专利名称：制备n－末端修饰的趋化因子的方法
技术领域：
本发明涉及一种从重组体制得的Gln-MCP-1制备pyroGlu-MCP-1的方法，以及含有pyroGlu-MCP-1制剂的组合物。
MCP-1(单核细胞化学吸引蛋白-1；也已知称为单核细胞趋化性和活化因子‘MCAF’、巨嗜细胞趋化因子‘MCF’、肿瘤坏死因子刺激的基因-8‘TSG-8’‘HC-11’、平滑肌细胞趋化因子‘SMC-CF’、淋巴细胞衍生的趋化因子‘LDCF’以及神经胶质瘤衍生的趋化因子‘GDCF’)是CC-趋化因子家族中的一员。人的MCP-1-蛋白最初描述在美国专利US 5714578中。是在自然条件下在有机体(天然的)内合成为99个氨基酸长度的前体蛋白，随后将其处理为具有76个氨基酸基的肽。成人MCP-1(hMCP-1)是分子量为14kDa的一种糖蛋白，并由多种细胞(例如平滑血管肌细胞和内皮细胞)所分泌(Leonard和Yoshimura(1990)，Immology Today 11，97-101)。其含有两个分子内的二硫桥并且在自然表达下被O-糖基化和唾液酰化(sialylyliert)(J.Yan Ling等(1990)，Joumal of Biological Chemistry，265，18318-18321)。
所述蛋白质是染色体定位为17ql 1.2-q21.1的JE-基因的产物。该基因定位也已知为SCY A2(“小诱导细胞因子(small inducible cytokine)A2”)。所述人体基因最初描述在美国专利US 5212073中。该基因的表达可被例如肿瘤坏死α因子的多种细胞因子所诱导以及也被例如免疫球蛋白G所诱导。所述基因序列和其他基因和基因产物的信息可以通过保藏号M37719在NCBI-数据库中得到(参见表1)。
表1
碱基数 700a 727c 565g 781t 3其他来源1cagttcaatg tttacacaat cctacagttc tgctaggctt ctatgatgct actattctgc61 atttgaatga gcaaatggat ttaatgcatt gtcagggagc cggccaaagc ttgagagctc121 cttcctggct gggaggcccc ttggaatgtg gcctgaaggt aagctggcag cgagcctgac181 atgctttcat ctagtttcct cgcttccttc cttttcctgc agttttcgct tcagagaaag241 cagaatcctt aaaaataacc ctcttagttc acatctgtgg tcagtctggg cttaatggca301 ccccatcctc cccatttgcg tcatttggtc tcagcagtga atggaaaaaa gtgctcgtcc361 tcacccccct gcttcccttt cctacttcct ggaaatccac aggatgctgc atttgctcag421 cagatttaac agcccactta tcactcatgg aagatccctc ctcctgcttg actccgccct481 ctctccctct gcccgctttc aataagaggc agagacagca gccagaggaa ccgagaggct541 gagactaacc cagaaacatc caattctcaa actgaagctc gcactctcgc ctccagcatg601 aaagtctctg ccgcccttct gtgcctgctg ctcatagcag ccaccttcat tccccaaggg661 ctcgctcagc caggtaaggc cccctcttct tctccttgaa ccacattgtc ttctctctga721 gttatcatgg accatccaag cagacgtggt acccacagtc ttgctttaac gctacttttc781 caagataagg tgactcagaa aaggacaagg ggtgagcccc aaccacacag ctgctgctcg841 gcagagcctg aactagaatt ccagctgtga acccaaatcc agctccttcc aggattcagg901 atccagctct gggaacacac tcagcagtta ctcccccagc tgcttccagc agagtttggg961 gatcagggta atcaaagaga agggtgggtg tgtaggctgt ttccagacac gctggagacc1021 cagaatctgg tctgtgcttc attcacctta gcttccagag accggtgact ctgcaggtaa1081 tgagtatcag ggaaactcat gaccaggcat agctattcag agtctaaaag gaggctcata1141 gtggggctcc cagctgatct tccctggtgc tgatcatctg gattattggt ccgtcttaat1201 gacacttgta ggcattatct agctttaaca gctcctcctt ctctctgtcc attatcaatg1261 ttatataccc cattttacag cataggaaac tgagtcattg ggtcaaagat cacattctag1321 ctctgaggta taggcagaag cactgggatt taatgagctc tttctcttct cctgcctgcc1381 ttttgttttt tcctcatgac tcttttctgc tcttaagatc agaataatcc agttcatcct1441 aaaatgcttt tctttgtggt ttattttcca gatgcaatca atgccccagt cacctgctgc1501 tataacttca ccaataggaa gatctcagtg cagaggctcg cgagctatag aagaatcacc1561 agcagcaagt gtcccaaaga agctgtgatg tgagttcagc acaccaacct tccctggcct1621 gaagttcttc cttgtggagc aagggacaag cctcataaac ctagagtcag agagtgcact1681 atttaactta atgtacaaag gttcccaatg ggaaaactga ggcaccaagg gaaaaagtga1741 accccaacat cactctccac ctgggtgcct attcagaaca ccccaatttc tttagcttga1801 agtcaggatg gctccacctg gacacctata ggagcagttt gccctgggtt ccctccttcc1861 acctgcgtcc tcctagtctc catggcagct cgcttttggt gcagaatggg ctgcacttct1921 agaccaaaac tgcaaaggaa cttcatctaa ctctgtctcc tcccttcccc acagcttcaa1981 gaccattgtg gccaaggaga tctgtgctga ccccaagcag aagtgggttc aggattccat2041 ggaccacctg gacaagcaaa cccaaactcc gaagacttga acactcactc cacaacccaa2101 gaatctgcag ctaacttatt ttcccctagc tttccccaga caccctgttt tattttatta2161 taatgaattt tgtttgttga tgtgaaacat tatgccttaa gtaatgttaa ttcttattta2221 agttattgat gttttaagtt tatctttcat ggtactagtg ttttttagat acagagactt2281 ggggaaattg cttttcctct tgaaccacag ttctacccct gggatgtttt gagggtcttt2341 gcaagaatca ttaatacaaa gaattttttt taacattcca atgcattgct aaaatattat2401 tgtggaaatg aatattttgt aactattaca ccaaataaat atatttttgt acaaaacctg2461 acttccagtg ttttcttgaa ggaaattaca aagctgagag tatgagcttg gtggtgacaa2521 aggaacatga tttcagaggg tggggcttac attttgaagg aatgggaaag tggattggcc2581 cnntntcttc ctccactggg tggtctcctc tgagtctccg gtagaagaat ctttatggca2641 ggccagttag gcattaaagc accacccttc cagtcttcaa cataagcagc ccagagtcca2701 atgaccctgg tcacccattt gcaagagccc acccccattt cttttgctct cacgaccctg2761 accctgcatg caattt//在上述US 5714578中已描述，如果是一种从天然源分离的MCP-1蛋白，则N-末端被封端。仅在最近发现，这是由于转录后修饰，其中前导序列在成熟蛋白的N-末端分裂后露出谷氨酰胺，失去一个NH3分子环化为焦谷氨酸基。
在US 5212073中对编码为MCP-1的可读框的识别使该蛋白的重组体表达成为可能。以重组体法例如在大肠杆菌中制得的MCP-1不具有天然MCP-1典型的N-或O-糖基化样式。由此方法制得的MCP-1-制剂也不对抗Edman分解，以同样方式如由天然材料得到的制剂，即它还含有不封端的N-末端(谷氨酰胺)。在基于在巨噬细胞的趋化作用的细胞系中，最初在天然的MCP-1-制剂和以重组体法得到的生物活性之间没有发现差别。
MCP-1在生理条件下对于β-趋化因子-受体CCR2和CCR4起到一种激动剂作用，这两者主要在单核细胞上表达，并也在嗜碱细胞以及在T-和B-淋巴细胞上发现。MCP-1在亚纳摩尔(subnanomolar)浓度下就可以诱导单核细胞趋化性。受体CCR2和CCR4是G-蛋白-耦合的七-跨膜区-受体，其导致单核细胞的活化并增强整联细胞的附着。该过程最后导致单核细胞停靠到内皮细胞，并其后单核细胞从血管体系中离开。
WO 98/44953公开了MCP-1对动脉生成的影响，也就是侧枝动脉和/或来自存在的动脉连接的其他动脉的生长。基于该发现，在所述国际专利申请中提出MCP-1用于治疗目的，即用于治疗血管梗阻病，该病症通过刺激新血管形成而得到缓解。这种血管梗阻病特别是冠状动脉病(coronary arterydisease，CAD)、末梢动脉闭塞病症(peripheral arterial occlusive disease，PAOD)、脑动脉和肠膜(mesenteriale)动脉梗阻症，等等。此外还提出MCP-1-中和剂，例如抗-MCP-1-抗体，用于预防新血管形成，尤其是其可以抑制肿瘤生长，其依赖于血液供应充足，因而肿瘤组织充分血管化。
如上所述，为了可以将MCP-1-蛋白用于治疗用药，以促进组织血管化，必须提供具有药用足够纯度的足够大量的蛋白。人MCP-1最初是以天然形式由培育人的神经胶质瘤细胞系U105MG或者由人末梢血液的单核白细胞得到的。从这些来源分离打算用于治疗目的的蛋白由于以下原因而行不通，以此方式只能在难以接受的高成本和/或材料使用下才能获得足够大的量不能以所需量得到人的白细胞。神经胶质瘤细胞实际上可以快速不受限制地繁殖，但不适合以生物技术的发酵进行培育，此外还需要例如胎牛血清进行培育，因而带来所有相关问题。
因此，代替天然表达MCP-1而提出以重组体法制备MCP-1。事实上已经可以买到重组体的人MCP-1，特别是从R & D Systems公司(分类号279-MC)和Peprotech公司(分类号300-04；见表2；所给的分类号是基于2003年1月的标准)购得。按照商购产品说明，购得的重组体MCP-1-制剂含有一种其中所含的MCP-1-蛋白其在N-末端有氨基酸谷氨酰胺(Q)。此外，该产品说明也指出，该蛋白制剂特别是在重组体的液态下很敏感(推荐在4℃下贮存最多1周)。事实上发明人实验(现有技术内)证实，以溶解状态贮存常规MCP-1-蛋白制剂时，该(生物活性的)蛋白制剂特别是在超过4℃温度下，有很快被分解产物污染的迹象(在分析性HPLC-色谱中出现副带)。
表2(摘自Peprotech公司的互联网址http//www.peprotechcom/content/details.htm？results＝l&prod＝1392)重组体人MCAF(人MCP-1)
一种重组体制备人MCP-1-蛋白的传统方法包括通过将蛋白的温度诱导表达为融合蛋白，纯化由此形成的内含体，使其进入溶液中，使蛋白重折叠，随后从所述融合蛋白酶解释放hMCP-1蛋白。
在重组体制备人MCP-1-蛋白的常规方法中出现以下问题通过常常得到一种因一个或多个氨基酸而N-端缩短的蛋白质作为副产物。该副产物在生物系统中表现为MCP-1-受体的拮抗剂。
在Van Coillie等人(1998)，Biochemistry 3712672，12673a.E.描述了一种方法，涉及N-末端修饰对MCP-2生物活性影响的实验，该方法中，一种由重组体法得到的、MCP-2-制剂在0.01M Na2HPO4、pH 8.0中在37℃下培育24小时。在氨基酸序列平面(Ebene)上，MCP-2具有与MCP-1的62％的同源性，区别还在于，与MCP-2相反，在N-末端未修饰的MCP-1是生物活性的(参见表2中“生物活性”一行)。作者没有确定在上述条件下N-末端的谷氨酰胺-基转化为焦谷氨酸-基的程度。发明人还发现(现有技术内)，对MCP-1应用可比较的条件，无论如何只能导致N-末端的氨基酸部分环化(参见表3，对比实验2)。
因此，与上述说明有关的本发明任务是提供一种方法，通过该方法可以制得一种MCP-1-制剂(MCP-1组合物)，该制剂(a)由于其生物活性而适用于治疗目的，和(b)就药物法规许可法提供了优点，其包括生物药物情况下特别难以满足的要求，例如关于纯度和制备药物的可再生产性，特别是(c)具有较高的贮存稳定性。因此，相关的另一任务是提供组合物或制剂，其含有以重组体法制得的MCP-1，并适用于上述目的或者提供上述优点。
这些任务是通过权利要求中所述的方法和含有MCP-1的组合物而实现的。
根据本发明，提供一种由重组体制得的Gln-MCP-1制备(焦)pyroGlu-MCP-1的方法，该方法中，在30℃～80℃的温度，优选在30℃～70℃，更优选在35℃～60℃下，在缓冲溶液中培育Gln-MCP-1，在缓冲液中盐浓度为10mM～160mM，优选为10mM～100mM，其pH-值为2～7.5，优选3.5～7.5，更优选3.5～6.5，更优选5～6.5，更优选5.5～6.5，更优选约6的pH-值。进行长时间培育，直到含于培育缓冲溶液中的至少90％，优选至少95％，更优选至少96％的MCP-1以焦Glu-MCP-1的形式存在。
根据上下文，本公开范围内的“MCP-1”是指这样的MCP-1-蛋白(没有前(Prpro)序列)，该蛋白具有N-末端的谷氨酰胺-基(“Gln-MCP-1”；参见表1和表2中所示的氨基酸序列)或者具有已转化/环化为焦谷氨酸-基的N-末端(“pyroGlu-MCP-1”)。不过，对MCP-1-蛋白进行修饰是容易理解的，该修饰不影响其生物功能(特别是单核细胞吸引活性或对CCR-受体的作用)，并且不改变所述蛋白的结构，以致使得上述反应参数不再产生理想的结果(按照本发明方法，所述蛋白也不再能够转化为pyroGlu-变体)，不脱离保护范围。这样，本发明方法自然也可以用于MCP-1，其中进行保持氨基酸交换，例如丝氨酸成为苏氨酸或者亮氨酸成为异亮氨酸，只要所述交换既不影响所得蛋白的生物功能或活性，也不影响根据以上方法使N-末端谷氨酰胺转化为焦谷氨酸。因此，本发明方法也可用于其他哺乳动物的MCP-1蛋白，例如家鼠、老鼠、豚鼠、家兔和鼬(以及更多种)。
用于上述方法中的缓冲溶液优选是磷酸盐缓冲的(磷酸钠和/或磷酸钾缓冲的)较低摩尔浓度或生理摩尔浓度的水溶液，即，10～160mM，10～80mM，10～50mM，20～40mM或约20或40mM。如果经受较长的培育时间，则按照本发明的一个特定实施方案，也可在生理摩尔浓度，例如约150mM盐浓度下进行处理，该摩尔浓度优选通过使用一种磷酸盐缓冲的生理盐溶液或“PBS”而得到。较长培育时间的缺点(伴随着分解产物、副产物或氧化产物有增加量的危险)可被该特定实施方案的优点所弥补，同样能够以具有生理盐浓度的溶液形式得到蛋白制剂。
此外，用于修饰步骤的缓冲溶液还可以含有例如(温和的)清洁剂、抗氧化剂、防腐剂、络合剂、稳定剂、抗微生物试剂，等等。
选择培育温度为30℃～80℃，即超过室温。在较低的温度下，转化步骤进展很缓慢。尽管如此，为了实际上实现完全转化，必须大大加长培育时间，超过一周。这将导致生物工艺方法过程难以接受的使用时间，并且，还显著提高了蛋白质溶液其他杂质(通过分解产物或氧化产物，通过细菌、病毒和另外的病原菌)的危险。另一方面，培育温度升高到超过80℃，虽然强烈加速转化反应，但也更强烈地形成不希望的副产物和分解产物(参见实施例1和2)。如果可接受最多6天的使用时间，则特别优选培育温度为35～40℃。在可以明显更短地培育情况下，则对此也可在例如50到60、70或80℃下进行培育。40～50℃的温度当然也可产生理想的结果。
培育缓冲溶液的pH-值应在2～7.5范围内，也可在中性到酸性范围内。优选在3.5～7.5范围内，更优选在3.5～6.5范围内，更优选在5～6.5范围内，更优选在5.5～6.5范围内，并且更优选选择约为6的pH-值。
例如在实施例中详细描述的在合适选择的上述参数下，可以得到至少90％的纯度，也可以更高的纯度例如95％、96％或98％的pyroGlu-MCP-1-变体，其中，pyroGlu-MCP-1量(例如以在HPLC-洗脱曲线中以曲线下的面积计算出)的百分数是基于在溶液中存在的总MCP-1量(即包括任何剩余量的Gln-MCP-1部分和可能的氧化产物和其他副产物或分解产物)表示的。
根据本发明另一实施方案，提供一种制备pyroGlu-MCP-1-制剂的方法，该方法至少包括以下步骤-以重组体法制备Gln-MCP-1-制剂，通过在宿主细胞中编码MCP-1的基因结构的表达而进行，-任选浓缩和/或纯化含于Gln-MCP-1-制剂中的Gln-MCP-1，最后-将在Gln-MCP-1-制剂中所含的或在浓缩和/或纯化前所含于其中的Gln-MCP-1转化为含有蛋白分子种类pyroGlu-MCP-1的pyroGlu-MCP-1-制剂，该步骤按照以上描述的“用于从重组体制得的Gln-MCP-1制备pyroGlu-MCP-1的方法”进行。
任选地，该方法还可包括例如重新缓冲(umpuffem)pyroGlu-MCP-1-制剂或进一步纯化，例如通过随后的柱色谱、渗析、超滤等步骤进行。
生物技术制备重组体蛋白的方法是已知的。该方法尤其是包括发酵步骤、纯化步骤、浓缩步骤和其他步骤。以上提及的转化步骤可在不同点插入这种“多步法”内，还可以使用例如很大程度上未纯化或者已完全纯化的MCP-1-蛋白溶液作为起始溶液。尤其也可考虑以下方法过程，该方法中，以较多纯化、较少纯化或实际上完全纯化形式的尚未(完全)转化的Gln-MCP-1，冷冻干燥以改善其以尚未转化的形式的储存寿命，在给定时间内再次进入溶液中，然后按照以上方法转化为pyroGlu-MCP-1。当然也可以在转化为pyroGlu-MCP-1后，将所得的蛋白溶液冷冻干燥。
根据本发明，该方法产物，即进行N-末端修饰(转化)的pyroGlu-MCP-1-制剂，含有pyroGlu-MCP-1的量以MCP-1的总量计(转化的加上未转化的蛋白加上例如通过氧化产生的副产物)，为至少90％，优选至少95％，更优选至少96％。
术语(Gln-或pyroGlu-MCP-1-)“制剂”指的是，在不同方法步骤中，MCP-1-蛋白以溶解方式存在于(缓冲-)溶液中，因此除了MCP-1还可存在其他成分，其中肯定有所用缓冲盐的离子，以及可能还有其他盐、抗氧化剂、稳定剂、抗微生物试剂、清洁剂、防腐剂、络合剂，等等。
根据本发明另一方面提供一种组合物，该组合物含有按照上述方法制得的pyroGlu-MCP-1或pyroGlu-MCP-1-制剂，其中，组合物(转化的加上未转化的蛋白加上副产物；即例如HPLC洗脱色谱中“曲线下的面积”)中所含至少90％的MCP-1以pyroGlu-MCP-1的形式存在。
因此，本发明的主题还在于一种以重组体法尤其是以原核生物并且特别优选以大肠杆菌制得的MCP-1-制剂，其中至少90％的MCP-1-蛋白是以pyroGlu-MCP-1存在。在常见的表达细胞中进行制备时，该蛋白(与天然产物不同)常常不呈现天然的糖基化样式。尤其是在原核生物例如大肠杆菌中进行制备时，与人体天然表达时存在的形式相反，所得的pyroGlu-MCP-1或所得的pyroGlu-MCP-1-制剂没有被糖基化和/或唾液酰化，并因此不同于这种天然蛋白或由天然源得到的蛋白制剂。
这种本发明的组合物尤其可以是一种药物或一种药物组合物，其除了含有占总MCP-1-含量(转化的加上未转化的蛋白加上副产物)的至少为90％、95％或96％的pyroGlu-MCP-1部分外，还含有常见的助剂和载剂、盐、抗氧化剂、稳定剂、抗微生物试剂、清洁剂、防腐剂、络合剂，等等。本发明组合物可用于治疗患有动脉梗阻症例如尤其是PAOD或CAD的病人。所述治疗包括以合适途径给药以治疗有效量的这种组合物，例如经动脉内注入或者以动脉周围安放的凝胶形式，从该凝胶MCP-1-蛋白长时间地进行释放。
令人惊讶地还发现，与预料不同，在水溶液和在较高温度下培育以重组体法制得的MCP-1-蛋白制剂不会导致其分解和生物失活，相反，以适当选择多个参数情况下，通过从生物技术角度看很不常用的并且通常不希望的方法步骤，可以得到惊人的均匀的、生物很活性的pyroGlu-MCP-1-制剂，此外，该制剂本身即使在长期贮存情况下也可以保持其均匀性，而且比Gln-MCP-1-制剂(起始制剂)更稳定。
当局如USA或欧洲EMEA的食物和药品管理局批准一种药物以药物合法地准入市场，要依赖于该药物能够满足于加到药品制造商的很多的条件、其最终目的是保护患者。所以每个生产者必须提供证明来表明例如药品的纯度、贮存稳定性和生产的可重复性。所述三个方面只是小选择，但在生物药物的许可中确实起重要作用，生物药物是，含有大分子、由天然物质构成的或由其衍生的活性物质(蛋白质、核酸、蛋白多糖、多糖，等等)的药物。这些在许可范围内所提出的对(生物-)药物的要求常常很难满足。例如，基于蛋白质的活性物质在一个多多少少复杂的细胞有机体中进行制备后必须进行强烈的且复杂的多步纯化，并且不应例如因氧化或其他自发的化学反应而以不受控的方式改变其结构。此外，最终产物应具有可接受的贮存稳定性，目的是为了不需要在生产者和使用产品的医生或患者或者医疗机构之间提供复杂且昂贵的供应网，特别是对于蛋白质而言，重要的是要满足保持其正确的二次结构(折叠)的要求，这通常只有在相当努力下才能满足。
在MCP-1-蛋白情况下，市售购得的制剂质量在很多方面常常是足够的，例如用于体内-试验。不过如发明人在其工作过程中发现，同一制剂完全不适用于制备许可的药物。在发明人的实验中，在对患者给药前在室温下将其短时间放在溶液中，例如在医生诊室或病房中不能完全排除，例如，导致在MCP-1-制剂中产生起初被视为杂质的“分解”产物。对起初作为物质的Gln-MCP-1进行更强的纯化，虽然短期可回收较高纯度，但在溶液中和在室温下短期保存后，该制剂重新变得不稳定。如果简单方法不是没有希望，基于这种不稳定有效物质制剂促进药物法规许可的方法是相当困难的。
令人惊讶地，根据本发明的教导可以克服这些问题，在原来的制备和纯化方法中包括一个不常用的、第一眼看上去高度违反生产性的方法步骤，即，在较高温度下进行培育(按照早先的观点，只有多相性才要求这样)。可以在本发明人详细分析并优化的条件下进行这种培育，即，原来活性物质Gln-MCP-1快速定量转化为起初被视为杂质的pyroGlu-MCP-1-形式。后一形式对于蛋白质改性的影响，如在较高温度下等进行培育，是很稳定的。因此可以得到一种MCP-1-制剂，由于较高纯度和均匀性、杰出的可重复制备性和其贮存稳定性，使该制剂适合用作药物活性物质，有希望满足在相应许可方法中提出的严格要求，并可以使其在MCP-1作用基础上实施新治疗方法。
根据本发明一个部分方面，使用一种按照上述和权利要求所述方法制得的pyroGlu-MCP-1-制剂-用来治疗性处理血管梗阻病，特别诸如冠状动脉病(coronary arterydisease，CAD)、末梢闭塞性血管病(peripheral arterial occlusive disease，PAOD)、脑动脉和肠膜动脉梗阻症，或者-用来制备一种用于治疗血管梗阻病，特别是象冠状动脉病(coronaryartery disease，CAD)、外周闭塞性血管病(peripheral arterial occlusive disease，PAOD)、脑动脉和肠膜动脉梗阻症的药物。
本发明还能够实施用于治疗患有所述血管梗阻病患者的方法，其中，对患者例如以注射或输入方法给药通过转化制得的pyroGlu-MCP-1-制剂或者使用这种pyroGlu-MCP-1-制剂制得的药物。
还需说明有关各个优化的方法参数，在较高温度例如甚至60℃，经过较长时间，必要时经过数天培育蛋白制剂，对于生物技术来说有些勉强。对于以上作为最佳公开的，培育溶液为中性至酸性的pH-值违反原来的化学逻辑从谷氨酰胺转化为环形焦谷氨酸是亲核的取代反应，该反应中，在谷氨酸的C-α-氨基的攻击性氮原子上的一对自由电子对进攻C-γ-酰基的C-原子。酸性pH-值将使C-α-氨基质子化增强，因而对反应速度起到负面作用。但根据发明人的证实则并非如此。可考虑的解释(并不限于该解释)是，折叠的MCP-1-蛋白对于N-末端形成一个微环境，其中，尽管周围的水溶液是酸性pH-值，但氨基以非质子化存在，即一对自由电子对可用于亲核攻击。
实施例实施例1根据本发明方法制备pyroGlu-MCP-1-制剂发酵用大肠杆菌K12(W3110)菌株进行发酵。用ColE1-质粒(pBR322-衍生物)使该菌株转化，其含有以下成分在通常使用的促进剂(磷酸(酯)酶，pPhoA)控制下的hMCP-1的基因序列、ColE1-复制源和用于四环素的抵抗基因。为了发酵，该生产菌株在振荡烧瓶中在含有四环素的LB培养基中进行预培养。培育在37℃下进行直到OD为1。将预培养体转移到发酵罐(Fermenter)中，并在搅拌和通风下在37℃进一步培育。培养基含有葡萄糖、各种不同的盐、微量元素、酵母提取物、氨基酸和四环素。用氨水使pH-值保持在6.8。一旦存在的葡萄糖被消耗，就通过加入葡萄糖使溶解的氧量(pO2)恒定保持为设定值的40％。一旦培育基中的磷酸盐被消耗，磷酸(酯)酶促进剂的诱导作用就自动实施。39小时后，用管状离心机(CEPA)收集生物量，并在-70℃下贮存。
细胞溶解和蛋白纯化步骤用Ultraturrax使冷冻的细胞沉淀重新悬浮于四倍量的溶胞缓冲液(200mM Tris、55mM NaCl、5mM EDTA，pH 7.5)中。用均质器在460bar下通过两个通道(passagen)进行细胞溶解。用CEPA离心机除去细胞碎片。上清液任选地用Polysep II(1.2μm)过滤器(Millipore)过滤，然后装载在由Q琼脂糖FF和SP琼脂糖FF所构成的组合柱上。用溶胞缓冲液使柱平衡。
装柱结束后，用溶胞缓冲液洗涤组合柱，并夹住Q琼脂糖-柱。再用溶胞缓冲液洗涤SP琼脂糖，接着用5M脲(在溶胞缓冲液中)洗涤，并再次用溶胞缓冲液洗涤SP琼脂糖。在线性NaCl梯度液中洗脱产物。
用硫酸铵使洗脱物盐化，直到其终浓度为1.3mol/L，并在3200g下离心15分钟。将残余物装载在苯基琼脂糖-柱上，该柱用1.3M硫酸铵(在溶胞缓冲液中)平衡。
将苯基-琼脂糖流涂覆在用溶胞缓冲液平衡的源30RPC-柱上。用溶胞缓冲液、水和缓冲液A(5％EtOH、0.1％TFA)进行洗涤。以从20％缓冲液B(95％EtOH、0.1％TFA)到70％缓冲液B的线性梯度液以10柱体积淋洗该产物。
转化步骤洗脱物以不同的缓冲液例如，10-40mM，pH 6.0-7.4的磷酸盐缓冲液稀释，直到1∶10。根据一优选实施方案，作为转化溶液的最终pH值要求为6.0～6.5。蛋白质浓度为0.2～1.0mg/mL。
以无菌方式过滤该溶液，并在轻微的搅动(60rpm)下在35-80℃的温度(在不同批料中)下培育。通过HPLC-分析跟踪反应进程。
最后纯化步骤一旦反应达到终点，就将转化溶液装载在缓冲液A(40mM磷酸盐，pH 6.0)中平衡过的SP琼脂糖HP-柱上。用线性NaCl梯度液洗脱。洗脱物中NaCl浓度约为350mmol/L，蛋白质浓度约为3mg/mL。用缓冲液A稀释洗脱物直到导电率相当于250mM NaCl。然后用40mM磷酸盐，pH 6.0、250mM NaCl再次稀释，直到蛋白质浓度为1mg/mL。无菌过滤所形成的大量溶液，在4℃或-70℃贮存，以进行配制。
分析上述转化步骤的进程由RP-HPLC跟踪。记录从转化反应开始(t0)到时间点t＝24小时、t＝48小时和t＝120小时的洗脱曲线色谱。可看到
图1所示的四个色谱，在35℃培育温度下48小时后，约90％蛋白转化为pyroGlu-MCP-1。HPLC分析表明准确形成了两个二硫桥。
图2表示在所述条件下从Gln-MCP-1到pyroGlu-MCP-1的反应动力学。可以看到，在反应持续时间有一种杂质增加，这种杂质在图2中以“变体2”表示的，并不再具有特征。
在0.1M乙酸钠缓冲液，pH 5.5，或者0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH 3.5中进行的转化步骤中可观察到类似的反应进程(数据未示出)。
重复以上描述的反应，除了代替35℃的反应温度，选择24℃、60℃和80℃的温度。如表3所归纳的数据可见，在24℃下经过合理的时间后，得不到满意的pyroGlu-MCP-1产率。反之，在60℃和80℃下，可观察到明显较高的反应速度。在80℃下的反应速率约为室温下速率的50倍。
表3
n.d.＝未测定，在指定时间后未达到反应终点较高的反应温度有利于副产物或分解产物的形成，并降低纯度，尤其是在80℃下进行试验时更是如此(表3)。
图3表示以较高分辨率表示pyroGlu-MCP-1-制剂的洗脱曲线色谱，它是在表3所综述的条件(20mM磷酸盐缓冲液，35℃、60℃或80℃)下得到的。由此可见，在较高温度较短培育时间(例如在80℃下3小时)比在35℃下培育5天更明显出现有MCP-1-副产物或分解产物的更多杂质。
在某些方法方案下，在其他方面恒定的实验条件(20mM磷酸盐缓冲液，pH 6.0)下，在生产技术以乙醇(EtOH)含量(例如5％)为条件对反应速率或产物纯度不起负面影响。
实施例2按照本发明的另一个方法制备pyroGlu-MCP-1-制剂发酵、细胞溶解和蛋白纯化步骤如实施例1中所述进行。
转化步骤用PBS，0.02％Tween 20将源30 RPC的洗脱物稀释到1∶10。蛋白质浓度约为0.2～0.5mg/mL，pH约为7.4。除了缓冲液成分外该溶液还含有来自上述源30 RPC-步骤洗脱物的约3.5％EtOH和0.01％TFA。用Millipak 20(0.2μm，Millipore)将该溶液无菌过滤到聚丙烯瓶中，并在轻微振动下于35℃培育。通过HPLC-分析跟踪反应进程。一旦反应结束，对PBS 0.02％Tween 20使用Pellikon 2 UDF-膜(3k，Millipore)隔膜超滤(ultra diafiltered)该转化溶液，并调节蛋白浓度为0.1mg/mL。经过Millipore GV-过滤器(0.22um)以1mL-份无菌装入玻璃容器中。
分析由RP-HPLC跟踪转化步骤进程。从图4可见，5天后大于90％的蛋白质转化为pyroGlu-MCP-1，令人惊讶地，尽管经历较长的培育时间，但得到很高的纯度95％(表3)。从含有20mM磷酸盐缓冲液的配料和含有20mM磷酸盐缓冲液加150mM盐的配料(实施例1，表3，行3和行6)相比较可知，在有PBS的配料作为培育溶液中，相对低的速度常数可归因于较高的盐浓度、离子强度或渗透性。
实施例3基于实施例1或实施例2制得的MCP-1-制剂制备药物将实施例1或实施例2中得到的pyroGlu-MCP-1-制剂在PBS(氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾；pH 7.0)，此外还含有0.02％Tween 20中稀释到0.1mg/mL的浓度，并转移到1-mL-体积的玻璃容器中。制得的药物溶液是澄清、无色且无味的，可以通过注入或输入给药。
实施例4pyroGlu-MCP-1和Gln-MCP-1生物活性的比较测量原则MCP-1结合到MCP-1受体CCR2b并活化MCP-1受体CCR2b。受体活化导致钙流进入胞液中。这可使用荧光成像平板读数器(FLIPR；分子器件)进行测量。为此，将失活的荧光颜料酯Fluo-4AM，置入在其表面表达hCCR2b的细胞中，然后通过细胞内的酯酶将这种酯进行分裂。以这种形式使荧光颜料结合Ca2+-离子。用488nm波长激发时，在528nm发射一个峰。发射强度取决于胞液的钙浓度。发射光的强度变化也与胞液中的钙浓度相关，该钙浓度又取决于受体的活化状态。
在加入MCP-1后一种特征性的时间触发的测量信号示于图5。由此可见，加入MCP-1后迅速释放钙，钙与荧光度明显升高相联系。施用(a)几秒后已达到最大值(b)。施用(a)和最大激发(b)之间的时间间隔约为20-30秒。
在以下描述的实验中使用最大值进行评价，因诸如钙诱导的钙流入的二级效应影响较小，因而可以进行更准确的测量。
制备稳定表达CHO/hCCR2B-K1细胞人CCR2b受体(基因库-保藏号D29984)的编码区经PCR放大。然后1.08kb BamHI-XbaI片段被克隆进一个表达载体。用这作为表达载体的质粒将CHO-K1-细胞转染。
所述细胞在基于Ham′s F12介质的培养基中进行培养，并有规律地传代。在测量的前一天，5000细胞铺在有40μl培养基的384-孔-试验板(CorningCostar)中，在37℃、5％CO2、95％相对湿度下使其粘附过夜(约24小时)。所有试样进行四次测量。
在实验的一天首先制备物质板。对于不同的MCP-1-制剂，使用具有0.1％BSA(无蛋白酶)的Hanks缓冲液作为稀释缓冲液。使用具有0.1％BSA的Hanks缓冲液作为空白对比。然后向细胞加入40μl/孔的Fluo-4染料介质，在37℃、5％CO2、95％相对湿度下培育制剂45分钟。然后用60μl洗涤缓冲液洗涤着色的细胞四次，其中，每孔中保留25μl洗涤缓冲液的剩余量。然后在室温下用洗涤缓冲液再培育细胞5分钟。
为了进行荧光测量，调节FLIPR测量仪器，使得着色和未着色的细胞以至少1∶5因子而不同，并且着色的孔具有约11000荧光计数。其他的FLIPR-的设定值如下激发488nm
发射510-570nm(带通)负校正Hanks/BSA(＝和空白对比)偏差减值(substraction)6(＝加入物质前使所有孔相等于0)预浸润尖端使用来自物质板的25μl有关物质溶液(＝使附着假象(artefakts)为最小化)测量过程由以下步骤组成6次5秒间隔的进程加入15μl的物质60次1秒间隔的进程18次5秒间隔的进程为了评价，使用加入物质后78间隔的最大信号。作为对比配料，使用空白对比用于负校正正对比(ATP)用于检查着色参考对比(“标准”)-监视细胞上受体表达-用于测定未知样品活性的计算基础在相同的稀释步骤中，使待测试的样品和参考对比平行滴加。选择试验中所使用的浓度，以使得其位于参考对比的EC50-范围内。
本发明和非本发明的MCP-1-制剂的比较两种按照本发明方法制得的pyroGlu-MCP-1-制剂(“Batch071100kh”和“Batch 0141921”)和一种由重组体法制得的MCP-1-制剂，该制剂N-末端的谷氨酰胺-基没有按上述本发明方法步骤中转化为焦谷氨酸-基(由Peprotech得到的MCP-1-制剂)，使用上述实验体系进行测试并对比。从如上所述记录的测量曲线确定EC50-值(见图6)。
对于两种pyroGlu-MCP-1-制剂而言，得到实际上相同的EC50值，而没有根据本发明并未进行N-末端修饰的MCP-1-制剂的值明显不同(图6)。后一制剂的EC50-值低了约2～3的因子(pyroGlu-MCP-1EC50＝7.82nM；由Peprotech得到的MCP-1-制剂EC50＝20.76nM)。
如下计算两种制剂的生物活性首先对浓度为10-8M的pyroGluMCP-1进行正校正，即，将浓度10nM的pyroGlu-MCP-1下所得到的值设定为100％。这是在曲线升高的近似线性范围内。然后借助这百分比信号计算其他制剂的活性，例如Peprotech得到的MCP-1，按照下式计算％活性(样品)＝RFU(在le-8M时的样品)×100％/RFU(在le-8M时的标准)。
在上述实施例中(如表4所示)得到，以pyroGlu-MCP-1-制剂计，未N-末端-修饰的MCP-1-制剂的活性值为48％。
表4测量值(负校正Hanks/BSA；偏差减值6)
％活性(MCP-1(Peprotech))＝6151×100％/12898.3＝48％活性实施例5pyroGlu-MCP1的温度敏感性在56℃或95℃下培育PyroGlu-MCP-1 1或2小时。之后使用实施例4中的测试体系测量尚存在的生物活性。
实验表明，在56℃下，对pyroGlu-MCP-1-制剂培育一小时或二小时都未变性。但，如图7所示，在95℃下的培育导致很明显地变性作用。
实施例6治疗患有动脉梗阻症的患者为了治疗PAOD-患者，将一种如上制得的pyroGlu-MCP-1制剂调节到1.2和120μg/ml之间的浓度。使用前，使该溶液直接调到0.1～10μg/ml的最终浓度，对患者以2～12ml/分钟的流率向靠近血管梗阻区域附近以动脉内输入1～6小时的时间。在1～7天后再次输入。
权利要求
1.一种由重组制得的Gln-MCP-1制备pyroGlu-MCP-1的方法，其中，Gln-MCP-1-在30℃～80℃的温度下，-在缓冲溶液中，用--10mM～160mM的盐浓度，和--2～7.5的pH-值进行培育，直到至少90％的MCP-1以pyroGlu-MCP-1的形式存在。
2.根据权利要求1的方法，其中，该缓冲溶液是浓度为20mM～50mM并且pH-值为3.5～6.5的磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1或2之一的方法，其中，缓冲溶液还含有清洁剂、抗氧化剂、防腐剂、稳定剂、抗微生物试剂和/或络合剂。
4.一种制备pyroGlu-MCP-1-制剂的方法，该方法至少包括以下步骤-制备Gln-MCP-1-制剂，通过在宿主细胞中表达编码MCP-1的基因结构而进行，-任选浓缩和/或纯化含于Gln-MCP-1制剂的Gln-MCP-1-，-根据方法1～3，将Gln-MCP-1-制剂的Gln-MCP-1转化为含有pyroGlu-MCP-1的pyroGlu-MCP-1-制剂，和-任选重新缓冲和/或进一步纯化pyroGlu-MCP-1-制剂，其中，以MCP-1的总量计，pyroGlu-MCP-1在所得pyroGlu-MCP-1-制剂中的量至少为90％。
5.含有权利要求4制得的pyroGlu-MCP-1-制剂的组合物，其中，pyroGlu-MCP-1-制剂所含MCP-1的至少90％是以pyroGlu-MCP-1形式存在。
6.制备含有pyroGlu-MCP-1的药物的方法，其中使用权利要求4制得的pyroGlu-MCP-1-制剂。
7.含有权利要求4制得的pyroGlu-MCP-1-制剂的药物或药物组合物，其中所含的MCP-1至少90％以pyroGlu-MCP-1形式存在。
8.根据权利要求7的药物或药物组合物，其在具有氯化钠和任选的清洁剂作为添加剂的缓冲溶液中含有pyroGlu-MCP-1。
9.权利要求4制得的pyroGlu-MCP-1或者pyroGlu-MCP-1-制剂的用途，它用于制备药物组合物，以用于治疗血管梗阻病，特别是冠状动脉病(coronary artery disease，CAD)、末梢闭塞性血管病(peripheral arterial occlusivedisease，PAOD)、脑动脉和肠膜动脉梗阻症。
10.根据权利要求4的方法制得的重组MCP-1-制剂，其生物活性与一种重组体制得的、没有使用权利要求1方法的MCP-1-制剂(N-末端未修饰的MCP-1-制剂)的活性之比为100∶48或更高。
11.重组体制得的MCP-1-制剂，其中至少90％的MCP-1-蛋白质是以pyroGlu-MCP-1存在。
12.根据权利要求11的MCP-1-制剂，其中pyroGlu-MCP-1以未糖基化的形式存在。
13.用于诱导生物或生理反应的方法，其取代或强化内生天然的MCP-1-蛋白质的生物或生理作用，其特征在于，权利要求5的组合物或者权利要求7的药物或者权利要求10到12至少一项的制剂以适合于引起生物或生理作用的量添加到细胞或组织或器官中。
14.根据权利要求13的方法，其中，所述细胞或组织或器官具有CCR-2和/或CCR-4受体。
15.根据权利要求14的方法，其中，所述细胞是哺乳动物细胞，其天然或重组体地表达MCP-1-受体-亚型CCR2，特别是CCR2b。
全文摘要
本发明涉及一种由重组体制得的Gln－MCP－1制备pyroGlu－MCP－1的方法，该方法中，Gln－MCP－1在30℃～80℃的温度下，在具有10mm～160mm的盐浓度和2～7.5的pH－值的缓冲溶液中进行培育，直到至少90％的MCP－1以pyroGlu－MCP－1的形式存在。
文档编号A61K38/19GK1784420SQ200480011883
公开日2006年6月7日 申请日期2004年4月13日 优先权日2003年5月2日
发明者罗伯特·万德尔, 罗曼·尼西纳, 伦道夫·塞德勒, 马丁·伦特, 亨利·杜兹 申请人:贝林格尔.英格海姆国际有限公司