例如抑制各种抗细胞凋亡Bcl-2家族成员特别是Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-2的反义寡核苷酸。
桦木酸对黑素瘤、尤因肉瘤、成胶质细胞瘤和成神经管细胞瘤的作用机理的公开表明了，所述作用实质上是由编程性细胞死亡在线粒体水平的诱导作用所引起的。目前仍不清楚细胞内存在什么样的攻击主要点；无论是对可能的结合位点(受体)，还是初始信号途径，都还没有进行过充分地研究。然而，本发明人和其他作者都能够证明桦木酸在恶性细胞中诱导了细胞调亡，然而人类黑色素细胞甚至正常细胞都表现出比恶性细胞低的敏感性。这种观察结果是非常有趣的，尤其是还因为小鼠的动物试验数据没有显示出任何显著的毒性。除了在细胞培养中获得的那些数据，还暗示了桦木酸在肿瘤组织中比在正常组织中的浓度更高。还对各种Bcl-2家族成员在黑素瘤细胞和正常黑色素细胞中的被诱导情况以及在肉瘤中的被诱导情况进行了研究。发现桦木酸在数小时内能够诱导抗细胞凋亡蛋白Mcl-1的表达。该基因组其他被检查的蛋白尤其是Bcl-2和Bcl-3，以及p53蛋白的表达在治疗条件下保持不变。科技文献中的数据显示桦木酸的作用不依赖于p53蛋白质。既然近期研究表明Bcl-2和Bcl-xL能够抑制桦木酸诱导的细胞凋亡，这些观察结果提示了可以用桦木酸拮抗Bcl-2和/或Bcl-xL，例如通过反义寡核苷酸(ASO)。同样的考虑也可应用于与例如Mcl-1ASOs的可能性联合。可能的与临床相关的桦木酸的一个性质在于近期的观察结果，即其细胞毒性在低pH培养基中有所增强。很多肿瘤中的pH值低于正常组织(Noda Y.et al，1997)。同一作者发现桦木酸抑制静息细胞比抑制生长期中的细胞活性更强。这一性质可能是临床应用中的附加相关性，虽然很多化学疗法以及放射疗法对抑制静息和/或酸中毒细胞群的效果更差。
目前，尤其对黑素瘤、神经外胚层瘤、肉瘤和HIV进行了最深入的研究。这些肿瘤特别难以治疗，其主要的全身性疾病形式基本上没有治疗选择性。对于患有转移性黑素瘤的患者，治疗选择性极大地受限于数种物质。包括5-(3，3-二甲基-2-三氮烯基)-1-H-咪唑-4-氨甲酰(氮烯唑胺，DTIC)。氮烯唑胺还构成了黑素瘤中最有效的单一疗法，显示出约30％的应答率。与其他合成物质或重组体的联合疗法在相同的临床研究中具有更高的应答率，所述合成物质或重组体例如是BCNU、顺铂、他莫西芬、干扰素-α和白介素-2。然而，这些受限于时间和随之而来提高的毒性。衍生自天然产物的一些物质例如阿霉素、博莱霉素、依托泊苷及其他物质，对于其抗黑素瘤活性及其毒性进行了研究。然而，在临床日常工作中这些物质最后全部没有被证明具有上述性质。
实施例在下文中，本发明方法将通过一些实施例进行更加详细地说明，但本发明的公开并不受限于这些实施例。
1)乙酰桦木酸-2-氨基-3-羟基-2-羟基甲基丙基酯IV(化合物B) 乙酰桦木酸-2-氨基-3-羟基-2-羟基甲基丙基酯IV通过下述步骤进行合成桦木酸先生成中间体乙酰桦木酸II，然后得到相应的酸氯化物III，将酸氯化物III与氨基丁三醇反应。
a)乙酰桦木酸(MW 498.74)II将含有2g桦木酸I(MW 456.70)的50ml醋酸酐加热回流2小时。冷却后，剧烈搅拌下将反应液倒入冰水中，过滤，用水洗涤得到的固体物质直至乙酸的气味消失。
然后将固体在70℃乙醇中加热回流4小时，整个过程进行搅拌。
冷却后，过滤反应液，轻度浓缩母液，然后在冰浴中进行冷却，再次过滤。收率86％；mp.290℃。
b)乙酰桦木酸氯化物(MW 517.18)III将2g乙酰桦木酸II加入干燥的苯中，然后加入10倍量草酰氯(3.4ml)。冷却条件下将反应混合物搅拌8小时，随后使用旋转蒸发仪蒸除溶剂和过量的草酰氯。为了去除任何残留的草酰氯，再加入另外20ml苯并在真空中蒸发。
c)乙酰桦木酸-2-氨基-3-羟基-2-羟基甲基丙基酯(MW 601.86)IV，(化合物B)对于通过b)步骤的方法从1g乙酰桦木酸(约0.002mol)制得的酸氯化物不再经过另外的纯化而直接进行下面的反应。将其溶解于35ml二噁烷(干燥)中，然后再加入2倍量的氨基丁三醇(0.004mol，0.5g)。加入三勺尖DMAP和3滴吡啶，反应混合物在室温下搅拌2天。
上述步骤之后，过滤出固体，使用旋转蒸发仪浓缩溶液并吸入氯仿中。在没有吡啶的条件下使用1％盐酸、水和饱和盐水溶液洗涤氯仿溶液数次。Na2SO4进行干燥，然后移除溶剂，将产品通过硅胶柱或(和)色谱管(chromatotron)进行纯化。使用10∶1的氯仿-甲醇混合物作为洗脱液。收率20％，mp.156℃。
2)乙酰桦木酸-N-(1，1-二(羟甲基)-2-羟基-乙基)甲酰胺(MW601.86)，(化合物C) 乙酰桦木酸-N-(1，1-二(羟甲基)-2-羟基-乙基)甲酰胺(MW601.86)，(化合物C)的合成与反应路线1相似，桦木酸先生成中间体乙酰桦木酸II，然后得到相应的酸氯化物III，将酸氯化物III与氨基丁三醇反应。
对于通过1)b)步骤的方法从1g乙酰桦木酸(约0.002mol)制得的酸氯化物不再经过另外的纯化而直接进行下面的反应。将其溶于35ml无水二噁烷中，然后加入等摩尔量的氨基丁三醇(0.002mol，0.25g)。加入1勺尖DMAP和3滴吡啶，然后将反应混合物加热至80℃，并保持8小时。这些步骤之后，使用旋转蒸发仪浓缩反应溶液，并用氯仿吸收残留物。在没有吡啶的条件下使用1％盐酸、水和饱和盐水溶液洗涤氯仿溶液数次。使用Na2SO4进行干燥，然后移除溶剂，将产品通过硅胶柱或(和)色谱管进行纯化。使用10∶1的氯仿-甲醇混合物作为洗脱液。收率15％，mp.184℃。
接下来，将通过与桦木酸(对比化合物A)的比较说明本发明化合物在抑制肿瘤生长方面的用途。
各种肿瘤的生长抑制实施例1和2说明了对比化合物A(桦木酸)和一种新衍生物(化合物B)在成对生长测试(第1天单独使用指示浓度的各个化合物，3天后细胞计数的降低)中的直接对比结果。
实施例148小时后化合物(A)(桦木酸)与化合物(B)(经保护的桦木酸三酯)对黑素瘤细胞518A2(来自Perter Schrier，Leiden，TheNetherlands)生长抑制的对照。X轴代表的是化合物A和B的浓度(μg/ml)，相应地，Y轴是相对于未处理对照组的细胞存活百分率。
对照化合物(A)的ED50值约为5μg/ml，化合物(B)约为0.7μg/ml。
化合物(B) 由此可见，化合物(B)比化合物(A)具有更强的活性，即增强了7倍。
在肉瘤中也观察到了相似的增强活性，下文实施例将进行进一步说明。
实施例2对比化合物(A)(桦木酸)与化合物(B)(经保护的桦木酸三酯)对于脂肉瘤(ATCC HTB-92)的功效对照。X轴代表化合物A和B的浓度(μg/ml)，相应地，Y轴是相对于未处理对照组的细胞存活百分率。
对照化合物(A)的ED50值约为2.5μg/ml，化合物(B)约为0.9μg/ml。
实施例3本发明不同桦木酸衍生物和对比化合物(桦木酸)对于各种黑素瘤-肉瘤的功效对照。每个数值指的是相对于未处理细胞培养的细胞存活百分率(平均值)。
3a)对照化合物(A)(桦木酸)-对脂肉瘤ATCC HTB-92的作用浓度μg/ml 存活率％0.398.00.692.81 92.31.25 79.52.549.35 20.810 15.73b)化合物(B)(经保护的桦木酸三酯)-对脂肉瘤ATCC HTB-92的作用浓度μg/ml存活率％0.3 89.50.6 70.71 12.01.25 2.92.5 3.05 0.0100.03c)化合物(B)(经保护的桦木酸三酯)-对黑素瘤518A2的作用浓度μg/ml存活率％0.3 83.00.6 56.31 11.31.25 10.32.5 2.85 0.0100.03d)化合物(C)(经保护的桦木酸三酯)-对黑素瘤518A2和脂肉瘤ATCC HTB-92的作用化合物(C)
浓度μg/ml 黑素瘤中的存活率％0.25 960.5 93167.5浓度μg/ml 脂肉瘤中的存活率％0.3 960.6 821.0 81实施例4化合物(B)(经保护的桦木酸三酯)在HBC(2-羟丙基-β-环糊精，Sigma，cat.No.H-107)或HGC(2-羟丙基-γ-环糊精，Sigma，cat.No.H-125)中的包合物的制备。
化合物(B) 各种用于进一步稀释的母液将在下文中进行描述。50或100mg/ml的化合物(B)分别溶于EtOH中。HBC单独溶解在水或者水加EtOH中。操作步骤的更多模型基本上与Sigma提供的数据图表所公开的内容一致。没有尝试去调节pH。化合物(B)在水溶液中的溶解性通过包合在HBC或类似化合物例如γ-环糊精中得到了进一步的提高。
测试#1化合物(B)50mg/ml照常溶于EtOH中测试#2化合物(B)5.9mg/ml在266mg/ml的HBC水溶液中测试#3化合物(B)20mg/ml在266mg/ml的HBC50％EtOH/50％水溶液中测试#4化合物(B)25mg/ml在200mg/ml的HGC50％EtOH/50％水溶液中上文所述母液使用EtOH稀释至1mg/ml，然后直接加入培养基中。
4a)作为HBC(2-羟丙基-β-环糊精)或HGC(2-羟丙基-γ-环糊精)包含物的化合物(B)(经保护的桦木酸三酯)-对于黑素瘤系518A2的作用单独使用药物后第3天细胞培养的存活率及所有其他数据测试#1浓度μg/ml 黑素瘤中的存活率％1.0502.00.53.00.04.00.0测试#2浓度μg/ml 黑素瘤中的存活率％1.0652.0253.00.04.00.0
测试#3浓度μg/ml 黑素瘤中的存活率％1.0772.0243.00.04.00.0测试#4浓度μg/ml 黑素瘤中的存活率％1.0592.043.00.04b)作为HGC(2-羟丙基-γ-环糊精)包合物的化合物(B)(经保护的桦木酸三酯)在小鼠模型中的耐受性方法论将溶于水中的HGC/化合物(B)复合物静脉注射入无病原体的雌性C.B.-17scid/scid(SCID)小鼠(4-6周龄，Harlan Winkelmann，Borchen，Germany)的尾部静脉。包合物根据实施例4的方法进行制备。冷冻干燥混合物除去乙醇，随后重新溶于水中。用于下述试验的注射液总体积为200μl。
测试#1首先，每三天对两只小鼠使用100μg HGC/化合物(B)复合物治疗三次。在良好耐受性的例子中，下一对小鼠使用如下方案中的更高剂量进行治疗。
方案A组3次100μg HGC/化合物(B)复合物B组3次200μg HGC/化合物(B)复合物
C组3次400μg HGC/化合物(B)复合物然后从A组开始继续进行治疗A组3次800μg HGC/化合物(B)复合物B组3次1500μg HGC/化合物(B)复合物由于出现局部刺激现象，随后停止了试验。
由于两只小鼠中的一只出现了强烈的局部刺激现象，在1500μgHGC/化合物(B)复合物处中断了试验，但没有产生任何显著的系统毒性。总之，每只小鼠注射使用800μg HGC/化合物(B)复合物不会产生显著毒性。在更高浓度时(每只小鼠大约＞1.5mg HGC/化合物(B)复合物)，观察到了局部刺激现象。可以预料到的是，更低的输注率可以帮助避免此类副作用。
测试#2在3只小鼠试验组中，每三天对每一只小鼠使用800μg HGC/化合物(B)复合物，6次一组。同样地，没有显示出任何显著的临床毒性作用。随后的尸体检验没有发现任何肉眼可见的器官变化。
权利要求
1.具有通式(I)结构的新桦木酸衍生物及其盐和包合物 其中R1代表羟基、氨基、被保护羟基或被保护氨基，并且R2＝
2.如权利要求1所述的化合物，其中R1代表羟基、氨基或下述被保护的羟基或氨基之一 并且R2如上文定义。
3.一种制备权利要求1或2所述化合物的方法，其特征是将被取代基R1适当保护的桦木酸卤化物，与被适当取代醇或胺反应以制得取代基R2，从而使得到所得到通式(I)化合物中R1所代表的被保护的羟基或氨基已经被托保护，如果需要，制得通式(I)中R1基团代表羟基或氨基的化合物。
4.权利要求1或2的化合物作为药物的用途。
5.权利要求1或2的化合物在制备用于抑制肿瘤例如黑素瘤和神经外胚层瘤生长，和/或治疗哺乳动物肉瘤和HIV疾病的药物中的应用。
6.权利要求1或2的化合物在制备与其他细胞生长抑制活性物质和细胞死亡调节物质联合应用的药物中的用途，所述细胞生长抑制活性物质和细胞死亡调节物质例如是抑制各种抗细胞凋亡Bcl-2家族成员，特别是Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1的反义寡核苷酸。
7.一种包括权利要求1或2所述任一化合物的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及对于治疗癌症和HIV疾病具有增强活性的新桦木酸衍生物，一种制备这些新桦木酸衍生物的方法及其用作药物的用途。
文档编号A61K31/56GK1747964SQ200480003907
公开日2006年3月15日 申请日期2004年2月11日 优先权日2003年2月11日
发明者布克哈德·扬森, 赖因哈德·帕施克, 埃德加·泽尔策 申请人:诺瓦利克斯制药公司