专利名称：使用67 kDa层粘连蛋白受体筛选药物的方法和由此获得的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种使用67kDa层粘连蛋白受体筛选药物的方法和由此获得的药物。
背景技术：
67kDa层粘连蛋白受体(以下也称之为“67LR”)是从编码295个氨基酸的mRNA翻译的37kDa前体蛋白质，在细胞内受到脂肪酸等的酰基化聚合反应而经由均二聚化或者杂二聚化变成67kDa的蛋白质，它与整连蛋白类一起向细胞膜表面移动后，才能作为层粘连蛋白受体起作用(Biochemistry，1995，3411276-11287，T.H.Landowski等；J.Cell.Biochem，1998，69244-251，S.Buto等)。而且，已知37kDa前体蛋白质作为核糖体相关蛋白质p40参与蛋白合成，甚至与作为多药耐药性相关蛋白质(MGr1-Ag)被报道的蛋白质相同(Cell.Mol.Life Sci.，2002，591577-1583，Y.Shi等)。该层粘连蛋白受体由于在很多癌细胞上高表达的数据，被认为是作为泛肿瘤特异性移植抗原T细胞的免疫原的瘤胎抗原(Anticancer Research，1999，195535-5542，J.H.Coggin，Jr等)。尽管层粘连蛋白受体除了67LR之外还被报道10几种，但在其中67LR与癌的关联被强烈启示。
根据是否在癌细胞中检测出，67LR在很多癌中作为显示人癌患者恶性程度的重要的预后因子为人所知(Breast CancerResearch and Treatment，1998，52137-145，S.Menard等；Clinical Cancer Research，1997，3227-231，G.Fontanini等；Clinical Cancer Research，1996，21777-1780，F.Basolo等；J.Natl.Cancer Inst，1991，8329-36，V.Cioce等)，在动物模型等中启示67LR参与癌细胞的增殖、移动、浸润、转移等。例如，有报道称，在乳癌患者中67LR阳性的患者的生存率比67LR阴性的患者低得多。表示出尽管作为67LR的配体的层粘连蛋白的表达对预后没有影响，但是受体67LR的表达对预后带来负面结果(Breast Cancer Research and Treatment，1998，52137-145，S.Menard等)。
在这些认识下，报道了几个期望通过抑制67LR的表达来显示抗肿瘤效果的实验。报道了将67LR的反义RNA导入癌细胞株制造的67LR低表达细胞株，与最初的亲株细胞相比，在小鼠体内显著引起增殖能力的降低及转移能力的降低，其结果改善了小鼠个体的生存率(British Journal of Cancer，1999，801115-1122，K.Satoh等)。而且，报道了低67LR表达细胞株与亲株相比，肿瘤血管新生降低以及作为血管新生促进因子的VEGF(血管内皮细胞生长因子)的产生本身也降低(Cancer Letters，2000，153161-168，M.Tanaka等)。同样，在使用相对于67LR的抗体的肿瘤转移试验中，也发现了与反义试验相同的效果(Jpn.J.Cancer Res.，1999，90425-431，K.Narumi等)。
在非肿瘤相关中，对67LR的功能也有几个报道。已有报道在缺血动物模型中被诱导的新生血管的增生被源自与67LR结合的层粘连蛋白的肽(半胱氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸)或者源自EGF(表皮生长因子)衍生的肽(半胱氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-酪氨酸-丝氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-精氨酸-半胱氨酸)所抑制(Am.J.Pathol，2002，160307-313，D.Gebarowska等)。报道了被指出与被对血管内皮细胞的剪切力诱导的动脉硬化相关的eNOS(内皮型一氧化氮合酶)表达和NO产生，被源自与67LR结合的层粘连蛋白的五肽(酪氨酸-异白氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸)所抑制(J.Biol.Chem.，1999，27415996-16002，T.Gloe等)。
在最近的报道中，报道了67LR作为被认为是克罗伊茨费尔特-雅各布病的病因的朊病毒蛋白质的受体作用，结合朊病毒而被内在化，并且该结合与内在化被缺失膜域的突变体67LR的分泌所抑制(EMBO J.2001，205863-5875，S.Gauczynski等)。
而且，报道了67LR在作为T细胞的亚型的CD45RO+/CD45RA-的记忆细胞的CD4+CD8-或CD4-CD8+的亚型群中表达，启示出67LR对免疫系统的作用(J.Immunol，1999，1633430-3440，S.M.Canfield等)。
还有几个关于67LR的mRNA表达的报道。报道了该表达被癌抑制因子p53或抗癌因子TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、IFN-γ(干扰素-γ)所抑制(Biochem.Biophys.Res.Commun.，1998，251564-569，N.Clausse等)。但是，对于被推定为与这些多用途功能相关的67LR的低分子化合物尚未被报道。
另一方面，儿茶素类中，表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，以下也称之为“EGCG”)，是占茶的儿茶素的约50％的主要作用成分。另外含有表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素(以下也分别称之为“EGC”、“ECG”、“EC”)等。
茶自古以来作为药使用具有古老的历史，近代以来得以对其功效和成分的关系进行分析。其中EGCG是1947年被A.Bradfield等发现的成分(J.Chem.Soc.，1947，322249，A.E.Bradfield等)。
作为包括EGCG的茶儿茶素类的生理作用，已报道了抗氧化、抗癌、抑制血浆胆固醇上升、抑制血压上升、抑制血小板凝集、抑制血糖上升、预防痴呆、抗溃疡、抗炎症、抗变态反应、抗菌、抗龋齿、抗病毒、解毒、改善肠内菌群、除臭等(茶的功能，村松敬一郎等编辑，学会出版中心，2002)。
其中，抗癌作用被非常多地报道，有抗突变作用、抗致癌促进作用、抗肿瘤增殖抑制作用、抗浸润/转移抑制作用、抗血管新生抑制作用。在最近的报道中，报道了EGCG抑制白血病细胞的DNA合成并诱导细胞凋亡(Int.J.Mol.Med.，2001，7645-652，D.M.Smith等)，而且EG CG抑制乳癌细胞株的增殖(J.Cell.Biochem.，2001，82387-398，K.T.Kavanagh等)。并且，还报道了与正常细胞相比，EGCG强烈地抑制癌细胞的增殖等(Arch.Biochem.Biophys.，2000，376338-346，N.Ahmad等)。
关于浸润、转移，报道了在使用人工基底膜(matrigel)的浸润试验中儿茶素类抑制高转移性细胞的浸润，并且EGCG抑制癌细胞向纤粘连蛋白或层粘连蛋白的粘着(Cancer Lett.，1995，9827-31，M.Suzuka等、Cell Biol.Int.，1993，17559-564，M.Isemura等；Cancer Lett.，2001，17315-20，Y.Suzuki等)。
而且，最近报道了这些儿茶素作用的分子水平的分析。例如，EGCG浓度依赖性地抑制被启示与癌关联的Her-2(人类表皮生长因子受体-2)抗原高表达细胞的增殖。报道其作用机理是通过抑制Her-2的磷酸化，抑制其下游信号传送(Cancer Res.，2002，62652-655，S.Pianetti等)。
而且，报道了EGCG等儿茶素抑制与肿瘤增殖密切相关的血管新生。显示出其机理是儿茶素抑制血管内皮细胞生长因子VEGF的受体VEGFR-1的磷酸化。报道这并不依赖于儿茶素的抗氧化、抗自由基活性(Cancer Res.，2002，62381-385，S.Lamy等)。
同样，报道了儿茶素类抑制其它生长因子PDGF-BB(血小板衍生生长因子-BB)引起的在血管平滑肌细胞中的PDGF-Rβ(血小板衍生生长因子受体β)的磷酸化，从而抑制血管的肥厚(FASEB J.，2002，16893-895，A.Sachinidis等)。
另外，报道了EGCG抑制EGF(表皮生长因子)-2引起的活体内的血管新生以及内皮细胞的增殖(Nature，1999，389381，Y.Cao等)。尽管报道了EGCG与诱导细胞凋亡的Fas(脂肪酸合成酶)蛋白质结合(Biochem.Biop hys.Res.Commun.，2001，2851102-1106，S.Hayakawa等)，但是尚不清楚上述EGCG的作用是否与Fas相关，但启示了存在其他与EGCG相互作用的因子。
儿茶素除了抗肿瘤效果之外，其各种生理作用在分子水平上变得明确。报道了EGCG抑制在肝细胞中的葡萄糖的产生，并且促进胰岛素受体和IRS-1(胰岛素受体底物-1)的酪氨酸磷酸化，从而有抗糖尿病的作用(J.Biol.Chem.，2002，27734933-34940，M.E.Waltner-Law等)。
而且，报道了在帕金森病模型小鼠中EGCG显示强的神经保护作用(J.Biol.Chem.，2002，27730574-30580，Y.Levites等)，从这一报道期待抑制多种神经障碍。报道了EGCG或其甲基化物抑制作为变态反应的要因的在嗜碱粒细胞中的FcεRI(高亲和力IgE受体)的表达(J.Agric.Food Chem，2002，505729-5734，Y.Fujimura等)，而且EGCG抑制在软骨中被IL-1β(白细胞介素-1β)诱导的COX-2(环氧化酶-2)或NO合成酶2的表达(Free Radical Biology & Me dicine，2002，331097-2002，S.Ahmed等)。
但是，就本发明人们所知，关于EGCG通过67LR作为细胞增殖抑制因子等发挥作用的事实，并且可以将67LR作为靶应用于具有细胞增殖抑制作用等的低分子化合物的药物筛选中的事实，迄今为止还没有任何报道。
(非专利文献1)
Biochemistry，1995，3411276-11287(非专利文献2)J.Cell.Biochem.，1998，69244-251(非专利文献3)Cell.Mol.Life Sci.，2002，591577-1583(非专利文献4)Anticancer Research，1999，195535-5542(非专利文献5)Breast Cancer Research and Treatment，1998，52137-145(非专利文献6)Clinical Cancer Research，1997，3227-231(非专利文献7)Clinical Cancer Research，1996，21777-1780(非专利文献8)J.Natl.Cancer Inst.，1991，8329-36(非专利文献9)Breast Cancer Research and Treatment，1998，52137-145(非专利文献9)British Journal of Cancer，1999，801115-1122(非专利文献10)Cancer Letters，2000，153161-168(非专利文献11)Jpn.J.Cancer Res.，1999，90425-431(非专利文献12)Am.J.Pathol.，2002，160307-313
(非专利文献13)J.Biol.Chem.，1999，27415996-16002(非专利文献14)EMBO J.，2001，205863-5875(非专利文献15)J.Immunol.，1999，1633430-3440(非专利文献16)Biochem.Biophys.Res.Commun.，1998，251564-569(非专利文献17)J.Chem.Soc.，1947，322249(非专利文献18)茶的功能，村松敬一郎等编辑，学会出版中心，2002(茶の機能、村松敬一郎ら編、学会出版センタ-、2002)(非专利文献19)Int.J.Mol.Med.，2001，7645-652(非专利文献20)J.Cell.Biochem.，2001，82387-398(非专利文献21)Arch.Biochem.Biophys.，2000，376338-346(非专利文献22)Cancer Lett.，1995，9827-31(非专利文献23)Cell Biol.Int.，1993，17559-564(非专利文献24)Cancer Lett.，2001，17315-20(非专利文献25)Cancer Res.，2002，62652-655
(非专利文献26)Cancer Res.，2002，62381-385(非专利文献27)FASEB J.，2002，16893-895(非专利文献28)Nature，1999，389381(非专利文献29)Biochem.Biophys.Res.Commun.，2001，2851102-1106(非专利文献30)J.Biol.Chem.，2002，27734933-34940(非专利文献31)J.Biol.Chem.，2002，27730574-30580(非专利文献32)J.Agric.Food Chem.，2002，505729-5734(非专利文献33)Free Radical Biology & Medicine，2002，331097-2002发明内容本发明人基于上述课题进行深入研究，结果发现67LR能够作为具有细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)感染抑制作用的药物的靶来使用，从而完成了本发明。
即本发明如下所述。
一种筛选药物的方法，所述药物具有细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特-雅各布病感染抑制作用，该方法包括如下步骤定性或定量测定试验化合物与67kDa层粘连蛋白受体的结合程度，由该测定结果，当试验化合物结合到67kDa层粘连蛋白受体上时，判定该试验化合物是具有细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特-雅各布病感染抑制作用的药物。
如[1]所述的筛选方法，所述药物是具有细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用和/或癌细胞转移活性抑制作用的药物。
一种通过如[1]或[2]所述的筛选方法获得的药物。
如[1]至[3]的任一项所述的药物，其有效成分是带有没食子酰基的化合物。
如[4]所述的药物，所述化合物是儿茶素类。
如[5]所述的药物，所述儿茶素类是表没食子儿茶素没食子酸酯。
如[3]至[6]的任一项所述的药物，其用于通过细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特-雅各布病感染抑制作用能够预防和/或治疗的疾病。
如[3]至[6]的任一项所述的药物，其用于通过细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用和/或癌细胞转移活性抑制作用能够预防和/或治疗的疾病。
如[8]所述的药物，所述疾病是癌。
一种药物组合物的制造方法，包括由化学合成方法制备如[3]至[9]的任一项所述的药物的工序，和混合药学上可接受的载体的工序。
由[10]所述的制造方法获得的药物组合物。
一种筛选药物的方法，包括如下步骤定性或定量测定带有没食子酰基的化合物和试验化合物与67kDa层粘连蛋白受体的结合程度，由该测定结果，当试验化合物与67kDa层粘连蛋白受体的结合程度超过带有没食子酰基的化合物与67kDa层粘连蛋白受体的结合程度时，判定该试验化合物是具有与儿茶素类所具有的药理学作用相同作用的药物。
一种筛选药物的方法，包括如下步骤使带有没食子酰基的化合物对67kDa层粘连蛋白受体的结合与试验化合物对67kDa层粘连蛋白受体的结合竞争的结果，当试验化合物结合到67kDa层粘连蛋白受体的位点与带有没食子酰基的化合物结合到67kDa层粘连蛋白受体的位点相同时，判定该试验化合物是具有与带有没食子酰基的化合物所具有的药理学作用相同作用的药物。
如[12]或[13]所述的筛选方法，所述带有没食子酰基的化合物所具有的药理学作用是细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特-雅各布病感染抑制作用。
如[12]或[13]所述的筛选方法，所述带有没食子酰基的化合物所具有的药理学作用是细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用和/或癌细胞转移活性抑制作用。
如[12]至[15]的任一项所述的筛选方法，所述化合物是带有没食子酰基的儿茶素类。
如[12]至[15]的任一项所述的筛选方法，所述儿茶素类是表没食子儿茶素没食子酸酯。
由[12]至[17]的任一项所述的筛选方法获得的药物。
如[18]所述的药物，其用于通过细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特-雅各布病感染抑制作用能够预防和/或治疗的疾病。
如[18]或[19]所述的药物，其用于通过细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用和/或癌细胞转移活性抑制作用能够预防和/或治疗的疾病。
如[20]所述的药物，所述疾病是癌。
一种药物组合物的制造方法，包括由化学合成方法制备如[18]至[21]的任一项所述的药物的工序，和混合药学上可接受的载体的工序。
由[22]所述的制造方法获得的药物组合物。
一种化合物，是与67kDa层粘连蛋白受体结合的化合物，在与带有没食子酰基的化合物结合到该67kDa层粘连蛋白受体的位点相同的位点进行结合。
如[24]所述的化合物，所述化合物是儿茶素类。
如[26]所述的化合物，所述儿茶素类是表没食子儿茶素没食子酸酯。
包含如[24]至[26]的任一项所述化合物的细胞增殖抑制剂。
包含如[24]至[26]的任一项所述化合物的血管新生抑制剂。
包含如[24]至[26]的任一项所述化合物的癌细胞转移活性抑制剂。
包含如[24]至[26]的任一项所述化合物的抗癌剂。
图1是显示实施例1的表面等离子共振传感器测定结果的图。
图2是显示实施例1的细胞增殖试验的结果的图。
图3是显示实施例1的细胞增殖试验的结果的图。
图4是显示实施例2的流式细胞仪分析结果的图。
图5是显示实施例3的细胞增殖试验的结果的图。
图6是显示实施例3的表面等离子共振传感器测定结果的图。
图7是显示实施例4的表面等离子共振传感器测定结果的图。
图8是显示实施例4的细胞增殖试验结果的图。
具体实施例方式
下面详细地描述本发明。
本发明提供一种以67LR作为靶的筛选药物的新方法。
作为本发明的一个实施方式，可以列举一种筛选药物的方法，所述药物具有细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特-雅各布病感染抑制作用，该方法包括如下步骤定性或定量测定试验化合物与67LR的结合程度，由该测定结果，当试验化合物结合到67LR上时，判定该试验化合物是具有细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特-雅各布病感染抑制作用的药物。
本发明中使用的67LR是其本身公知的蛋白质，例如，基于GenBank Accession No.NM_002295登记cDNA序列，按照常规方法将各种库作为模板进行PCR(聚合酶链反应)以加入编码该蛋白质的序列，可以容易地获得67LR的cDNA。而且，以能够表达蛋白的形式将这样获得的cDNA插入市售的各种载体(vector)中，从而可以容易地构建表达该蛋白质的细胞株及获得该蛋白质本体。除此之外还有几个cDNA取得和蛋白质表达的报道(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1988，856394，H.You等；BritishJournal of Cancer，1999，801115-1122，K.Satoh等；Biochemistry，1995，3411276-11287，T.H.Landowski等)。
另外，67LR作为基因是37kDa的40S核糖体结合蛋白质，但是已知在膜上表达时变成67kDa。在本发明中，只要是在膜上表达时变成67kDa的蛋白质，且具有与层粘连蛋白结合的粘附性的蛋白质，都定义为本发明中的67LR，不仅可以是完整的蛋白质，也可以使用其部分肽。而且，根据筛选手段，67LR例如可以作为精制的蛋白质、作为可溶性蛋白质、作为结合于载体上的形态、以及作为与其它蛋白质的融合蛋白质，适当地使用。
在本发明中，通过将试验化合物与67LR结合，筛选具有细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特-雅各布病感染抑制作用的药物。这时，作为试验化合物的形态，只要是细胞提取物、细胞培养上清液、发酵微生物产生物、生物提取物、植物提取物、精制或粗精制蛋白质、肽、非肽化合物、合成低分子化合物、天然化合物、基因文库等通常药物筛选中所使用的形态就可以，而没有特别的限制。
试验化合物与67LR的结合，可以根据试验化合物的形态选择适当的手段，例如可以用将试验化合物添加到67LR表达细胞培养液中的方法等进行。
如上所述地处理，测定试验化合物与67LR的结合程度，这里使用的测定方法可以采用定性手段和定量手段的任意一种。作为测定结合程度的手段的一个例子，可以列举如后述的实施例中所示的使用表面等离子共振传感器的方法。
这样测定结合程度的结果，当试验化合物实质上结合到67LR上时，就可判定该试验化合物是具有细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特-雅各布病感染抑制作用的药物。特别是，本发明的筛选方法适合用于筛选具有细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用和/或癌细胞转移活性抑制作用的药物。
如后述的实施例中所示，被启示具有细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特-雅各布病感染抑制作用的带有没食子酰基的化合物，结合到67LR上，显著地抑制其细胞增殖。
上述事实启示带有没食子酰基的化合物通过67LR作为细胞增殖因子发挥作用，进一步，可以认为与带有没食子酰基的化合物相同地结合到67LR上的物质，具有与带有没食子酰基的化合物相同的作用，即，细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特-雅各布病感染抑制作用。
因此，在本发明的筛选方法中，与67LR结合的试验化合物，可以判定为具有细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特-雅各布病感染抑制作用的药物。
另外，作为上述举出的带有没食子酰基的化合物，可以列举表没食子儿茶素没食子酸酯及其3-甲基取代的衍生物，或表儿茶素没食子酸酯等带有没食子酰基的儿茶素类；带有没食子酰基的多酚类；三没食子酰基葡萄糖、五没食子酰基葡萄糖、小木麻黄素、邻苯三酚等，优选可以举出表没食子儿茶素没食子酸酯。
接下来描述本发明的筛选方法的其它实施方式。
作为本发明中的其它实施方式，提供了一种筛选药物的方法，包括加入到67LR中，再使用带有没食子酰基的化合物。即，可以列举一种筛选药物的方法，包括如下步骤定性或定量测定带有没食子酰基的化合物和试验化合物与67LR的结合程度，由该测定结果，当试验化合物与67LR的结合程度超过带有没食子酰基的化合物与67LR的结合程度时，判定该试验化合物是具有与带有没食子酰基的化合物所具有的药理学作用相同作用的药物。
另外，可以列举一种筛选药物的方法，包括如下步骤使带有没食子酰基的化合物对67kDa层粘连蛋白受体的结合与试验化合物对67kDa层粘连蛋白受体的结合竞争的结果，当试验化合物结合到67kDa层粘连蛋白受体的位点与带有没食子酰基的化合物结合到67kDa层粘连蛋白受体的位点相同时，判定该试验化合物是具有与带有没食子酰基的化合物所具有的药理学作用相同作用的药物。
如后述的实施例中所示，67LR的单克隆抗体抑制带有没食子酰基的化合物对67LR的结合，其结果抑制了带有没食子酰基的化合物的细胞增殖抑制效果。相反，带有没食子酰基的化合物抑制抗67LR抗体对67LR的结合。即，带有没食子酰基的化合物的结合位点与抗体识别位点重叠。由此，通过将带有没食子酰基的化合物和试验化合物提供到对67LR的竞争反应中，当试验化合物结合到与带有没食子酰基的化合物相同的位点时，可以认为该试验化合物具有与带有没食子酰基的化合物所具有的作用相同的作用。
前面描述了作为本发明的其它实施方式的不使用带有没食子酰基的化合物的筛选方法的详细说明，但是这些记载也适用于使用带有没食子酰基的化合物的本发明的实施方式的情况。而且，这里所说的本发明的实施方式中提供到筛选的带有没食子酰基的化合物，例如如后述的实施例所示可以用PBS等缓冲液适当稀释而使用。另外，将试验化合物和带有没食子酰基的化合物添加到67LR表达细胞培养液中以引起它们的竞争反应时，试验化合物和带有没食子酰基的化合物的添加顺序没有特别的限制。
如上所述地被筛选的药物，可以用作通过细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特-雅各布病感染抑制作用能够预防和/或治疗的疾病的药物。这些疾病中，作为本发明中最合适的疾病可以列举癌。
另外，在本发明中，一旦药物通过筛选被选择之后，该药物可以通过常规的化学合成方法等制造。另外，也可以混合药学上可接受的载体。即，在本发明中，其要旨还包括一种药物组合物的制造方法，以及通过该制造方法获得的药物组合物，所述制造方法包括由化学合成方法制备通过如上所述的筛选方法获得的药物的工序，和混合药学上可接受的载体的工序。
在作为医药组合物使用的情况下，作为药学上可接受的载体，例如可以列举生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂等，可以将它们与药物适当组合经制剂化而提供。而且，对患者给药，例如除动脉内注射、静脉内注射、皮下注射等之外，还可以口服，可根据药物或根据患者的体重或年龄、症状等适当选择。同样，给药量也可以根据药物或根据患者的体重或年龄、症状等选择适当的给药量。另外，如果试验化合物是通过DNA编码获得的，那么也可以将该DNA编入到基因治疗用载体中，进行基因治疗。
在本发明中，其要旨还包括这样一种化合物，它是与67LR结合的化合物，其在与带有没食子酰基的化合物结合到该67LR的位点相同的位点进行结合。这些如后述实施例中所示，被如下事实所充分证实67LR的单克隆抗体抑制带有没食子酰基的化合物对67LR的结合，其结果抑制带有没食子酰基的化合物的细胞增殖抑制效果；相反，带有没食子酰基的化合物抑制抗67LR抗体对67LR的结合；即，带有没食子酰基的化合物的结合位点与抗体识别位点重叠。这些化合物，由于认为具有与带有没食子酰基的化合物所具有的作用相同的作用，因此可用作细胞增殖抑制剂、血管新生抑制剂、癌细胞转移活性抑制剂，即抗癌剂。
实施例下面列举实施例更详细地描述本发明，但是本发明并不限于此。
材料和方法(1).细胞和细胞培养本试验中所使用的人肺癌细胞株A549(ATCC号CCL-185)，在添加10％胎牛血清(FBS)(Bio Source International，Camarillo，CA)的ERD F培养基(极东制药)中，于37℃、水蒸气饱和的5％CO2条件下继代、保持。1L ERDF培养基中加入了1.125g的NaHCO3(和光纯药，Osaka，日本)。细胞在对数增殖期培养保持。人伯基特淋巴瘤(Burkit′s lymphoma)细胞株DND39，在添加5％FBS的RPMI-1640培养基(Nissui，日本)中，于37℃、水蒸气饱和的5％CO2条件下继代、保持。RPMI-1640培养基中加入了100U/mL青霉素(Meiji pharmaceutical Company，Tokyo，Japan)、100mg/mL链霉素(Meiji pharmaceuticalCompany)、12.5mM NaHCO3(和光纯药)和10mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)(和光纯药)。
(2).绿茶儿茶素将绿茶儿茶素，表没食子儿茶素-3-O-没食子酸酯(epigallocatechin-3-O-gallate，EGCG)、表儿茶素-3-O-没食子酸酯(epicatechin-3-O-gallate，ECG)、表没食子儿茶素(epigallocatechin，EGC)、表儿茶素(epicatechin，EC)、儿茶素(catechin，C)、表没食子儿茶素-3-(3-O-甲基)-没食子酸酯(epigallocatechin-3-(3-O-methyl)-gallate，EGCG3″Me)溶解在磷酸缓冲液(PBS)中使其浓度成为5mM。使用时适当解冻后使用。PB S是相对1L的超纯水溶解8.0g NaCl(Nacalaitesque，Inc.)、0.2g KCl(Nacalai tesque，Inc.)、1.15g Na2HPO4(Nacalai tesque，Inc.)、0.2g KH2PO4(Nacalai tesque，Inc.)制得。
咖啡因(caffeine)和槲皮黄素(quercetin)从Nacalai tesque，Inc.购入，前者悬浮于PBS中、后者悬浮于二甲亚砜(DMSO)(Nacalai tesque，Inc.)中制得，使其浓度都成为5mM。
(3).试剂和器械将台盼蓝(和光纯药)悬浮于PB S中使其成为1％的浓度，在121℃高压灭菌20分钟。全反式视黄酸(ATRA)从Sigma(St.Louis，MO)购入并溶解在乙醇中。
提取RNA所用的TRIzol(一步法总RNA提取试剂)从Invitrogen(Carlsbad，CA)购入。0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)水从Sigma(St.Louis，MO)购入。溶解RNA所用的DEPC溶液是通过将DEPC加入到蒸馏水中搅拌2小时使其最终浓度成为0.1％之后，经高压灭菌制得的。Oligotex-dT30及由人胎盘获得的RNase抑制剂是从Takara(Kyoto，日本)购入的，莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)-逆转录酶是从Amersham Pharmacia Biotech(Buckinghamshire，UK)购入的。引物等寡核苷酸是委托BIOSYNTHESIS(日本)合成的。Taq DNA 聚合酶是从Fermentas(Vilnius，Lithuania)购入的，Ex Taq是从Takara购入的。聚合酶链反应(PCR)使用2400型P CR扩增仪(Parkin-Elmer，Tokyo，Japan)。琼脂糖使用超纯琼脂糖(SawadayTechnology，Tokyo，Japan)。
克隆的载体使用pTARGETTM哺乳动物表达载体系统(Promega，Madison，WI)。精制使用QIAGEN质粒提取试剂盒或EndoFre e质粒提取试剂盒(都得自QIAGEN)。
LB培养基是将10g细菌培养用胰化蛋白胨(Bacto Tryptone)(Becton Dickinson，Sunnyvale，CA)和5g细菌培养用酵母提取物(Bacto Yeast Extract)(DIFCO LABORATORIES，Detroit，MI)、5g NaCl溶解在1L超纯水中，高压灭菌。冷却至60℃之后，加入1000mL 150mg/mL的氨苄青霉素(将氨苄青霉素钠(和光纯药)溶解在超纯水中使其成为150mg/mL之后，高压灭菌)。LB板是加入2g Bacto Tryptone、1g Bacto Yeast Extract、2g NaCl、5g细菌琼脂粉(Bacto Agar)(DIFCO)，溶解在200mL超纯水中经高压灭菌。冷却至60℃之后，加入200mL 150mg/mL的氨苄青霉素，分别向10mL盘(Falcon)中各注入10mL。异丙基-b-D-(-)-硫代半乳糖苷(IPTG)从和光纯药购入，配制成0.1M。将5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷(X-gal)(和光纯药)溶解在N-N-二甲基-甲酰胺(和光纯药)中使其成为20mg/mL。SOC如下制得向3g Bacto Tryptone、0.75g BactoYeast Extract，0.078g NaCl、0.027g KCl加水至总量成为148.5mL。将该溶液高压灭菌。向其中加入1.5mL另外高压灭菌的2MMg2+溶液(将12.324g的MgSO4·7H2O、10.165g的MgCl2·6H2O与超纯水混合至50mL)。向100mL该溶液中加入1mL的2M葡萄糖。
DNA测序仪使用ABI PRISM 310型遗传分析仪(AppliedBiosystems，Toyko，Japan)，此时，使用ABI PRISM BIGDyeTMTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits Version2.0(Applied Biosystems)。模板抑制剂(template suppressionreagent，TSR)从Applied Biosystems购入。
基因导入是使用FuGENETM6转染试剂(Roche DiagnisticsGmbh，Mannheim，Germany)进行的。
流式细胞仪分析用的抗人层粘连蛋白受体抗体从NEOMARKERS(Fremont，CA)购入。阴性对照抗体的小鼠IgM抗体使用购自Zymed Laboratories，Inc.，(San Francisco，CA)的抗体。异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊抗小鼠IgM抗体从Southern Biotechnology Associates，Inc(Birmingham，AL)购入。流式细胞仪使用FACSCalibur(Becton Dickinson)。
(4).RNA提取和cDNA合成将预先用1mM ATRA于37℃处理24小时的细胞用PB S洗净之后，对每1×107个细胞加入1mL Trizol，迅速悬浮使其完全溶解。室温下静置5分钟之后，添加0.2mL氯仿，剧烈倒置搅拌。室温下静置3分钟之后，于12000xg、4℃离心15分钟。在离心上清液中加入0.5mL的2-丙醇，剧烈倒置搅拌，室温下静置10分钟之后，于12000xg、4℃离心10分钟。除去该上清液，用1mL的75％乙醇冲洗沉淀。于12000xg、4℃离心5分钟之后，将上清液中的乙醇尽量除去，将沉淀的总RNA溶解在20mL的DEPC水中。cDNA合成如下所示。首先，向10mg的总RNA中加入1mL0.5mg/mL的(dT)20引物，在70℃下静置10分钟之后，直接用冰冷却进行退火。接下来，加入2mL 10mM dNTP(脱氧核苷三磷酸)、0.1mL RNase(核糖核酸酶)抑制剂，4mL添附到MMLV-逆转录酶中的5x缓冲液，用DEPC水使总量达到20mL。将该混合液于37℃静置1小时合成cDNA，于97℃静置5分钟使酶失活。
(5).67kDa层粘连蛋白受体(67LR)表达载体的构建用1mM ATRA将DND 39细胞于37℃处理24小时之后，进行RNA提取并合成cDNA。参考Full-length cDNA(Yow等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，856394-6398(1988))制造引物(H-LamininR-F；5′-ATGTCCGGAGCCCTTGATGTCC-3′、H-LamininR-R；5′-TTAAGACCAGTCAGTGGTTGCTC-3′)。将引物调节至20mM。将1mL合成的cDNA、0.1mL ExTaq、2mL 10 x Taq缓冲液、1.6mL 2.5mM dNTP、引物各0.5mL、14.3mL dH2O悬浮，进行PCR。条件是，初期变性在95℃下进行5分钟，变性反应在94℃下进行30秒钟，退火在58℃下进行30秒钟，延伸反应在72℃下进行30秒钟，变性反应、退火和延伸反应进行25次循环。用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳，目标染色体带用Wizard SV凝胶及PCR纯化系统(Wizard SV Gel and PCRClean-Up System，Promega)进行精制。进行该测序，确认是目标物。加入1mL的T4D NA连接酶10x缓冲液、1mL的pTARGETTM载体、1mL的T4D NA连接酶以及2.82mL的PCR产物、4.18mL的dH2O，在4℃下静置一夜，进行连接。随后进行与亚克隆相同的操作。由菌落PCR进行正反判断，用白金耳拾起菌落转移到LB培养基中，在37℃、150rpm下振动一晚进行培养。对其集菌，经EndoFree质粒提取试剂盒精制。进行该测序，确认是67LR。
(6).67LR瞬时表达体系的构建将构建的67LR表达载体(pTARGET-hLamininR)用FuG ENETM6转染剂导入A549细胞中。详述如下。将细胞调节为1×104个细胞/mL(10％FBS-ERDF培养基)播种加入。37℃下放置24小时使细胞粘附之后，在管中取新的ERDF培养基，直接加入FuGENETM6(3倍的基因量)，轻轻地混合。接下来加入pTARGET-hLamininR，轻轻地混合，室温下放置30分钟。将其加入到培养基中，在37℃下静置48小时。用培养基洗净之后，替换新鲜的培养基。
(7).各种成分对67LR强制表达细胞的影响对67LR瞬时表达细胞，添加各种浓度的各种成分，在含有5％FBS的ERDF培养基中于37℃处理48小时。处理之后，进行细胞数的计数以及用台盼蓝染色法进行存活率的测定。
而且，就EGCG前处理而言，将最终浓度为10μg/mL(含有1％FBS的ERDF培养基)的抗67LR抗体于37℃处理30分钟之后，进行EGCG处理，还研究对抗体处理细胞的影响。作为阴性对照，小鼠IgM中也进行同样的处理。
(8).各种成分对67LR强制表达细胞的结合性分析通过表面等离子共振传感器SPR670(Nippon Laser andElectronic Lab.，Nagoya，Japan)测定5μM各种成分与细胞的结合性。测定时首先用蛋白质等的标准固定化法将细胞固定在金膜(Nippon Laser and Electronic Lab.)上。将金膜浸在10mM的4，4-二硫代二丁酸(4，4-Dithiodibutyric acid，DDA)(东京化成工业，Tokyo，Japan)乙醇溶液(在10mL的99％乙醇中溶解2.38mg的DDA，再用乙醇稀释至1/100)(金面向上)，室温下轻轻地搅拌30分钟。接下来，不对金表面施加水压地用乙醇洗涤2次，导入自组装膜(SA膜)。分别将25mg水溶性碳化二亚胺；EDC(和光纯药)溶解在1mL超纯水中，将15mg N-羟基琥珀酰亚胺；NHS(和光纯药)溶解在9mL 1，4-二噁烷(Nacalai tesque，Inc.)中。将各自混合溶液，浸入SA膜处理之后的金膜，轻轻地于室温搅拌10分钟。向其中加入10mL的超纯水，再于室温搅拌5分钟。不对金表面施加水压地用超纯水洗涤2次，使之干燥(风干)，装到盒中。将细胞调节至3×105个细胞/mL(流动缓冲液PBS)，在金膜上滴下20μL并于室温下保持30分钟将细胞固定化。之后，注入用PBS稀释至1、10、25、50μM的绿茶儿茶素，通过测定表面等离子共振角度(Angle)的变化来监测对细胞的结合性。
另外，EGCG与抗67LR抗体的结合竞争性试验，是将最终浓度为10μg/mL(含有1％FBS的ERD F培养基)的抗67LR抗体于37℃处理30分钟之后，将细胞在金膜上固定化，用表面等离子共振传感器与上述相同地进行的。此时，作为阴性对照，用小鼠IgM也进行同样的处理来测定。
(9).流式细胞仪分析已知67LR在细胞表面上表达，因此通过使用抗人层粘连蛋白受体(LR)抗体的流式细胞仪分析检测除在细胞表面上表达的67LR。将细胞回收，在1.5mL Eppendorf管中调节成总量100μL的1％FBS-PBS中含有1×106个细胞，作为1次抗体添加抗人LR抗体至最终浓度成为10μg/mL。在4℃下培育30分钟之后，用PBS洗涤1次。接下来，作为2次抗体添加可识别LR抗体的同种型的抗小鼠IgM FITC标记抗体并使其在总量25μL的1％FBS-PBS中最终浓度成为12.5μg/mL。在4℃下培育30分钟之后，用PBS洗涤2次，然后，再悬浮于PB S中用流式细胞仪进行分析。将阴性对照IgM抗体以相同浓度(10μg/mL)进行反应。细胞表面67LR表达量以LR的荧光强度的中央值表示。
另外，为了研究EGCG处理对67LR细胞表面表达的影响，在1次抗体作用之前，用调节至最终浓度为50μM的添加EGCG的1％FBS-PBS对细胞进行处理，在37℃下静置30分钟。用PBS洗涤1次。下面从1次抗体开始进行上述作用，进行测定。并且，也用不含EGCG的1％FBS-PBS进行处理，作为对照组。
(10).统计计算用学生氏t-检验(student′st-test)对试验结果进行统计处理。
实施例1导入67LR基因对EGCG的细胞结合性和增殖活性的影响使用FuGENETM6转染剂通过以下方法将67LR表达载体(pTARGET-hLamininR)导入A549细胞中。将细胞调节为1×104个细胞/mL(10％FBS-ERDF培养基)播种。24小时之后，在管中取新的ERDF培养基，直接加入FuG ENETM6(3倍的基因量)，轻轻地混合。接下来以不同浓度加入pTARGET-hLamininR并轻轻地混合，室温下放置30分钟。将其加入到培养基中，在37℃下继续培养48小时。对该67LR瞬时表达细胞，添加不同浓度的EGCG，在含有5％FBS的ERD F培养基中于37℃处理48小时。处理之后，进行细胞数的计数以及由台盼蓝染色法进行存活率的测定。
结果，观察到在瞬时表达67LR的细胞中依赖EGCG浓度地抑制细胞增殖。而且，也观察到与导入到细胞的67LR基因量成比例地抑制细胞增殖。
67LR是存在于细胞膜中的膜蛋白质，在导入该基因的表达载体的细胞中EGCG的效果增强，可能是由于EGCG的结合性增大的缘故。因此，通过表面等离子共振传感器测定EGCG对该细胞的的结合性。EGCG以5μM使用。
首先，在导入空载体的A549细胞中，仅观察到若干角度的变化(结合量)，于此相对地，在导入67LR表达载体的细胞中，导入0.25μg的细胞中就已观察到角度显著增大，进一步导入0.5μg的细胞中观察到更进一步的增大。由此显示，67LR表达载体的导入提高了EGCG向细胞表面的结合性。
图1、图2和图3显示实施例1的结果。
实施例267LR的细胞表面表达量的测定已指出通过导入67LR表达载体，EGCG对细胞表面的结合性增大。于是，用流式细胞仪验证该结合性的增大是不是由于实际上在细胞膜上的67LR表达增大。
首先，进行细胞表面的67LR的表达量的测定。在对照品A549细胞中观察到若干表达。在向该细胞中导入了空载体(0.5μg)的细胞中几乎未观察到对表达量的影响。然而，在导入了67LR表达载体(0.5μg)的细胞中表达量大幅增加，由此可知在细胞表面上67LR表达。
进一步，为了弄清EGCG是否通过该67LR结合，在抗67LR抗体作用之前使EGCG作用。其结果，在对照细胞中观察到的67LR的表达在表观上消失。而且，在导入空载体的细胞中同样也存在该现象。而且，导入67LR的细胞中同样也存在。这可以认为是由于使EGCG预先作用于细胞，细胞表面的67LR上已经先结合了EGCG，导致抗67LR抗体不能结合到细胞膜上的67LR上，因此表观上不能检测出67LR的表达。
由这些结果可知，通过导入67LR表达载体，细胞表面的67LR表达增大，显示出EGCG的结合性的增大是67LR的细胞膜表达增大。而且启示出EGCG通过该67LR结合到细胞上。即，显示67LR是EGCG的受体。
图4显示实施例2的结果。
实施例3抗67LR抗体对EGCG的结合性和增殖抑制活性的影响到目前为止已指出，EGCG通过67LR结合到细胞上，表现出增殖抑制活性。为进一步阐明该点，这次，在对67LR强制表达细胞用抗67LR抗体预先进行处理的基础上，研究能否观察到对EGCG的结合性和增殖抑制活性的影响。
首先，通过表面等离子共振传感器研究抗体对结合性的影响。当使抗67LR抗体作用，则由角度变化量观察到EGCG的结合速度和结合量本身的减少。在阴性对照抗体中没有发现这样的效果。
并且，还研究了抗体对EGCG的癌细胞增殖抑制的影响。在67LR强制表达细胞中即使仅0.1μM浓度的EGCG也观察到增殖抑制活性，然而在作用EGCG之前进行抗体处理，其增殖抑制效果就消失了。此时，没有观察到对存活率的影响。由该结果显示，不仅是EGCG的结合，增殖抑制活性也是通过EGCG对67LR的结合来进行的。
图5和图6显示实施例3的结果。
实施例467LR表达对其它茶成分的结合性和增殖抑制活性的影响已指出，EGCG是通过67LR结合到细胞膜上的，而且，表现出癌细胞增殖抑制活性。研究了该通过67LR的效果是否是EGCG特有的效果。于是，作为其它茶成分，使用了主要的绿茶儿茶素ECG、EGC、EC、C和被报道具有强抗变态反应作用并且在活体内稳定地存在的EGCG3″Me。还对与儿茶素同样具有各种生理机能的咖啡因，以及报道同样具有很多生理机能的黄烷醇类的一种槲皮黄素进行研究。
首先，研究对67LR强制表达细胞的增殖的影响。与上述相同地，用脂质转染法将0.5μg的pTARGET-hLamininR导入A549细胞中，在37℃下培养48小时之后，对培养后的细胞作用各种茶成分并使茶成分的最终浓度成为5μM。在该状态下，再于37℃培养48小时后进行细胞数和存活率的测定。其结果，C、EC、EGC、咖啡因和槲皮黄素中，不论基因的导入与否，都没有观察到对存活率和细胞数的影响。另一方面，与EGCG同样带有没食子酰基的ECG和EGCG3″Me中，观察到与EGCG相同的增殖抑制效果。该结果启示，带有没食子酰基的成分在67LR强制表达细胞中表现出增殖抑制活性。
并且，用表面等离子共振传感器测定各种茶成分对67LR强制表达细胞的结合性。对A549细胞，C、EC、EGC未显示结合性，在67LR强制表达细胞中也未观察到变化。另外，咖啡因和槲皮黄素也未显示细胞结合性，强制表达细胞中也未观察到变化。ECG和EGCG″3Me全都显示出细胞结合性，尽管都没有EGCG那样的程度，并明确了在67LR强制表达细胞中该结合性增大。
图7和图8显示实施例4的结果。
工业实用性根据本发明，可以提供一种以67kDa层粘连蛋白受体作为靶的药物的新的筛选方法。
另外，本申请是要求日本专利申请2003-097652号的优先权而申请的。
权利要求
1.一种筛选药物的方法，所述药物具有细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特-雅各布病感染抑制作用，该方法包括如下步骤定性或定量测定试验化合物与67kDa层粘连蛋白受体的结合程度，由该测定结果，当试验化合物结合到67kDa层粘连蛋白受体上时，判定该试验化合物是具有细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特-雅各布病感染抑制作用的药物。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，所述药物是具有细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用和/或癌细胞转移活性抑制作用的药物。
3.一种药物，其通过权利要求1或2所述的筛选方法获得。
4.根据权利要求1～3的任一项所述的药物，其有效成分是带有没食子酰基的化合物。
5.根据权利要求4所述的药物，所述化合物是儿茶素类。
6.根据权利要求5所述的药物，所述儿茶素类是表没食子儿茶素没食子酸酯。
7.根据权利要求3～6的任一项所述的药物，其用于通过细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特-雅各布病感染抑制作用能够预防和/或治疗的疾病。
8.根据权利要求3～6的任一项所述的药物，其用于通过细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用和/或癌细胞转移活性抑制作用能够预防和/或治疗的疾病。
9.根据权利要求8所述的药物，所述疾病是癌。
10.一种药物组合物的制造方法，包括由化学合成方法制备权利要求3～9的任一项所述的药物的工序，和混合药学上可接受的载体的工序。
11.一种药物组合物，其通过权利要求10所述的制造方法获得。
12.一种筛选药物的方法，包括如下步骤定性或定量测定带有没食子酰基的化合物和试验化合物与67kDa层粘连蛋白受体的结合程度，由该测定结果，当试验化合物与67kDa层粘连蛋白受体的结合程度超过带有没食子酰基的化合物与67kDa层粘连蛋白受体的结合程度时，判定该试验化合物是具有与带有没食子酰基的化合物所具有的药理学作用相同作用的药物。
13.一种筛选药物的方法，包括如下步骤使带有没食子酰基的化合物对67kDa层粘连蛋白受体的结合与试验化合物对67kDa层粘连蛋白受体的结合竞争的结果，当试验化合物结合到67kDa层粘连蛋白受体的位点与带有没食子酰基的化合物结合到67kDa层粘连蛋白受体的位点相同时，判定该试验化合物是具有与带有没食子酰基的化合物所具有的药理学作用相同作用的药物。
14.根据权利要求12或13所述的筛选方法，所述带有没食子酰基的化合物所具有的药理学作用是细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特-雅各布病感染抑制作用。
15.根据权利要求12或13所述的筛选方法，所述带有没食子酰基的化合物所具有的药理学作用是细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用和/或癌细胞转移活性抑制作用。
16.根据权利要求12～15的任一项所述的筛选方法，所述化合物是儿茶素类。
17.根据权利要求12～15的任一项所述的筛选方法，所述儿茶素类是表没食子儿茶素没食子酸酯。
18.一种药物，其通过权利要求12～17的任一项所述的筛选方法获得。
19.根据权利要求18所述的药物，其用于通过细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特-雅各布病感染抑制作用能够预防和/或治疗的疾病。
20.根据权利要求18或19所述的药物，其用于通过细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用和癌细胞转移活性抑制作用能够预防和/或治疗的疾病。
21.根据权利要求20所述的药物，所述疾病是癌。
22.一种药物组合物的制造方法，包括由化学合成方法制备权利要求18～21的任一项所述的药物的工序，和混合药学上可接受的载体的工序。
23.一种药物组合物，其通过权利要求22所述的制造方法获得。
24.一种化合物，是与67kDa层粘连蛋白受体结合的化合物，在与带有没食子酰基的化合物结合到该67kDa层粘连蛋白受体的位点相同的位点结合。
25.根据权利要求24所述的化合物，所述化合物是儿茶素类。
26.根据权利要求25所述的化合物，所述儿茶素类是表没食子儿茶素没食子酸酯。
27.一种细胞增殖抑制剂，其包含权利要求24～26的任一项所述的化合物。
28.一种血管新生抑制剂，其包含权利要求24～26的任一项所述的化合物。
29.一种癌细胞转移活性抑制剂，其包含权利要求24～26的任一项所述的化合物。
30.一种抗癌剂，其包含权利要求24～26的任一项所述的化合物。
全文摘要
提供一种使用67kDa层粘连蛋白受体筛选药物的新方法和由此获得的药物。一种具有细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特－雅各布病感染抑制作用的药物的筛选方法，包括如下步骤定性或定量测定试验化合物与67kDa层粘连蛋白受体的结合程度，由该测定结果，当试验化合物结合到67kDa层粘连蛋白受体上时，判定该试验化合物是具有细胞增殖抑制作用、血管新生抑制作用、癌细胞转移活性抑制作用、神经保护作用、抗变态反应作用、抗动脉硬化作用和/或克罗伊茨费尔特－雅各布病感染抑制作用的药物，以及由此获得的药物。
文档编号A61P25/28GK1798975SQ20048001517
公开日2006年7月5日 申请日期2004年4月1日 优先权日2003年4月1日
发明者立花宏文 申请人:株式会社产学连携机构九州