化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)半胱氨酸蛋白酶的重组表达及其免疫原性复合物的制作方法

专利名称：：化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)半胱氨酸蛋白酶的重组表达及其免疫原性复合物的制作方法
技术领域：
：本发明大体上是关于分子生物学、临床细菌学及蛋白质折叠的领域。更明确地说，本发明是关于一种在宿主细胞中重组表达可溶的成熟化脓性链球菌外毒素B(SpeB)多肽的方法。
背景技术：
：化脓性链球菌，也称A族链球菌(GAS)，是一种普通的革兰氏阳性的人类细菌病原。化脓性链球菌在人类中引起包括咽炎、脓疱病和败血症的多种病症。感染所并发的诸如风湿热及急性肾小球肾炎的自体免疫并发症也在人类中发生。化脓性链球菌也引起诸如猩红热、坏死性肌膜炎和中毒性休克的严重急性疾病。由A族链球菌引起的喉咙疼痛，通常称为“脓毒性咽喉炎”，视季节而定，至少占一普通诊所中所有医疗门诊的16％(Hope-Simpson，1981)。A族链球菌也是在北美及其它四个洲新近再次发生与坏死性肌膜炎有关的中毒性休克的原因(Stevens，1992)。当前由抗生素治疗来处理链球菌感染。然而，经治疗者中25-30％具有复发性疾病及/或于粘膜分泌物中流出这种生物体。中毒性休克及严重的侵袭性疾病的抗生素治疗经常不是很有效，且死亡率可超过50％(Davies等人，1996)。青霉素未能成功地治疗严重的侵袭性链球菌感染归因于以下现象大量接种菌很快到达稳定生长期，而青霉素对于抵抗生长缓慢的细菌不是非常有效(Stevens等人，1993)。因此，仍然持续需要对防止或改善链球菌感染有效的方法。更明确地说，需要鉴定和研制可用于防止链球菌感染的免疫原性复合物中的抗原(或免疫原)。当前这样一种被认为是免疫原的多肽抗原为化脓性链球菌外毒素B(SpeB)，也称作链球菌半胱氨酸蛋白酶、链球菌蛋白酶或史脱普平(streptopain)。化脓性链球菌外毒素B(SpeB)表达为40kDa无活性的前酶原(即酶原)(Chaussee等人，1993；Liu与Elliot.，1965)，其具有一个27个氨基酸的NH2-端信号序列，接着为一个118个氨基酸的前肽(pro-peptide)序列(28-145氨基酸)及一个253个氨基酸的成熟序列(146-398氨基酸)。刚一分泌，该40kDaSpeB酶原就经历自催化作用，导致12kDaNH2-端前肽的移除与成熟的28kDa的活性SpeB酶的形成。这种转换为活性酶的机制防止了不需要的蛋白降解且能够实现蛋白质水解活性的时空调节(Khan与James，1998)。作为酶中半胱氨酸肽链内切酶族的一个成员，SpeB在活性位点含有一Cys-His对(Liu等人，1965；Liu，1965；Tai等人，1976)。将192位的单个半胱氨酸残基替换为丝氨酸(在下文中，“C192S”)导致了SpeB酶不能检测到蛋白质水解活性，防止40kDaSpeB酶原加工为28kDa成熟SpeB形式(Gubba等人，1998；Matsuka等人，1999；Musser等人，1996)。先前研究的结果已显示需要C192SSpeB突变体的成熟形式来产生对野生型SpeB酶具有最大抑制活性的抗体(Matsuka等人，1999)。这建议了产生用于免疫目的的C192SSpeB突变体的NH2-端被截短的、28kDa的成熟形式的需要。然而，成熟C192SSpeB(即缺乏其NH2-端前序列)的重组表达导致在大肠杆菌(E.coli)中不可溶蛋白的积累。产生可溶成熟C192SSpeB突变体的一个途径为通过对40kDaSpeB酶原的有限蛋白质水解。例如，使用包括胰肽酶E、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(Matsuka等人，1999)及木瓜蛋白酶的几种蛋白酶已经实现对40kDaSpeB突变体酶原的有限蛋白质水解以产生成熟C192SSpeB突变体。这些资料与由Liu及Elliot(1965)所发表的利用胰蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的资料建议由多种蛋白酶处理40kDaC192SSpeB突变体酶原成功地产生了所要的28kDa成熟C192SSpeB突变体。然而，对于大规模生产，这种途径有几个局限性。首先，由于需要两个连续的纯化步骤，一个用于全长酶原的纯化步骤和第二个用于经加工的成熟蛋白酶的纯化步骤，所以成熟蛋白酶的终产物产量低。第二，存在与有限蛋白质水解反应的一致性及重复性有关的困难，特别是在大规模生产上。最后，存在用于裂解的具有酶活性的外源蛋白酶污染终产物的固有风险。甚至当以树脂固定化蛋白酶进行这个反应时，也极难避免这种污染。因此，在本
技术领域：
中仍然存在对能够有效抵抗链球菌在哺乳动物宿主中感染的免疫原性复合物的需要。因此，极其需要确定用于产生或表达成熟SpeB多肽的方法，其中当投药于哺乳动物宿主时成熟SpeB具有免疫原性。也需要用于产生或表达成熟SpeB多肽的免疫原形式的这些方法避免前述的大规模生产上的局限性，诸如SpeB产量减少、有限蛋白质水解一致性/重复性和外源酶污染的风险。
发明内容本发明大致是关于在宿主细胞中重组表达成熟化脓性链球菌外毒素B(SpeB)多肽的方法及其免疫原性复合物。更明确地说，本发是针对在宿主细胞中共表达12kDaSpeB前肽和28kDa成熟SpeB多肽的新颖方法，其中成熟SpeB多肽在该宿主细胞中可溶。因此，在一些实施例中，本发明是针对在宿主细胞中重组表达成熟化脓性链球菌外毒素B(SpeB)多肽的方法，该方法包含(i)以多顺反子质粒转化、转导、转染或感染宿主细胞，该多顺反子质粒包含(a)编码SpeB多肽原结构域的多聚核苷酸序列和(b)编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列，以及(ii)在允许宿主细胞表达成熟SpeB多肽和SpeB多肽原结构域的条件下培养宿主细胞，且其中成熟SpeB多肽在宿主细胞中可溶。因此，在本发明的多顺反子质粒系统中，单个启动子(例如T7启动子)驱动多顺反子mRNA转录本的表达，其中该多顺反子mRNA在其正确阅读框中编码两个或两个以上多肽(例如，SpeB多肽原结构域和成熟SpeB多肽)。在一些实施例中，进一步将SpeB多肽原结构域定义为包含第2号序列(SEQIDNO2)的28至145位氨基酸残基的多肽，且进一步将成熟SpeB多肽结构域定义为包含第2号序列的146至398位的氨基酸残基的多肽。在一优选实施例中，由丝氨酸取代成熟SpeB多肽的在氨基酸残基192位的半胱氨酸。在另一实施例中，成熟SpeB多肽在哺乳动物宿主中有免疫原性。在又一实施例中，成熟SpeB多肽的特异性抗体与野生型SpeB多肽交叉反应且抵消SpeB多肽活性。在一些优选实施例中，质粒为含有T7启动子的质粒。在一个特定实施例中，该含有T7启动子的质粒选自由pET、pRSET、pCRT7-CTTOPO及pIVeX组成的群。在另一优选实施例中，宿主细胞为细菌细胞。在某些实施例中，细菌宿主细胞为E.coli。在其它实施例中，E.coli为选自下列各物组成之群的菌株BLR(DE3)、BLR(DE3)pLysS、AD494(DE3)、AD494(DE3)pLysS、BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS、BL21(DE3)pLysE、BL21(DE3)pLacl、BL21trxB(DE3)、BL21trxB(DE3)pLysS、HMS174(DE3)、HMS174(DE3)pLysS、HMS174(DE3)plysE、Origami(DE3)、Origami(DE3)pLysS、Origami(DE3)pLysE、Origami(DE3)pLacl、OrigamiB(DE3)、OrigamiB(DE3)plysS、OrigamiB(DE3)pLysE、OrigamiB(DE3)pLacl、Rosetta(DE3)、Rosetta(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)pLysE、Rosetta(DE3)pLacl、Tuner(DE3)、Tuner(DE3)pLysS和Tuner(DE3)pLacl。在其它实施例中，本发明是针对在宿主细胞中重组表达成熟SpeB多肽的方法，该方法包含(a)以(i)包含编码SpeB多肽原结构域的多聚核苷酸序列的质粒和(ii)包含编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列的质粒转化、转导、转染或感染宿主细胞，以及(b)在适合于共表达SpeB多肽原结构域和成熟SpeB多肽的条件下培养宿主细胞，且其中成熟SpeB多肽在该宿主细胞中可溶。在某些实施例中，进一步将SpeB多肽原结构域定义为包含第2号序列的28至145位氨基酸残基的多肽，且进一步将成熟SpeB多肽结构域定义为包含第2号序列的146至398位的氨基酸残基的多肽。在一个优选实施例中，由丝氨酸取代成熟SpeB多肽的在氨基酸残基192位的半胱氨酸。在其它实施例中，成熟SpeB多肽在哺乳动物宿主中有免疫原性。在又一实施例中，成熟SpeB多肽的特异性抗体与野生型SpeB多肽交叉反应且抵消SpeB多肽活性。在另一优选实施例中，质粒为含有T7启动子的质粒。在一个特定实施例中，该含有T7启动子的质粒选自由pET、pRSET、pCRT7-CTTOPO和pIVeX组成之群。在其它实施例中，宿主细胞为细菌细胞。在一个优选实施例中，细菌宿主细胞为E.coli，其中E.coli为选自下列各物组成之群的菌株BLR(DE3)、BLR(DE3)pLysS、AD494(DE3)、AD494(DE3)pLysS、BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS、BL21(DE3)pLysE、BL21(DE3)pLacl、BL21trxB(DE3)、BL21trxB(DE3)pLysS、HMS174(DE3)、HMS174(DE3)pLysS、HMS174(DE3)plysE、Origami(DE3)、Origami(DE3)pLysS、Origami(DE3)pLysE、Origami(DE3)pLacl、OrigamiB(DE3)、OrigamiB(DE3)plysS、OrigamiB(DE3)pLysE、OrigamiB(DE3)pLacl、Rosetta(DE3)、Rosetta(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)pLysE、Rosetta(DE3)pLacl、Tuner(DE3)、Tuner(DE3)pLysS和Tuner(DE3)pLacl。在另一实施例中，本发明是针对一种产生成熟SpeB多肽的方法，该方法包含以下步骤(a)在宿主细胞中重组表达包含编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列的质粒，其中SpeB多肽在宿主细胞中形成不可溶的多肽聚集体；(b)溶解多肽聚集体，其中将经溶解的多肽定义为非天然(non-native)成熟SpeB多肽；(c)在分子伴侣蛋白的存在下再折叠该非天然成熟SpeB多肽，其中将该非天然成熟SpeB多肽折叠为天然(native)成熟SpeB多肽；以及(d)回收该天然成熟SpeB多肽。在一优选实施例中，分子伴侣蛋白选自由GroEL、GroEL/GroES、PDI、PPI和SpeB多肽原结构域组成之群。在一特定实施例中，分子伴侣蛋白为包含第2号序列的28至145位的氨基酸残基的SpeB多肽原结构域。在一优选实施例中，成熟SpeB为包含第2号序列的146至398位的氨基酸残基的多肽。在又一优选实施例中，由丝氨酸取代成熟SpeB多肽的氨基酸残基192位的半胱氨酸。在又一实施例中，进一步将该不可溶多肽聚集体定义为包涵体。在其它实施例中，溶解多肽的为诸如尿素、盐酸胍、十二烷基硫酸钠(SDS)的非天然剂，加热及其类似方式。在其它实施例中，本发明是针对一种在宿主细胞中重组表达成熟SpeB多肽的方法，该方法包含在宿主细胞中表达包含以下两者的多顺反子质粒(i)编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列和(ii)编码GroEL多肽的多聚核苷酸序列的，其中成熟SpeB多肽在该宿主细胞中可溶。在一优选实施例中，由丝氨酸取代成熟SpeB多肽的氨基酸残基192位的半胱氨酸。在一特定实施例中，质粒进一步包含编码GroES多肽的多聚核苷酸。在其它实施例中，本发明是一种针对产生成熟SpeB多肽的方法，这个方法包含以下步骤(a)以包含下列两者的多顺反子质粒转化、转导、转染或感染宿主细胞(i)编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列和(ii)编码GroEL多肽的多聚核苷酸序列；(b)在适合于表达成熟SpeB多肽和GroEL多肽的条件下培养宿主细胞，其中成熟SpeB多肽在该宿主细胞中是可溶的；以及(c)回收天然成熟SpeB多肽。在一优选实施例中，由丝氨酸取代成熟SpeB多肽的氨基酸残基192位处的半胱氨酸。在一些其它实施例中，本发明是针对根据本发明中所阐明的一种或多种方法所产生的成熟SpeB多肽。在其它实施例中，本发明是针对包含根据本发明的其中的一个方法所产生的SpeB多肽的免疫原性复合物。在其它实施例中，本发明是针对一种对哺乳动物个体进行免疫以使其抗化脓性链球菌的方法，该方法包含对个体投药免疫原量的免疫原性复合物，其中免疫原性复合物包含根据本发明的方法产生的成熟SpeB多肽。在其它实施例中，本发明是针对包含以下两者的多顺反子质粒(a)编码SpeB多肽原结构域的多聚核苷酸序列和(b)编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列，其中当在宿主细胞中表达时成熟SpeB多肽是可溶的。在某些实施例中，由丝氨酸取代成熟SpeB多肽的氨基酸残基192位的半胱氨酸。在一些其它实施例中，质粒为含有T7启动子的质粒。在一些其它实施例中，本发明是针对(a)包含编码SpeB多肽原结构域的多聚核苷酸序列的质粒和(b)包含编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列的质粒，其中当在宿主细胞中表达时成熟SpeB多肽可溶。在优选实施例中，由丝氨酸取代成熟SpeB多肽的氨基酸残基192位的半胱氨酸。在一些其它实施例中，质粒为含有T7启动子的质粒。在另一实施例中，本发明是针对包含(a)编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列和(b)编码GroEL多肽的多聚核苷酸序列的多顺反子质粒，其中当在宿主细胞中表达时成熟SpeB多肽是可溶的。在优选实施例中，由丝氨酸取代成熟SpeB多肽的氨基酸残基192位的半胱氨酸。在一些其它实施例中，质粒为含有T7启动子的质粒。在又一实施例中，本发明是针对包含(a)编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列、(b)编码GroEL多肽的多聚核苷酸序列和(c)编码GroES多肽的多聚核苷酸序列的多顺反子质粒，其中当在宿主细胞中表达时成熟SpeB多肽是可溶的。在优选实施例中，由丝氨酸取代成熟SpeB多肽的氨基酸残基192位的半胱氨酸。在其它实施例中，质粒为含有T7启动子的质粒。在又一些实施例中，本发明是针对包含(a)编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列和(b)编码一个或一个以上选自由GroEL、GroES、PDI及PPI多肽组成之群的多肽的多聚核苷酸序列的多顺反子质粒，其中当在宿主细胞中表达时成熟SpeB多肽是可溶的。在一优选实施例中，由丝氨酸取代成熟SpeB多肽的氨基酸残基192位的半胱氨酸。在一些其它实施例中，质粒为含有T7启动子的质粒。在另一实施例中，本发明提供由本发明的质粒所转化、转导、转染或感染的宿主细胞。自下列详细的描述、本发明的优选实施例和权利要求，本发明的其他特征和优点将显而易见。图1A和1B证明重组成熟SpeB与前序列结构域的相互作用。图1A描绘了浓度渐增的培育在含有前序列结构域(实心记号)或溶菌酶(空心记号)的酶标板中的由胃蛋白酶产生的成熟C192SSpeB(实心圆)，以及成熟野生型SpeB(实心正方形)，且由在实例1中描述的ELISA法进行分析。这些数据代表三个实验，其中每个实验都重复两次。图1B描绘了前序列结构域与成熟SpeB多肽之间相互作用的实时分析，这个实验是通过使用在实例1中描述的Biocore3000来进行的。表达结果为表面等离子共振(相对响应值)。图2A和2B展示由前序列结构域介导的成熟SpeB的抑制。图2中所描绘的为使用SpeB前序列结构域(实心正方形)或溶菌酶(空心三角形)对成熟野生型SpeB抑制作用，其中使用试卤灵标记的酪蛋白(图2A)或半胱氨酸木瓜蛋白酶(图2B)作为底物，如在实例1中所描述的那样进行分析。图3展示重组前序列结构域对于非天然成熟SpeB的再折叠的作用。将非天然成熟SpeB迅速稀释于PBS，0.5M精氨酸(实心圆)；PBS，0.5M精氨酸，20μM蛋白酶抑制剂E-64(空心圆)；PBS(实心正方形)和PBS，20μM含有浓度渐增的前序列结构域的E-64(空心正方形)。如在实例1中描述的进行反应且使用经试卤灵标记的酪蛋白裂解分析法评价蛋白酶活性的存在。图4是基于双质粒的表达构建体的图示。基于双质粒的表达载体的特征包括如所示的KanR-卡那霉素抗性基因(aph(3′)-la)、AmpR-氨苄青霉素抗性基因(β-内酰胺酶)、Ori-复制起点、laclq-lac受体、基于T7的启动子(T7或T7lac)和T7终止子。图5A和5B展示多顺反子表达系统和合成接头区域的示意图。多顺反子表达载体(图5A)的特征包括如所指示的KanR-卡那霉素抗性基因(aph(3′)-la)、Ori-复制起点、laclq-lac受体、T7lac启动子和T7终止子。展示所分析的接头区域的碱基组成(图5B)。各个接头区域的核苷酸命名(5nt、10nt、20nt、40nt)表明在所设计的前序列结构域的TAA翻译终止密码子(PSD终止)(粗体文字)与最优化Shine-Dalgarno核糖体结合位点(SD)之间的碱基数。以粗斜体展示第二顺反子的翻译ATG起始密码子。图6A和6B展示在多顺反子表达系统中可溶成熟SpeB和前序列结构域水平的评价和相对定量。对含有5nt、10nt、20nt和40nt接头的C192SSpeB多顺反子系统进行SDS-PAGE评价，该系统用于表达前序列结构域和可溶部分中的成熟SpeB(图6A)。使用MolecularDynamicsPersonalDensitometer完成所表达的蛋白的定量，且将经扫描面积的量度指定为表达水平(图6B)。图7展示多顺反子cDNA的定量PCR分析。如在实例1中所描述的制备并分析cDNA和-RT对照。以KanRmRNA表达对所有Ct值进行标准化。图8证明成熟C192SSpeB的热诱导变性。如在实例1中所描述的，对由所表达的C192SSpeB酶原的胃蛋白酶裂解产生的、或者由双质粒和多顺反子共表达系统所产生的纯化成熟C192SSpeB的变性曲线进行分析。图9证明成熟野生型SpeB的热诱导变性。如在实例1中所描述的，对由自催化加工产生的(即由酶原所产生的)、或者由双质粒和多顺反子共表达系统所产生的纯化成熟野生型SpeB的变性曲线进行分析。图10展示了对于重组成熟SpeB的操作摩尔浓度的评价。如在实例1中所描述的，使用经试卤灵标记的酪蛋白裂解分析法来评价等量的(0.12μM)由自催化(实心正方形)以及由双质粒(实心圆)和多顺反子(实心三角形)共表达所产生的纯化成熟野生型SpeB。在25℃下培育1小时以进行裂解反应。评价由多顺反子表达产生的纯化成熟C192SSpeB(空心菱形)作为对照。图11证明由抗体介导的野生型SpeB蛋白质水解活性的抑制。使用试卤灵标记的酪蛋白裂解分析法评价由双质粒(实心菱形)或者多顺反子系统(空心正方形)产生的抗成熟C192SSpeB所产生的含量渐增的抗血清特异性地抑制成熟野生型SpeB蛋白质水解活性的能力。裂解反应使用37℃下2小时的培育时间。免疫前血清用作分析用的阴性对照(三星形)。具体实施例方式下文中所描述的本发明致力于解决在本
技术领域：
中对于产生用于免疫原性复合物中的化脓性链球菌外毒素B(下文中，“SpeB”)的方法的需要。在一些优选实施例中，本发明是针对产生用于免疫原性复合物中的成熟SpeB的方法。更明确地说，下文中所描述的本发明致力于解决在本
技术领域：
中对于在宿主细胞中重组表达成熟SpeB多肽的方法的需要，其中所表达的成熟SpeB多肽在宿主细胞中可溶。在一优选实施例中，当投药于哺乳动物宿主时，根据本发明方法所产生的成熟SpeB多肽有免疫原性。如在下文中所定义的，在化脓性链球菌中表达的“SpeB酶原”为包含第2号序列的第1-398位氨基酸的40kDa前多肽原(pre-pro-peptide)。SpeB酶原被表达为无酶活性(即酶原)、40kDa的前多肽原，其具有一个27个氨基酸的NH2-端信号(“前”(“pre”))序列，接着为一个118个氨基酸的多肽原(“原”(“pro”))序列及一个253个氨基酸的成熟多肽序列。因此，如在下文中所定义的，SpeB酶原的“前”(“pre”)序列包含第2号序列的第1-27位氨基酸。类似地，如在下文中所定义的，交替地使用SpeB酶原的“前序列”、“前序列结构域”、“多肽原序列”和“多肽原结构域”，其中前序列包含第2号序列的第28-145位氨基酸。刚一由天然细菌(即化脓性链球菌)分泌，40kDaSpeB酶原就经历自催化作用，导致12kDaNH2-端多肽原序列(即第2号序列的第28-145位氨基酸)的移除与成熟的28kDa具有蛋白质水解活性的SpeB多肽(或酶)的形成。如在下文中所定义的，“成熟SpeB”多肽为包含第2号序列的第146-398位氨基酸的28kDa多肽，其中成熟SpeB多肽具有半胱氨酸蛋白酶活性。如在下文中所定义的，交替地使用“成熟SpeB”多肽和“成熟野生型SpeB”多肽，这两个均指包含第2号序列的第146-398位氨基酸的野生型28kDa多肽，其中该多肽具有半胱氨酸蛋白酶活性。在第2号序列的192位和340位氨基酸残基处SpeB活性位点含有一Cys-His对。将192位的单个半胱氨酸残基经氨基酸取代(即突变)为丝氨酸(在下文中，“C192S”或“C192S突变体”)导致不能检测到成熟C192SSpeB多肽的蛋白质水解活性。因此，如在下文中所定义的，“C192SSpeB酶原”或“C192SSpeB突变体”包含第2号序列的第28-398位氨基酸，其中将192位的半胱氨酸残基突变为丝氨酸残基。如在下文中所定义的，“成熟C192SSpeB”多肽为包含第2号序列的第146-398位氨基酸的28kDa多肽，其中192位的半胱氨酸残基已经突变为丝氨酸残基，其中成熟C192SSpeB多肽没有相对于成熟野生型SpeB多肽的半胱氨酸蛋白酶活性。因此，在某些实施例中本发明针对于包含成熟SpeB多肽，且更优选地为成熟C192SSpeB多肽的免疫原性复合物。举例而言，以前对于C192SSpeB突变体的免疫学研究证明产生对成熟野生型SpeB多肽有最大抑制活性(即交叉反应性)的抗体需要成熟C192SSpeB多肽(即失去NH2-端的前(pro)多肽序列)(Matsuka等人，1999)。因此，本文预期对于免疫哺乳动物抵抗化脓性链球菌感染的有效免疫原性复合物至少包含成熟C192SSpeB或成熟野生型SpeB多肽抗原。然而，在本
技术领域：
中已知在E.coli宿主细胞中重组表达成熟SpeB多肽只会导致在E.coli中产生不可溶的多肽聚集体(Matsuka等人，1999)。因此，在特定实施例中，本发明针对于克服在宿主细胞中表达既“成熟”又“可溶”的SpeB多肽的困难的方法。举例而言，在本发明的一个实施例中证明在宿主细胞中共表达编码成熟C192SSpeB多肽(或成熟野生型SpeB)的质粒与编码多肽原结构域(即第2号序列的第28-145位氨基酸)的质粒，导致在宿主细胞中成功表达可溶、成熟C192SSpeB多肽(或成熟野生型SpeB)(例如，参看实例3)。类似地，在宿主细胞中重组共表达多顺反子质粒，其中多顺反子质粒编码成熟C192SSpeB多肽(或成熟野生型SpeB)和多肽原序列(第2号序列的第28-145位氨基酸)，也会导致在宿主细胞中表达可溶、成熟C192SSpeB多肽(或成熟野生型SpeB)(例如，参看实例4)。因此，如在下文所阐明的本发明提供在宿主细胞中表达可溶成熟C192SSpeB多肽(或成熟野生型SpeB)的新颖方法与其新颖复合物，其中可溶成熟C192SSpeB多肽在用于免疫哺乳动物抵抗化脓性链球菌感染的免疫原性复合物中特别有用。因此，在一些优选实施例中，本发明针对于在宿主细胞中共表达编码成熟C192SSpeB多肽(或成熟野生型SpeB)的质粒与编码多肽原结构域(即第2号序列的第28-145位氨基酸)的质粒的方法，其中成熟SpeB多肽在宿主细胞中可溶。在其它一些优选实施例中，本发明针对于在宿主细胞中表达多顺反子质粒的方法，其中多顺反子质粒同时编码成熟C192SSpeB多肽(或成熟野生型SpeB)和多肽原序列(第2号序列的第28-145位氨基酸)，其中成熟SpeB多肽在宿主细胞中可溶。本发明证明了调节可溶成熟SpeB的产生需要前序列结构域，提出前序列结构域作为分子内伴侣以起到指导成熟SpeB多肽正确折叠的作用。前序列结构域与成熟野生型SpeB多肽或者成熟C192SSpeB的结合具有大约分别为11nm和34nM的解离常数(Kd)(实例2)。这样的结合值表明前序列结构域与成熟SpeB多肽结构域之间具有高亲和力。此外，使用经尿素变性的成熟SpeB体外证明了前序列结构域的分子伴侣活性(实例2)。因此，在特定实施例中，本发明针对于不可溶成熟SpeB聚集体的蛋白质辅助折叠方法。举例而言，本发明的一个实施例提供一种产生成熟SpeB多肽的方法，这个方法包括以下步骤(a)在宿主细胞中重组表达一包含编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列的质粒，其中SpeB多肽在宿主细胞中形成不可溶的多肽聚集体；(b)溶解多肽聚集体，其中将经溶解的多肽定义为非天然成熟SpeB多肽；(c)在分子伴侣蛋白的存在下再折叠非天然成熟SpeB多肽，其中将该非天然成熟SpeB多肽折叠为天然成熟SpeB多肽；以及(d)回收天然成熟SpeB多肽。类似地，在其它实施例中本发明针对于蛋白质辅助折叠的方法，其中在一种或多种分子伴侣蛋白的存在下表达成熟SpeB多肽。举例而言，本发明提供在宿主细胞中表达成熟SpeB多肽的方法，该方法包含步骤在宿主细胞中重组表达包含(a)编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列和(b)编码GroEL多肽的多聚核苷酸序列的多顺反子质粒，其中成熟SpeB多肽在宿主细胞中可溶；以及(c)回收天然成熟SpeB多肽。A.编码SPEB抗原的多聚核苷酸本发明的经分离与纯化的化脓性链球菌多聚核苷酸用于产生成熟SpeB多肽抗原。更明确地说，在某些实施例中，本发明的多聚核苷酸编码成熟SpeB多肽和SpeB多肽原结构域，其中当在宿主细胞中表达时成熟SpeB多肽是可溶的。因此，在本发明的一些实施例中，一个多聚核苷酸编码包含第2号序列的146至398位氨基酸的成熟SpeB多肽，且第二个多聚核苷酸编码包含第2号序列的28至145位氨基酸的多肽原结构域。在一优选实施例中，本发明的一个多聚核苷酸编码成熟C192SSpeB多肽，其中成熟C912SSpeB多肽包含第2号序列的146至398位氨基酸，其中将在第2号序列的192位氨基酸残基的半胱氨酸突变为丝氨酸残基。在一些优选实施例中，编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸包含第1号序列的436至1197位核苷酸，编码成熟C192SSpeB多肽的多聚核苷酸包含第1号序列的436至1197位核苷酸，其中第2号序列的192位氨基酸残基为丝氨酸氨基酸，且编码多肽原结构域的多聚核苷酸包含第1号序列的82至435位核苷酸。因此，在特定实施例中，本发明的多聚核苷酸为DNA分子，其中DNA可为基因组DNA、质粒DNA或cDNA。在一优选实施例中，本发明的多聚核苷酸为重组cDNA多聚核苷酸。在另一优选实施例中，编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸包含于第一质粒载体中且编码SpeB多肽原结构域的多聚核苷酸包含于第二质粒载体中，其中在宿主细胞中共表达两个载体。在另一优选实施例中，编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸和编码SpeB多肽原结构域的多聚核苷酸包含在一多顺反子表达构建体中。如在部分E(实例4和图9)中所描述，本发明的多顺反子构建体在5′至3′方向上包含作为第一顺反子的SpeB多肽原结构域，接着为一包含翻译增强子和最优化Shine-Dalgarno核糖体结合位点的合成接头以及作为第二顺反子的成熟SpeB。在另一实施例中，本发明的多顺反子构建体在5′至3′方向上包含作为第一顺反子的成熟SpeB，接着为包含翻译增强子和最优化Shine-Dalgarno核糖体结合位点的合成接头以及作为第二顺反子的SpeB多肽原结构域。如下文中所使用，术语“多聚核苷酸”意谓一由磷酸二酯键连接的核苷酸序列。下文中出现的多聚核苷酸是自5′至3′方向的。本发明的多聚核苷酸包含自大约10至大约几十万个碱基对。优选地，多聚核苷酸包含自大约10至大约3,000个碱基对。在下文中阐明特定多聚核苷酸的优选长度。本发明的多聚核苷酸为脱氧核糖核酸(DNA)分子、核糖核酸(RNA)分子或使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。核酸分子为单链或双链的，但是优选地为双链DNA。当多聚核苷酸为DNA分子时，该分子为基因、cDNA分子或基因组DNA分子。在下文中由单个字母代码腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、次黄嘌呤(I)和尿嘧啶(U)表示核苷酸碱基。“经分离的”意谓自天然状态“经人工”改变。“经分离的”复合物或物质为已自其原始环境中改变或移除或同时经改变且移除的组合物或物质。举例而言，如该术语在下文中所运用的情况，自然存在于活体动物中的多聚核苷酸或多肽是未“经分离的”，但是自其自然状态的共存物质中分离出的相同多聚核苷酸或多肽是“经分离的”。优选的，“经分离的”多聚核苷酸没有在生物体(该核酸源自该生物体)的基因组DNA中自然位于核酸两侧的序列(即位于核酸5′与3′末端的序列)。举例而言，在各种实施例中，经分离的SpeB核酸分子较少含有约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的自然位于细胞(该核酸源自该细胞)基因组DNA核酸分子两侧的核苷酸序列。然而，SpeB核酸分子被融合到其它的蛋白质编码或调节序列的仍然被视为经分离的。使用标准的克隆与筛选技术自源自mRNA的cDNA文库获得本发明的SpeB多聚核苷酸。同样自诸如基因组DNA文库(例如化脓性链球菌文库)的自然资源中获得本发明的SpeB多聚核苷酸，或者使用此项技术中所熟知的且可通过商业途径得到的技术来合成。使用本
技术领域：
中熟知的方法容易地识别出编码成熟SpeB及/或SpeB多肽原结构域的多聚核苷酸的直系同源物和等位变异体。多聚核苷酸的等位变异体和直系同源物包含一核苷酸序列，这个核苷酸序列与第1号序列中展示的核苷酸序列的同源性通常至少约70-75％，更通常至少约为80-85％，且最通常约为90-95％或更高，或者包含此核苷酸序列的一个片段。因为能够与第1号序列中展示的核苷酸序列或此核苷酸序列的一个片段杂交，优选的是在严格的条件下，所以可容易地识别出这些核酸分子。使用编码成熟SpeB多肽和SpeB多肽原结构域的多聚核苷酸以在宿主细胞中重组产生可溶成熟SpeB多肽或其片段。这些多聚核苷酸可包括成熟SpeB多肽的编码序列及/或SpeB多肽原结构域的编码序列。这些多聚核苷酸也含有非编码5′与3′序列，诸如转录、非翻译序列、剪接信号、启动子/增强子序列、核糖体结合位点与多聚腺苷酸化信号。因此，在某些实施例中，由本发明提供的多肽序列信息(即第1号序列)允许制备相对短的DNA(或RNA)寡核苷酸序列，这些寡核苷酸序列具有与下文中所揭示的被选多聚核苷酸的基因序列特异性杂交的能力。将下文中使用的术语“寡核苷酸”定义为一种由两个或两个以上的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的分子，其通常由三(3)个以上，且通常十(10)个以上且高达一百(100)个或一百个以上组成(虽然优选的是在二十与三十之间)。精确的大小将取决于很多因素，其反过来又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。因此，在本发明的特定实施例中，基于经选择核苷酸序列的考虑来制备适当长度的核酸探针。这些核酸探针与编码成熟SpeB多肽或SpeB多肽原结构域的多聚核苷酸特异杂交的能力使得它们在各种实施例中有特定的效用。最重要的是，探针用于各种分析法，以在特定的样品中检测互补序列的存在。在某些实施例中，有利的是使用寡核苷酸引物。这些引物可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。使用本发明的多聚核苷酸设计这些引物的序列，以使用聚合酶链式反应(PCR)技术用于检测、扩增或突变来自真核细胞的编码SpeB多肽的SpeB多聚核苷酸的界定片段。在某些实施例中，有利的是与适当标记组合使用本发明的多聚核苷酸以检测杂交的形成。在此项
技术领域：
中已知很多适当的标记，包括放射性标记、酶标记或其它诸如抗生物素蛋白/生物素的配体标记，它们能够给出可检测到的信号。为了提供根据本发明的一些优势，用于杂交研究或分析法的优选核酸序列包括探针分子，这个探针与编码第2号序列多肽的多聚核苷酸的长度为至少10至大约18个核苷酸的延伸链互补。长度至少为10个核苷酸的大小才有助于确保片段足够长，以形成既稳定又有选择性的双链分子。尽管如此，为了增加杂交的稳定性与选择性，并且借此改良所获得的特异杂交分子的品质和等级，通常优选的是延伸链上的互补序列的长度大于10个碱基的分子。该等片段很容易制备，例如，由化学方法直接合成这些片段，应用核酸复制技术，诸如PCR技术(美国专利4,683,202，以引用的方式并入本文中)或者自含有适当插入片段与合适限制性酶位点的重组质粒中切割经选择的DNA片段。因此，使用本发明的多聚核苷酸探针分子，因为其能够与基因的互补延伸链选择性地形成双链分子。取决于预想的应用，实验者将期望运用各种杂交严格度条件，以获得对于目标序列具有不同选择性等级的探针(参见下表1)。对于需要高等级选择性的应用，实验者将通常希望使用相对严格的条件以形成杂交。对于一些应用，例如，当实验者希望使用杂交至潜在(underlying)模板的突变引物链制备突变体，或当实验者试图分离来自其它细胞的同源多肽编码序列、功能等效序列，或类似情况下，通常需要较小严格性的杂交条件以允许形成异源双链(参见表1)。由于相对于对照杂交的阳性杂交信号，从而可容易地识别出相互杂交种。在任何状况中，一般理解为由添加渐增量的甲酰胺使得条件更严格，其以与增加温度相同的方式使杂交双链不稳定。因此可容易地操纵杂交条件，且因此通常成为一种视所需结果而定的供选择方法。本发明也包括能够在降低的严格度条件、较优选地严格条件下、最优选地高严格条件下与下文中描述的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸。在下表1中展示严格度条件的实例高严格条件是那些至少与(例如)条件A-F一样严格的条件；严格条件是那些至少与(例如)条件G-L一样严格的条件；且降低的严格条件是那些至少与(例如)条件M-R一样严格的条件。表1杂交严格度条件表1(续)杂交严格度条件(bp)I杂交长度为杂交多聚核苷酸的经杂交区域的预计长度。当使一多聚核苷酸与一未知序列的目标多聚核苷酸杂交时，假定杂交长度为杂交多聚核苷酸的长度。当与已知序列的多聚核苷酸杂交时，由比对多聚核苷酸的序列并识别具有最佳序列互补性的区域或多个区域来判定杂交长度。BufferH在杂交和洗涤缓冲液中用SSPE(1xSSPE是0.15MNaCI、10mMNaH2PO4与1.25mMEDTA，pH7.4)取代SSC(1xSSC是0.15MNaCI与15mM柠檬酸钠)；在杂交完成后进行洗涤15分钟。TB至TR对于预期长度少于50的碱基对的杂交，杂交温度应该比杂交体融解温度(Tm)低5-10℃，其中根据下列等式判定Tm。对于长度少于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝2(A碱基数+T碱基数)+4(G碱基数+C碱基数)。对于长度在18与49之间个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交体中的碱基数，且[Na+]是杂交缓冲液中的钠离子浓度(1xSSC中的[Na+]＝0.165M)。多聚核苷酸杂交的严格度条件的额外实例提供于以下资料中Sambrook等人，1989，分子克隆实验室手册(MolecularCloningALaboratoryManual)，冷泉港实验室出版社(SpringHarborLaboratoryPress)，冷泉港，NY，第9和11章，以及Ausubel等人编，1995，最新分子生物学实验方法汇编(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，JohnWiley&Sons，Inc.，2.10和6.3-6.4章/节，它们以引用的方式并入本文中。B.成熟SpeB多肽抗原在特定实施例中，本发明提供包含成熟SpeB多肽及/或成熟C192SSpeB多肽的免疫原。在某些实施例中，这些免疫原用于对哺乳动物进行免疫以使其抗化脓性链球菌感染的免疫原性复合物中。在优选实施例中，免疫原为成熟C192SSpeB多肽，其提供保护(即交叉保护)以抵抗高百分率的异源化脓性链球菌菌株。通常在免疫原性的基础上定义抗原或免疫原。将免疫原性定义为诱导由体液及/或细胞介导的免疫应答的能力。因此，如在下文中所定义的，术语“抗原”或“免疫原”是拥有诱导由体液及/或细胞介导的免疫应答能力的分子。因此，在一个实施例中，本发明是针对至少包含化脓性链球菌成熟SpeB多肽及/或成熟C192SSpeB多肽的免疫原性复合物。在优选实施例中，成熟SpeB多肽抗原包含第2号序列的第146至398位氨基酸。在另一优选实施例中，成熟C192SSpeB多肽抗原包含第2号序列的第146至398位氨基酸，其中第2号序列192位的氨基酸由半胱氨酸残基突变为丝氨酸残基。在本发明的一些其它实施例中，包含成熟SpeB多肽及/或成熟C192SSpeB多肽的免疫原性复合物进一步包含一个或附加的多肽抗原(即除了SpeB之外的多肽)，其中这一个或附加的多肽抗原为化脓性链球菌抗原或来自其它感染性细菌及/或病毒的抗原。根据本发明的SpeB多肽的生物学等效序列或变异体包含一多肽，这个多肽含有与化脓性链球菌多肽相当大程度上的同源性，而这些化脓性链球菌多肽选自由SpeB酶原、C192SSpeB酶原、成熟SpeB多肽、成熟C192SSpeB多肽、SpeB多肽原结构域组成之群。举例而言，成熟SpeB多肽和成熟C192SSpeB多肽的生物学等效序列或变异体也包括那些其中第2号序列的成熟SpeB多肽经修饰的多肽，只要这些成熟SpeB多肽保持了引发免疫应答的能力。一般而言，成熟SpeB多肽的功能生物学等效序列或变异体是自然发生的氨基酸序列变异体，其中成熟SpeB多肽保持了引发免疫应答的能力。在本发明的成熟SpeB多肽的结构中进行修饰与改变，且仍然获得具有SpeB免疫原性质的分子。因为多肽的生物学功能活性是由多肽的相互作用能力与天性定义的，所以可在多肽序列(当然或者为其潜在DNA编码序列)中进行一些氨基酸序列取代，且尽管如此仍能获得具有类似性质的多肽。氨基酸取代一般是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小及其类似性质(例如，参见Kyte及Doolittle，1982和美国专利第4,554,101号，以全文引用的方式并入本文中)。考虑到各种前述特征的示例性取代为所属领域的技术人员熟知，且这些取代包括精氨酸与赖氨酸，谷氨酸与天冬氨酸，丝氨酸与苏氨酸，谷氨酰胺与天冬酰胺，及缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸(参见下表2)。因此本发明涵盖如上文所阐明的成熟SpeB多肽的功能或生物学等效序列。表2氨基酸取代原始残基示例性残基取代AlaGly；SerArgLysAsnGln；HisAspGluCysSerGlnAsnGluAspGlyAlaHisAsn；GlnlleLeu；ValLeulle；ValLysArgMetLeu；TyrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp；PheValIle；Leu在本发明的特定实施例中，提供多价或组合免疫原性复合物。由包括一种或一种以上本发明的多肽(例如成熟C192SSpeB)或其一个片段(例如SpeB表位片段)与一种或一种以上附加抗原提供组合免疫原性复合物。特定而言，由组合一种或一种以上成熟SpeB多肽或其片段与一种或一种以上多肽、多肽片段、碳水化合物、低聚糖、脂质、脂低聚糖、多聚糖、低聚糖-蛋白质偶联物、多聚糖-蛋白质偶联物、肽-蛋白质偶联物、低聚糖-肽偶联物、多聚糖-肽偶联物、蛋白质-蛋白质偶联物、脂低聚糖-蛋白质偶联物或多聚糖-蛋白质偶联物来提供组合免疫原性复合物。因此，在某些实施例中，将上面所阐明的一种或一种以上的抗原通过化学附着(即偶联作用)偶联至抗原载体蛋白质。偶联多肽至载体蛋白质的方法在本
技术领域：
中是熟知的且包括戊二醛、间马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳化二亚胺及双重氮联苯胺。示例性习知蛋白质载体包括但不限于E.coliDnaK蛋白质、半乳糖激酶(galK)、泛素、α-接合因子、β-半乳糖苷酶和流感NS-1蛋白质。诸如白喉类毒素和破伤风类毒素的类毒素(即编码自然产生的毒素的序列，经过足够的修饰被消除毒性的)、其各自的毒素以及这些蛋白质的任何突变形式，也可用作载体。一个示例性载体蛋白质是白喉毒素CRM197(白喉毒素的无毒形式，参见美国专利第5,614,382号，以全文引用的方式并入本文中)。其它载体包括假单胞菌的外毒素A，E.coli、霍乱弧菌及轮状病毒颗粒(rotaviralparticle)(包括轮状病毒(rotavirus)与VP6颗粒)的不耐热肠毒素。或者，可使用载体蛋白质或其它免疫原蛋白质的表位或片段。举例而言，可将半抗原偶合至细菌毒素的T细胞表位上(参见美国专利第5,785,973号)。类似地，可使用各种细菌热休克蛋白质，例如，分枝杆菌hsp-70。谷胱甘肽-S-转移酶(GST)是另一种有用的载体。所属领域的技术人员在本文中可容易地选择适当的载体。在某些实施例中，本发明是针对不可溶成熟SpeB聚集体的蛋白质辅助折叠方法。类似地，在其它实施例中本发明是针对蛋白质辅助折叠的方法，其中成熟SpeB多肽是在一种或一种以上分子伴侣蛋白质的存在下表达的。举例而言，在一个实施例中，本发明提供产生成熟SpeB多肽的方法，该方法包含以下步骤(a)在宿主细胞中重组表达包含编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列的质粒，其中SpeB多肽在宿主细胞中形成不可溶的多肽聚集体；(b)溶解多肽聚集体，其中将经溶解的多肽定义为非天然成熟SpeB多肽；(c)在分子伴侣蛋白质的存在下再折叠该非天然成熟SpeB多肽，其中将该非天然成熟SpeB多肽折叠为天然成熟SpeB多肽；以及(d)回收天然成熟SpeB多肽。在一些其它实施例中，本发明提供一种在包含一多顺反子质粒的宿主细胞中重组表达成熟SpeB多肽的方法，该多顺反子质粒包含(i)编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列和(ii)编码GroEL多肽的多聚核苷酸序列，其中成熟SpeB多肽在宿主细胞中可溶。因此，在特定实施例中，本发明提供分子伴侣蛋白质以辅助成熟SpeB多肽的折叠。在此项
技术领域：
中，分子伴侣是熟知的，包括但不限于诸如触发因子(TF)的核糖体结合蛋白质，诸如Hsp70、DnaK、Hsp40、DnaJ、GrpE的Hsp70家族分子伴侣以及诸如GroEL、GroES、Hsp60、Hsp10的分子伴侣素(Chaperonin)家族的分子伴侣(Creighton，1993；Hartl及Hayer-Hartl，2002)。本发明涵盖的所使用的分子伴侣蛋白质的多聚核苷酸和多肽序列在此项
技术领域：
中是熟知的(例如，参见美国专利第6,159,708号，美国专利第6,010,879号，美国专利第5,776,724号以及Lorimer及Baldwin，MethodsinEnzymology，1998，各以全文引用的方式并入本文中)，同样地对于下面所描述的特定的分子伴侣蛋白质的折叠/再折叠的必要条件、辅助因子及类似条件也是如此。因此，经由非限制性实例，来自E.coli的分子伴侣素GroEL是分子伴侣的热休克蛋白质60(Hsp60)种类的成员，且将其与来自E.coliGroE操纵子的GroES一起表达。通过结合未折叠蛋白质(例如成熟SpeB)，GroEL辅助蛋白质的折叠反应，其减少有聚集倾向的多肽中间物的浓度和关闭路径(off-pathway)聚集的速率，进而有助于区分天然构象(例如，经正确折叠、可溶成熟SpeB)。已知辅分子伴侣(co-chaperonin)GroES与诸如ATP、K+及Mg2+的辅助因子进一步增加由GroEL介导的多肽折叠反应的产量。因此，在特定实施例中，所属领域的技术人员将会把在所属
技术领域：
中已知的组份、辅助因子、附加分子伴侣蛋白质及其类似物算入在内，以改良或提高由分子伴侣介导(或辅助)的蛋白质折叠。虽然对于特定分子伴侣家族或种类的机制可进行变化，但是所有分子伴侣蛋白质(除去下文所述的PDI及PPI之外)所共有的潜在特征是能够与非天然构象的蛋白质结合。如在下文中所定义的，本发明的“分子伴侣”或“伴侣”蛋白质是协助多肽的活体内及/或活体外折叠的蛋白质。同样本文涵盖蛋白质二硫键异构酶(PDI)及肽酰-脯氨酰顺反异构酶(PPI)作为分子伴侣“类型”蛋白质，它们分别催化蛋白质二硫键的形成和脯氨酸的顺反异构化(参见Lorimer及Baldwin，MethodsinEnzymology，1998)。举例而言，由化脓性链球菌突变形成(Lyon等人，1998)证明在化脓性链球菌中表达SpeB需要RopA蛋白质。RopA蛋白质是分子伴侣，已知它与核糖体上的新生多肽结合，与GroEL结合并且具有肽酰脯氨酰异构酶活性。因此，在本发明的一些其它实施例中，用于产生成熟SpeB多肽的方法包含再折叠非天然成熟SpeB多肽或在PPI、特别是RopAPPI的存在下表达成熟SpeB。C.重组表达载体和宿主细胞在另一实施例中，本发明是针对包含编码SpeB多肽原结构域及成熟SpeB多肽的多聚核苷酸的表达载体。在某些实施例中，本发明的表达载体包含一多顺反子核酸序列，其中一个顺反子包含编码SpeB多肽原结构域的多聚核苷酸，且第二个顺反子包含编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸。在一些其它实施例中，本发明的表达载体包含编码SpeB多肽原结构域的多聚核苷酸，且第二个表达载体包含编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸。在一个优选实施例中，本发明的表达载体是质粒构建体。在另一个优选实施例中，本发明的表达载体是在表3，实例1中所阐明的质粒。如本文所使用，术语“载体”是指能够运输与其连接的另一个核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，它是指其中连接有附加DNA片段的环状双链DNA环。载体的另一种类型是病毒载体，其中将附加DNA片段连接到病毒基因组中。一些载体在其导入的宿主细胞中能够自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型(episomal)哺乳动物载体)。此外，一些载体能够指导经操作连接到其中的基因的表达。这些载体在本文中称作“表达载体”。一般而言，重组DNA技术中有用的表达载体经常是质粒的形式。在本说明书中，交替地使用“质粒”和“载体”，而质粒是最普通的载体形式。然而，本发明希望包括表达载体的这些其它形式，诸如病毒载体(例如，复制缺陷反转录病毒、腺病毒及腺相关病毒)，其具有同样的功能。在原核生物中表达蛋白质最经常的是以含有指导融合或非融合蛋白质表达的组成性或可诱导型启动子的载体在E.coli中进行。融合载体向其中所编码的蛋白质添加一些氨基酸，添加到重组蛋白质的氨基端或羧基端。在某些实施例中，以包含(i)编码SpeB多肽原结构域的多聚核苷酸序列和(ii)编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列的多顺反子质粒转染、转化、转导或感染宿主细胞。如本文所定义的，“多顺反子mRNA”编码两种或两种以上多肽。因此，如下文中所定义的，本发明的“多顺反子多聚核苷酸”、“多顺反子cDNA”或“多顺反子质粒”编码多顺反子mRNA，其接着编码两种或两种以上多肽。合适的诱导型、非融合E.coli表达载体的实例包括pTrc(Amann等人，1988)、pETlld(Studier等人，1990)、pET、pRSET、pCRT7-CTTOPO和pIVeX。自pTrc载体的目标基因表达依赖于宿主RNA聚合酶自杂交trp-lac融合启动子的转录。自pETlld载体的目标基因表达依赖于由共表达的病毒RNA聚合酶T7gnl介导的自T7gnlβ-lac融合启动子的转录。这种病毒聚合酶由来自隐含有T7gnl基因的常驻原噬菌体的宿主菌株BL21(DE3)或HMSI74(DE3)在lacUV5启动子的转录控制下提供的。同样涵盖于一些实施例中的为包含人CMV或猿CMV启动子的质粒载体，诸如pRK5、pCMVBlue、pCMV-LIC、pAPL400-023、pAPL400-087与pAPL400-088。最大化E.coli中重组蛋白质表达的一个策略是在宿主细菌中表达该蛋白质，而这种宿主细菌以蛋白质水解来裂解重组蛋白质的能力被破坏。另一个策略是改变待插入到表达载体中的核酸的核酸序列，以致各氨基酸的单独密码子为那些在E.coli中优选使用的密码子。本发明的这种核酸序列的改变是通过标准DNA突变形成或合成技术来进行的。启动子是通常在转录开始点(即转录起始位点)前(上游)大约100个核苷酸对以内的DNA分子。该区域通常含有几种类型的DNA序列元件，它们在不同基因中位于相似的相对位置。如本文所使用的，术语“启动子”包括在所属
技术领域：
中所指的上游启动子区域或启动子区域。本发明另一方面是关于其中导入本发明的重组表达载体的宿主细胞。在本文交替地使用术语“宿主细胞”、“遗传工程宿主细胞”及“重组宿主细胞”。应理解这些术语指的不但是那些特定受导入的细胞，而且指这个细胞的后代或潜在后代。因为由于突变或者环境影响，在随后的各代中可发生一些修饰，所以事实上，这些后代与亲代细胞可能不完全相同，但是仍然将其包括在本文所使用的术语的范围内。虽然宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，但是优选的为原核细胞。举例而言，在诸如E.coli及化脓性链球菌的细菌细胞中表达SpeB多肽。在其它实施例中，在昆虫细胞(例如Sf9、highfive细胞及Sf21细胞)、酵母(例如巴斯德毕赤氏酵母(P.pastoris)、甲醇毕赤氏酵母(P.methanolica)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)及酿酒酵母(S.cerevisiae))或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠(Chinesehamster)卵巢细胞(CHO)、Cos-1、CV-1、HeLa、NIH3T3、PER-C6及NSO)中表达SpeB多肽。其它合适的宿主细胞为所属领域技术人员已知。使用本发明的宿主细胞，诸如培养的原核宿主细胞来产生(即表达)SpeB多肽。在一个实施例中，这个方法包含在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中导入了编码成熟SpeB多肽和SpeB多肽原结构域的重组表达载体)直到产生成熟SpeB多肽和SpeB多肽原结构域为止。在另一个实施例中，这个方法进一步包含自培养基或宿主细胞中分离成熟SpeB多肽。经由习知的转化、转导、感染或转染技术将载体DNA导入原核或真核细胞。如本文所使用的，术语“转化”、“感染”与“转染”是希望指各种用于导入外源核酸(例如DNA)至宿主细胞中的所属
技术领域：
所公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、由DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染、感染或电穿孔转化。在Sambrook等人(“分子克隆实验室手册”(″MolecularCloningALaboratoryManual″)，第2版，冷泉港实验室(ColdSpringHarborLaboratory)，冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)，冷泉港(ColdSpringHarbor)，NY，1989)与其它实验室手册中可找到转化、感染或转染宿主细胞的合适方法。最广泛使用的方法是由磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染。虽然机制仍然不清楚，但是认为通过细胞内吞作用经转染的DNA进入细胞的细胞质，并运输至细胞核。取决于细胞类型，任何一次可转染培养细胞群中高达达到90％的细胞。因为其高效率，由磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染是要求在大量细胞中瞬时表达外源DNA的实验方法的选择。由磷酸钙介导的转染也用于建立整合了外源DNA拷贝的细胞系，外源DNA通常在宿主细胞基因组中前后排列成纵列拓扑结构。将表达载体的编码序列操作连接至转录终止区域。RNA聚合酶转录DNA编码序列，经由其中多聚腺苷酸化发生的位点。通常，位于多聚腺苷酸化位点下游几百个碱基对的DNA序列被用来对终止转录。那些DNA序列在本文中指的是转录终止区域。经转录的信使RNA(mRNA)的有效多聚腺苷酸化需要那些区域。在所属
技术领域：
中转录终止区域是熟知的。一示例性转录终止区域包含SV40或鱼精蛋白基因的多聚腺苷酸化信号。由许多在所属
技术领域：
中熟知的技术将本发明的DNA分子、基因或多聚核苷酸并入载体。举例而言，已证明载体pUC18是特别有价值的。同样地，相关载体M13mp18和M13mp19用于本发明的一些实施例中，明确地说，是用于进行双脱氧测序。在优选实施例中，本发明的重组宿主细胞是原核寄主细胞。优选地，本发明的重组宿主细胞是大肠杆菌(Escherichiacoli)的DH5a菌株的细菌细胞。一般而言，原核生物对于可用于本发明的DNA序列的初始克隆与载体构建是优选的。举例而言，E.coliK12菌株是特别有用的。所使用到的其它微生物菌株包括E.coliB和E.colix1976(ATCC第31537号)。当然，这些实例希望进行说明而非限制。原核生物也用于表达。所使用的为前述的菌株以及诸如W3110(ATCC第273325号)、BLR(DE3)、BLR(DE3)pLysS、AD494(DE3)、AD494(DE3)pLysS、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、BL21(DE3)pLacl、BL21trxB(DE3)、BL21trxB(DE3)pLysS、HMS174(DE3)、HMS174(DE3)pLysS、HMS174(DE3)pLysE、Origami(DE3)、Origami(DE3)pLysE、Origami(DE3)pLysE、Origami(DE3)pLacl、OrigamiB(DE3)、OrigamiB(DE3)pLysS、OrigamiB(DE3)pLysE、OrigamiB(DE3)pLacl、Rosetta(DE3)、Rosetta(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)pLysE、Rosetta(DE3)pLacl、Tuner(DE3)、Tuner(DE3)pLysS及Tuner(DE3)pLacl的E.coli菌株，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的杆菌(bacilli)，或诸如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratiamarcesans)的其它肠杆菌(enterobacteriaceae)以及各种假单胞菌(Pseudomonas)种。一般而言，将含有复制子和控制序列的质粒载体连同这些宿主一起使用，这些质粒载体源自与宿主细胞相容的种。载体通常带有复制位点以及能够在经转化的细胞中提供表型选择的标记序列。举例而言，使用源自E.coli种的质粒pBR322转化E.coli(Bolivar等人，1977)。pBR322含有氨苄青霉素和四环素抗性基因，且因此为识别经转化的细胞提供一种简单的方法。pBR质粒或其它微生物质粒或噬菌体也必须含有，或者经修饰后含有微生物用于表达其本身多肽的启动子。那些最普通地用于重组DNA构建的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)与乳糖启动子系统(Chang等人，1978；Itakura等人，1977；Goeddel等人，1979；Goeddel等人，1980)、色氨酸(TRP)启动子系统(欧洲申请案第EP0036776号；Siebwenlist等人，1980)和T7或T7lac启动子系统。虽然这些为最普通使用的启动子系统，但是已经发现且利用了其它微生物启动子，并且发表了关于它们的核苷酸序列的详细资料，使所属领域的技术人员能够向质粒载体中导入功能性启动子(Siebwenlist等人，1980)。转染之后，在培养条件下将细胞维持一段足够表达SpeB多肽的时间。培养条件在所属
技术领域：
中是熟知的，并且包括离子复合物和浓度、温度、PH以及类似条件。通常，在培养条件下将经转染的细胞维持于培养基中。对于各种细胞类型的合适培养基在所属
技术领域：
中是熟知的。在一优选实施例中，温度为约20℃至约50℃，更优选的为约30℃至约40℃，且更加优选的为37℃。pH值优选的为约6.0至大约8.0，更优选的为约6.8至约7.8，最优选的为7.4。摩尔渗透压浓度优选的为约200毫克渗透压/升(mosm/L)至约400mosm/l，更优选的为约290mosm/L至约310mosm/L。转染以及表达编码多肽所需要的其它生物学条件在所属
技术领域：
中是熟知的。将经转染的细胞维持一段足够表达SpeB多肽的时间。合适的时间尤其取决于所使用的细胞类型，且可容易地由所属领域的技术人员判定。通常，维持时间为约2至约14天。自经转染的细胞或自其中培养那些细胞的培养基中回收或收集重组SpeB多肽。回收包含分离和纯化SpeB多肽。在所属
技术领域：
中熟知多肽的分离和纯化技术，且包括那些如沉淀、过滤、层析、电泳及类似程序的程序。在又一实施例中，由诸如无细胞翻译系统(例如，参见Betton，2003；Braun等人，2002；Jermutus等人，1998；Kigawa等人，1999；Kim等人，1996及Spirin等人，1988)的体外蛋白质翻译系统产生本发明的SpeB多肽。举例而言，美国专利第6,399,323号和美国专利第5,478,730号描述了在非细胞(体外)翻译系统中制备或产生多肽的方法、条件及其类似方面，每个都以全文引用的方式并入本文中。D.免疫原性复合物在一些优选实施例中，本发明提供包含成熟SpeB多肽免疫原(即成熟野生型或成熟C192S)和生理上可接受的载体的成熟SpeB免疫原性复合物。更优选的是，该免疫原性复合物至少包含成熟野生型SpeB多肽，它包含第2号序列的第146-398位氨基酸；或者成熟C192SSpeB多肽，它包含第2号序列的第146-398位氨基酸，其中将第2号序列192位的半胱氨酸突变为丝氨酸。在本发明的其它实施例中，提供多价免疫原性复合物或组合免疫原性复合物。由包括一种或一种以上本发明的多肽(例如成熟C192SSpeB)与来自化脓性链球菌及/或其它细菌种的一种或一种以上附加抗原一起来提供组合免疫原性复合物。特定地说，由组合一种或一种以上本发明的成熟SpeB多肽与一种或一种以上多肽、多肽片段、碳水化合物、低聚糖、脂质、脂低聚糖、多聚糖、低聚糖-蛋白质偶联物、多聚糖-蛋白质偶联物、肽-蛋白质偶联物、低聚糖-肽偶联物、多聚糖-肽偶联物、蛋白质-蛋白质偶联物、脂低聚糖-蛋白质偶联物或多聚糖-蛋白质偶联物来提供组合免疫原性复合物。将本发明的成熟SpeB多肽并入适于投药于例如人的哺乳动物个体的免疫原性复合物中。这些复合物通常包括“免疫原”复合物和医药上可接受的载体。如下文中所使用的语言“医药上可接受的载体”希望包括任何及所有与医药学投药相容的溶剂、分散介质、包被物、抗细菌及抗真菌剂、等渗及吸收延缓剂及其类似物。将这些介质与药剂用作医药活性物质在所属
技术领域：
中是熟知的。除了与活性化合物不相容的任何习知介质或试剂之外，这些介质可用于本发明的复合物。也将辅助的活性化合物并入复合物中。调配本发明的免疫原性复合物使其与计划中的投药途径相适合。投药途径的实例包括胃肠外(例如，静脉内、皮层内、皮下、肌肉、腹膜内)、粘膜(例如，口服、直肠、鼻内、口腔、阴道、呼吸道)及经皮(局部)投药。用于胃肠外、皮层内或皮下应用的溶液或悬浮液包括下列组份诸如用于注射的水、盐溶液、非挥发性油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其它合成溶剂的灭菌稀释剂，诸如苄醇或羟苯甲酸甲酯类的抗细菌剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠的抗氧化剂，诸如乙二胺四乙酸的螯合剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐的缓冲液以及诸如氯化钠或葡萄糖的用于调节张性的试剂。以诸如盐酸或氢氧化钠的酸或碱调节PH。将胃肠外制剂封装入安瓿、一次性消毒注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。通过在适当溶剂中并入所需量的活性化合物(例如成熟SpeB)以及(若需要)上文所列举的成份的一种或组合来制备灭菌注射溶液，接着过滤灭菌。一般而言，通过在灭菌媒介物中并入活性化合物来制备分散液，其中灭菌媒介物含有基本分散介质及上文所列举的所需的其它成分。在用于制备灭菌注射溶液的灭菌粉末的状况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，由这些方法从其先前经过滤灭菌的溶液中产生活性成份以及任何其他所要成份的粉末。口服复合物通常包括惰性稀释剂和可食用载体。将它们封装入明胶胶囊中或者压缩成锭剂。为了进行口服治疗投药，将活性化合物和赋形剂合并且以锭剂、片剂或胶囊的形式使用。也可使用流体载体来制备口服复合物以用作漱口药水，其中流体载体中的化合物经口服使用，且被洗涮且咳出或吞入。医药学上相容的结合剂及/或佐剂物质包括于复合物中作为该复合物一部分。锭剂、丸剂、胶囊、片剂和类似剂型含有任何下列成份或具有相似性质的化合物诸如微晶纤维素、黄耆胶或明胶的粘合剂；诸如淀粉或乳糖的赋形剂，诸如海藻酸、羟基乙酸淀粉钠(Primogel)、或玉米淀粉的崩解剂；诸如硬脂酸镁或Sterotes的润滑剂；诸如胶态二氧化硅的助流剂；诸如蔗糖或糖精的甜味剂；或者诸如薄荷油、水杨酸甲酯或橙味剂(orangeflavoring)的调味剂。对于吸入法投药而言，其传送化合物的形式是从压缩容器或分配器或喷雾器中产生的气溶胶喷射的形式，而压缩容器或分配器中含有例如气体(诸如二氧化碳)的合适推进剂。系统投药也可以通过粘膜或经皮方法。对于粘膜或经皮投药，在调配物中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。这些渗透剂一般在所属
技术领域：
中熟知，其包括例如用于粘膜投药的去垢剂、胆盐及褐霉菌酸衍生物。通过使用鼻腔喷雾或栓剂完成粘膜投药。对于经皮投药，将活性物质调配成在所属
技术领域：
中熟知的软膏、油膏、凝胶体或乳剂。也可以栓剂(例如，与诸如可可脂及其它甘油酯的习知栓剂基质)或用于直肠传送的滞留型灌肠剂的形式制备这些化合物。在一个实施例中，与保护化合物防止其受到身体的快速清除的载体一起制备这些活性化合物，诸如包括植入物和微胶囊传送系统的控释调配物。使用生物可降解的、生物相容的聚合体，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原质、聚原酸酯和聚乳酸。制备这些调配物的方法对于所属领域的技术人员显而易见。材料可自Alza公司及Nova医药有限公司购得。脂质体悬浮液(包括目标为经感染的细胞、具有针对病毒抗原的单克隆抗体的脂质体)也用作医药上可接受的载体。它们是根据所属领域的技术人员熟知的方法进行制备的，例如，如在美国专利4,522,811中所描述的方法，将它以引用的方式并入本文中。尤其有利的是以剂量单位形式调配口服或胃肠外投药复合物以方便投药和剂量的一致。下文中所使用的剂量单位形式指的是物理上分离的单位，其适合作为待治疗的个体的单位剂量；各个单位含有经计算可产生所要治疗效果的活性物质的预定量和所需的医药载体。本发明的剂量单位形式的规格依据或直接根据以下方面而定活性化合物的独特特征和所要达到的特定治疗效果，以及配制这种活性化合物以用于对个体进行治疗的
技术领域：
中所固有的局限性。医药上可接受的媒介物应理解为选派化合物或化合物组合掺入医药或免疫原性复合物，它们不会引起副作用且使下列方面成为可能例如，使活性化合物的投药便利，增加其在体内的寿命及/或其功效，增加其在溶液中的溶解度或者增强其保存能力。这些医药上可接受的媒介物为所属领域的技术人员熟知，并且由他们根据所选活性化合物的性质和投药模式进行调适。本发明的免疫原性复合物可进一步包含一种或一种以上佐剂。“佐剂”是用来增强抗原的免疫原性的物质。因此，经常使用佐剂以促进免疫应答并且佐剂为所属领域的技术人员所熟知。本发明中所涵盖的佐剂的实例包括但不限于诸如磷酸铝和氢氧化铝的铝盐(明矾)，结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、百日咳杆菌(Bordetellapertussis)、细菌脂多糖、可自Corixa(Hamilton，MT)购得并在美国专利第6,113,918号中描述的氨基烷基葡糖胺磷酸盐(aminoalkylglucosaminephosphate)化合物(AGP)或其类似物或衍生物；一种这样的AGP为2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酸基-3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]-b-D-葡萄糖甙，也称作529(先前称作RC529)，将其调配成水溶液形式或稳定乳状液，在美国专利第4,912,094号中描述的MPLTM(3-O-脱酰单磷酰基脂A)(Corixa)，诸如含CpG基元的寡核苷酸的合成多聚核苷酸(美国专利第6,207,646号)，多肽，在美国专利第5,057,540号中描述的诸如QuilA或STIMULONTMQS-21(Antigenics，Framingham，Massachusetts)的皂角苷，百日咳毒素(PT)，或E.coli不耐热毒素(LT)，尤其是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129；参见，例如国际专利公开案第WO93/13302号和第WO92/19265号，霍乱毒素(野生型或突变型形式，例如根据已公开的国际专利申请案第WO00/18434号，将其中第29位氨基酸谷氨酸取代为另一种氨基酸代替，优选的为组氨酸)。各种细胞因子或淋巴因子适合于用作佐剂。一种这样的佐剂为粒细胞-巨噬细胞克隆刺激因子(GM-CSF)，它具有美国专利第5,078,996号中所描述了核苷酸序列。已经将含有GM-CSFcDNA的质粒转化至E.coli中，且存放于美国模式培养物保藏所(AmericanTypeCultureCollection)(ATCC)，1081Boulevard大学，Manassas，VA20110-2209，收录号为39900。细胞因子白介素-12(IL-12)是另一种佐剂，描述于美国专利第5,723,127号。已展示其它细胞因子或淋巴因子也具有免疫调节活性，其包括但不限于白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18，干扰素-α、β和γ，粒细胞克隆刺激因子和肿瘤坏死因子α和β，且适用于用作佐剂。通常以含有如所需的标准、熟知的无毒生理上可接受的载体、佐剂和媒介物的剂量单位调配物形式胃肠外投药本发明的复合物。如下文中所使用的术语胃肠外的包括静脉内、皮下、皮层内、肌肉、动脉内注射或输注技术。根据熟知的技术使用合适的分散或湿润剂和悬浮剂调配注射制剂，例如灭菌注射水溶液或油质悬浮液。灭菌注射制剂也可为无毒胃肠外可接受稀释液或溶剂中的灭菌注射溶液或悬浮液，例如1，3-丁二醇中的溶液。在可使用的可接受媒介物和溶剂中有水、林格氏(Ringer′s)溶液和等渗氯化钠溶液。此外，习知使用灭菌、不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，使用包括合成单或双甘油酯的任何温和的不挥发性的油。此外，诸如油酸的脂肪酸可用来制备注射制剂。优选的载体包括经磷酸盐、乳酸盐、三羟甲基氨基甲烷(Tris)及其类似物缓冲的中性盐溶液。当投与病毒载体时，将载体充分纯化以使它基本上不含不良的污染物，诸如有缺陷的干扰腺病毒颗粒或内毒素和其它热原物，以便该病毒载体在接受载体构建物的个体中不会引起任何不适反应。纯化载体的优选方法涉及到使用浮力密度梯度，诸如氯化铯梯度离心。载体也可为脂质体。使用脂质体作为传送媒介物的方法在所属
技术领域：
中熟知。在特定实施例中，本发明的免疫原性复合物包含本发明以操作方式与控制基因表达的调节序列相关连的多聚核苷酸序列。在启动DNA表达的调节元件(即启动子及/或增强子元件)的控制下，将感兴趣的多聚核苷酸序列经基因工程法导入诸如质粒的表达载体中。在一优选实施例中，使用人类巨细胞病毒立即早期启动子/增强子(美国专利第5,168,062号)。该启动子可为细胞特异性启动子且仅在预定细胞中允许多聚核苷酸的实质性转录。将多聚核苷酸以“裸露”DNA(美国专利第5,580,859号)直接导入宿主中，或将多聚核苷酸与诸如普鲁卡因(bupivicaine)及其它局部麻醉剂(美国专利第5,593,972号)及阳离子聚胺(美国专利第6,127,170号)等有助于免疫的药剂一起调配成复合物。在这个多聚核苷酸免疫程序中，在体内瞬时的基础上表达本发明的多肽，而没有遗传物质被插入或整合到宿主的染色体中。这个程序与基因治疗不同，而基因治疗的目标是将感兴趣的遗传物质插入或整合到染色体中。使用一分析法证实经免疫投药的多聚核苷酸在宿主中不会引起转化的表型(美国专利第6,168,918号)。本文所引用的所有专利和公告均特此以引用的方式并入本文中。E.实例除其他详细描述之处外，以下实例使用已为所属领域技术人员熟知的标准技术进行。为说明的目的提供以下实例，且不应解释为以任何方式限制本发明之范畴。实例1材料与方法培养基与试剂。在所有表达研究中使用E.coliBLR(DE3)(Novagen，CA)。细菌在适当抗生素选择条件下在Luriabroth培养基(LB)中生长。氨苄青霉素使用浓度为100μg/mL且卡那霉素使用浓度为50μg/mL。使用ZeroBluntTOPO克隆载体pCR-Blunt(InVitrogen，Carlsbad，CA)克隆PCR所产生之片段。Century-PlusRNAMarkersTM、MillenniumRNAMarkersTM、RNAlaterTM、RNAqueous-MidiTM、DNA-freeTM、ULTRAhybTM、NorthernMaxTM及RETROscriptTM获得自Ambion(Austin，TX)。GeneScreenTM杂交膜、荧光素-N6-dATP、经Renaissance抗荧光素AP结合的多克隆抗体、及CDP-Star获得自PerkinElmerLifeSciences，波士顿，MA。所有限制性酶来自NewEnglandBiolabs(Beverly，MA)。聚合酶链式反应。除非另作说明，否则利用以下反应条件在50μL终体积中进行PCR扩增0.2mMdNTPs、1.0mMDTT、各引物0.8μM、10U耐热聚合酶及1X耐热聚合酶缓冲液。对于克隆及突变反应，应用Pwo聚合酶(BoehringerMannheim，Indianapolis，IN)，而其他所有扩增则使用Taq聚合酶(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)。扩增由94℃下30秒、55℃下30秒及72℃下30秒的25个循环组成。质粒构建体。使用分别含有NcoI及BamHI位点(下划线)的上游引物(5′CCATGGAACCAGTTGTTAAATCTCTCC3′)(第3号序列)及下游引物(5′GGATCCTAAGGTTTGATGCCTACAACAGC3′)(第4号序列)PCR扩增对应成熟SpeB编码区的770bp片段。该上游引物经设计为含有一嵌套在NcoI克隆位点中的ATG翻译起始密码子，导致在所表达蛋白质的N端添加一个蛋氨酸残基且将第一个残基从谷氨酰胺(CAA)改变为谷氨酸(GAA)。同样地，使用上游引物(5′CCATGGATCAAAACTTTGCTCGTAACG3′)(第5号序列)及下游引物(5′GGATCCTTATTTAATCTCAGCGGTACCAGC3′)(第6号序列)扩增包括前序列域(氨基酸28-146)的367bp片段，该对引物具有为进行克隆目的而经遗传工程构造的NcoI(上游引物)及BamHI(下游引物)位点。终止密码子在下游引物中紧接着BamHI位点的3′端插入，以指导所表达之重组蛋白质的翻译终止。PCR反应使用含有SpeB酶原基因的以质粒为基础的模板，其具有一TGT代替AGT的突变，其在192位点(C192S)编码一单个半胱氨酸取代丝氨酸，如前所述(Matsuka等人，1999)。PCR产物经亚克隆至pCR-Blunt且随后通过使用NcoI及BamHI限制性消化将其切开。该770bp成熟C192SSpeB及367bp前序列域编码片段由琼脂糖凝胶电泳纯化，且利用NcoI及BamHI限制性酶位点分别连接至pET28a及pET3d。使用标准方法将所得到的表达质粒pLP681及pLP682共转化至E.coliBLR(DE3)。将所产生的细菌表达株用于基于双质粒的共表达分析。通过使用突变PCR产生成熟野生型SpeB表达构建体，该PCR使用重叠的上游引物(5′GCTACAGGATGTGTTGCTACTGC3′)(第7号序列)及下游引物(5′GCAGTAGCAACACATCCTGTAGC3′)(第8号序列)，该对引物具有一单个A至T(粗体)的碱基变化以便逆转用作PCR模板的pLP681中的C192S突变。突变由Weiner等人(1994)所描述之方法的修改组成，使用以下循环条件94℃1分钟，94℃15秒16个循环及68℃10分钟；接着94℃15秒12个循环及68℃10分钟，在68℃上的延伸时间在每一循环中增加15秒的增加量，导致68℃最终延伸时间为13分钟。在转化入E.coli之前，以Dpn切开PCR反应产物。所得到的pLP680克隆在使用之前经测序以验证预期突变。该质粒与pLP682经共转化入E.coliBLR(DE3)，以用于基于双质粒的共表达研究。为构建多顺反子表达载体，通过使用NcoI及BamHI的限制性消化切开来自pLP682的SpeB前序列域编码区。该367bp片段经琼脂糖凝胶电泳纯化且连接至亦经NcoI及BamHI限制酶处理过的pET28a中，结果得到pLP688。使用下列上游引物通过PCR产生4个长度增加的不同连接区，该等连接区后面跟随着成熟SpeB编码区5′AGATCTAAGGAGATATACATATGGACCCAG3′(5nt接头；第9号序列)；5′AGATCTTTAAGAAGGAGATATACATATGGAACC3′(10nt接头；第10号序列)；5′AGATCTGCACATAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGG3′(20nt接头；第11号序列)；5′GATCTAACTTGACTAAATTCGAACAGCACATAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGG3′(40nt接头；第12号序列)。所有上游引物含有一个在5′末端(下划线)的BgIII酶切位点，一最优化ShineDalgamo位点(粗斜体)及翻译起始密码子(粗体)。将一下游引物(5′CTCGAGCTAAGGTTTGATGCCTA-CAACAGC3′)(第13号序列)用于所有基于接头的扩增反应，该下游引物在紧邻翻译终止密码子5′端含有一XhoI位点(下划线)。使用pLP681作为PCR的模板，使用上文所示的引物来扩增5nt、10nt或20nt接头，加上成熟C192SSpeB编码区。同样的，使用pLP680作为模板产生20nt接头加上成熟野生型SpeBPCR产物。PCR片段经亚克隆至pCR-Blunt，以BglII及XhoI限制性消化而切开且籍由琼脂糖凝胶电泳纯化。经分离后，使用BamHI及XhoI限制性位点将这些片段连接至pLP688以产生pLP683、pLP684、pLP685及pLP687多顺反子表达构建体。在一相同方式下，以上文所示的引物使用pLP685作为PCR模板合成pLP686。表3列出所有产生并用于体内分析的表达质粒的说明。除非另外注明，否则表3中列出的所有表达构建体是处于pET28a背景中的。表3半胱氨酸蛋白酶及前序列结构域表达构建体的说明重组蛋白表达。对于多顺反子以及基于双质粒的共表达研究，将所要的细菌表达株接种于含有适当抗生素的200mLLB中且37℃下生长过夜。将过夜培养物以1∶10稀释至含新鲜抗生素的2L培养基中，25℃下生长至OD600接近0.6，并以1mMIPTG在25℃下诱导16小时。离心收集细胞且将所得细胞团储存于-20℃下待用。取诱导前及诱导后两者的样本做蛋白表达分析和RNA分离，将用于RNA分析的样本在-70℃下储存于RNA/aterTM中待用。通过超声波处理裂解细胞后使用SDS-PAGE评价蛋白质的表达。离心沉淀不溶物且回收可溶上清部分。在重悬于1mLPBS之前，以PBS洗涤细胞碎片两次。在细胞裂解之前，在细菌培养基OD600的基础上对所有可溶及不溶部分进行标准化。通过标准方法转移至PVDF膜后，通过考马斯亮兰(Coomassieblue)染色及Western印迹分析对蛋白表达进行显现。使用所产生的抗SpeB酶原形式的多克隆抗体对印迹进行探测，允许同时检测表达的前序列结构域和成熟28kDaSpeB。RNA的分离。使用RNAqueous-MidiTM从细菌培养物中分离总RNA。在室温下解冻储存于RNA/aterTM的诱导后的样本，且在1mLRNAqueousTM裂解/结合缓冲液中重悬之前使细胞沉淀成团。接着按照操作手册中的说明处理所有裂解物。按照制造商说明，使用LiCl沉淀所分离的RNA且以DNA-freeTM处理两次，以去除任何杂质基因组或质粒DNA。通过分析260nm的吸光度对RNA进行定量，且通过测定吸光度比值A260nm/A280nm来评价RNA的纯度。使用前述的适当引物对，通过PCR对RNA样本(1μg)进行分析以验证不存在杂质质粒DNA。此外，通过对加入到PCR反应中的1ngpLP685质粒的spikerecovery分析测定所有样本的残余DNase污染。只有证明无DNA和DNase污染的样本才能用于进一步分析。Northern印迹杂交。如制造商说明书所示使用NorthernMaxTM体系，在变性条件下将总RNA(5μg)在1％琼脂糖凝胶上进行分离。以EtBr将Millennium及CenturyRNA标记(每个2μg)预先染色并用于估测RNA大小。将样本转移至尼龙膜(GeneScreenTM)上，经紫外线(UV)交联且在80℃下烘烤2小时以逆转用于分离RNA的甲醛反应。在UV下显像RNA标准样品，并在杂交之前将片段位置标示在尼龙膜上。以2xSSC(0.3MNaCl，0.03M柠檬酸钠)预先湿润该尼龙膜并在ULTRAhybTM中42℃下预杂交2小时。以pLP685为模板且使用如上文所述的对前序列结构域(367bp)及成熟SpeB序列(770bp)特异性的引物对来PCR合成用于Northern分析的探针。在PCR反应中使用荧光素-N6-dATP(10μM)以产生随机标记的成熟SpeB和前序列结构域DNA探针。由琼脂糖凝胶电泳纯化所得到的探针，并将每个中的32pg进行变性且用于在ULTRAhybTM中42℃下进行膜杂交过夜。杂交后，对膜进行洗涤，在室温下以过量2xSSC洗10分钟，两次；在42℃下以2xSSC、1％SDS洗20分钟，两次；且在42℃下以0.2xSSC、0.1％SDS洗20分钟，两次。按照制造商说明，使膜在BLOTTO中经封闭且使用与碱性磷酸酶结合的抗荧光素多克隆抗体和CDP-Stai来使膜显影。在室温下使印迹暴露于BioMaxMR-2放射自显影膜(EastmanKodak，Rochester，NY)5分钟，以能够进行信号检测。cDNA合成。在制造商所说明的条件下，使用用于RT-PCR的RETROscriptTM第一链合成试剂盒(FirstStrandSynthesiskit)和随机Decamer，通过逆转录由2μg总RNA制备cDNA。使用相同条件产生阴性对照样本，但是缺少逆转录酶(-RT)。在用于PCR及定量PCR分析之前将反应产物以1∶200稀释于无核酸酶的水中。cDNA的定量PCR(qPCR)分析。使用PrimerExpress软件(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)设计对前序列结构域、成熟SpeB及pET28a编码的卡那霉素抗性基因(KanR)特异性的引物和探针。在以下条件下进行定量PCR反应每一引物(上游及下游)300nM、200nMFAM/TAMRA探针、2xTaqManUniversalPCRMasterMix(AppliedBiosystems)和1μL经稀释的cDNA或阴性对照样本。在ABI7000序列检测系统上，反应在25μL的终体积中进行，使用以下循环条件50℃下2分钟，95℃下10分钟，95℃下15秒40个循环及60℃下1分钟。KanRcDNA水平用作内部对照且根据KanR的阈值循环数(Ct)对所有反应进行标准化。结果以标准化Ct值表示。cDNA的PCR分析。通过PCR分析经稀释的cDNA和阴性对照样本，以进一步估测由表达质粒产生的mRNA转录本。上文所述的对于前序列结构域、成熟SpeB特异性的PCR引物及由前序列结构域上游引物(5′CCATGGATCAAAACTTTGCTCGTAACG3′)(第14号序列)和成熟蛋白酶下游引物(5′CTCGAGCTAAGGTTTGATGCCTACAACAGC3′)(第15号序列)所组成的第三对引物分别用于扩增前序列结构域、成熟SpeB和全长SpeB酶原(1119bp)及多顺反cDNA(1145-1180bp)。在上文所述的条件下使用各个稀释样本1μL，除了将扩增循环数增加到30，且使用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。SpeB前序列结构域的纯化。以每克细胞15mL缓冲液的比例使细胞在裂解缓冲液(20mMTris，pH7.2，10mMMgCl2，10μg/μLDNase)中重悬且使用M110-Y微射流均质机(Microfluidizer)(Microfluidics，Newton，MA)裂解细胞。离心使细胞碎片沉淀成团，且回收可溶部分且以50mM甘氨酸-HCl(pH3.2)在4℃下透析过夜。透析时伴随E.coli蛋白的大量沉淀。离心去除被沉淀下来的物质，且在以100mM乙酸钠(pH4.5)再次透析之前将回收到的上清液的pH调到4.5。将样本加样到SP-琼脂糖凝胶阳离子交换柱中，且以梯度浓度的100mM乙酸钠(pH4.5)、1M氯化钠洗脱重组前序列结构域蛋白。聚集含前序列结构域蛋白的部分，由SDS-PAGE电泳检测纯度，且以BCA检测法(Smith等人，1985)确定蛋白的浓度。重组表达成熟野生型SpeB的纯化。以每克细胞15mL缓冲液的比例将细胞在裂解缓冲液(20mMTris，pH7.2，10mMMgCl2，10μg/μLDNase)中重悬且使用微液化方法裂解细胞。离心去除细胞碎片，且回收不溶的含成熟野生型SpeB的部分。该细胞团块经三次连续洗涤处理(50mMTris，pH8.0，150mMNaCl，1mMEDTA，2％TritonX-100)，4℃下过夜，室温下1.5小时，及室温下3.5小时，在所有步骤中只能伴有温和的搅动。在室温下搅动过夜，使细胞团块溶于20mMTris(pH8.0)、8M尿素中，且先以乙酸钠将pH调至4.5，然后将其加样至以100mM乙酸钠(pH4.5)、8M尿素平衡的SP-琼脂糖凝胶柱中。以0至750mM浓度梯度的氯化钠洗脱重组成熟野生型SpeB蛋白，由SDS-PAGE电泳分析纯度，且以BCA法确定蛋白浓度。经纯化、变性的蛋白用于体内再折叠实验。共表达成熟SpeB的纯化。由多顺反子或双质粒系统中的任意一种共表达产生的重组成熟野生型SpeB和成熟C192SSpeB，其两者的纯化步骤是相同的。以每克细胞15mL缓冲液的比例将经诱导的细菌细胞团块在裂解缓冲液(20mMTris，pH7.2，10mMMgCl2，10μg/μLDNase)中重悬且以微液化方法使其裂解。离心沉淀细胞碎片，且回收可溶部分并以50mM甘氨酸-HCl(pH3.2)在4℃下透析过夜。透析同时伴随E.coli蛋白的大量沉淀，且将透析液离心澄清，然后快速将pH调至4.5。用10M尿素以1∶1稀释样本，且加样至以100mM乙酸钠(pH4.5)、5M尿素平衡的SP-琼脂糖凝胶柱中。以平衡缓冲液将未结合物从柱中洗掉直至A280nm值达到基线。以100mM乙酸钠(pH4.5)洗涤该柱以去除尿素，且以0至1.0M浓度梯的度氯化钠洗脱重组成熟蛋白酶。以PBS(pH7.4)透析所回收的蛋白，由SDS-PAGE凝胶电泳检测纯度，且以BCA法确定蛋白浓度。多克隆抗血清的产生。使用经纯化的成熟C192SSpeB(由多顺反子或基于双质粒的共表达而产生)来产生抗血清。使用50mgMPL和100μgAlPO4为佐剂，在第0、第4及第6周时以5μg经纯化的蛋白免疫SwissWebster小鼠。在第7周时对小鼠采血。成熟SpeB与前序列结构域的相互作用。使用酶联免疫吸附结合测定法(ELISA)或Biocore3000仪器确定SpeB前序列结构域/成熟SpeB相互作用的解离常数(Kd)。为了进行ELISA分析，将经20μME-64抑制的、浓度不断增加的由胃蛋白酶产生的重组成熟C192SSpeB(Matsuka等人，1999)和重组成熟野生型SpeB在酶标板孔中培育，酶标板孔是经过纯化的前序列结构域或者溶菌酶(阴性对照)包被的。用pH7.4含0.05％Tween20的TBS洗板，且使用经亲合纯化的抗成熟SpeB的多克隆抗体，通过测量405nm处的吸光度来检测结合SpeB。所得到的依赖于浓度的吸收值(A)的增加符合公式ΔA＝Amax+[L]/Kd+[L]，其中Kd为解离常数且[L]为自由配体的浓度。使用Biocore3000(Biocore，Piscataway，NJ)，通过表面等离子共振(surfaceplasmonresonance，SPR)来表明前序列结构域与由胃蛋白酶产生的重组成熟C192SSpeB之间的实时相互作用。根据制造商说明，将经纯化的前序列结构域共价偶合至由经活化的羧甲基葡聚糖包被的生物传感器芯片上。结合实验在25℃下在TBS(pH7.4)，0.05％Tween20中进行。将浓度不断增加的由胃蛋白酶产生的重组成熟C192SSpeB加入到被固定的前序列结构域中，实时监控其交联。使用所述仪器所提供的软件分析交联过程的感应谱(Sensogram)。SpeB前序列结构域抑制活性的评价。在试卤灵(resorufin)标记的酪蛋白底物(0.4％)存在条件下，使用浓度渐增的前序列结构域蛋白或溶菌酶(阴性对照)，将成熟SpeB(0.1μM)在PBS(pH7.4)、10mMDTT中在25℃下培育1小时。培育之后，使用2％三氯乙酸沉淀去除未消化的底物并以分光光度法测量574nm时澄清上清部分中所释放的经试卤灵标记的肽的吸光度。此外，在相同条件下分析密切相关的半胱氨酸蛋白酶(木瓜蛋白酶)作为阴性对照，以便证明前序列结构域/成熟SpeB相互作用的特异性。变性成熟SpeB的体内再折叠。将溶于100mM乙酸钠(pH4.5)、8M尿素中的重组变性成熟SpeB以PBS(pH7.4)或含有0.5M精氨酸的PBS(pH7.4)迅速稀释(1∶20v/v)。如本文所指出的，在存在浓度渐增的经纯化的前序列结构域的条件下进行稀释，稀释时可加或不加20μME-64抑制剂。稀释之后，向每一反应中加入10mMDTT并将样本在4℃下培育24小时。在反应中SpeB的终浓度为5μM。培育后，通过使用试卤灵标记的酪蛋白裂解检测来检测100μL的反应等份试样以评价再折叠SpeB的活性。成熟SpeB的酪蛋白分解活性。为检测酶的蛋白水解活性，按照说明，在0.4％经试卤灵标记的酪蛋白PBS(pH7.4)、10mMDTT存在的条件下，培育指定量的SpeB。使用2％三氯乙酸沉淀去除未消化的底物，离心澄清样本，并以分光光度法确定574nm时上清部分中所释放出的经试卤灵标记的肽的吸光度。成熟SpeB的热诱导变性。通过加热TBS(pH7.4)中的蛋白样本评价重组表达成熟SpeB的熔解，同时使用SLMAB2分光荧光计，在280nm处激发，监控350nm/320nm处的内部荧光强度的比率。实例2SpeB前序列结构域的抑制及分子伴侣活性重组表达的成熟SpeB缺失NH2端前序列结构域，其只会导致在E.coli中产生难溶蛋白(Matsuka等人，1999)。需要前序列结构域以控制可溶成熟SpeB产生，这表明该结构域可能起分子内的分子伴侣的作用以指导蛋白质的正确折叠。为检测此活性，在E.coli中表达并纯化SpeB前序列结构域、40kDaSpeB酶原以及成熟野生型SpeB及成熟C192SSpeB以便确定其特征(数据未给出)。通过ELISA(图1A)的应用及使用Biocore3000(图1B)的表面等离子共振(SPR)方法研究前序列结构域与成熟SpeB蛋白的交联。使用图1中说明的计算参数，前序列结构域与野生型及C192S成熟SpeB的相互作用分别估计为Kd为11nm及34nM。如SPR所确定的，前序列结构域与成熟C192SSpeB相互作用的实时分析，Kd估计为11nM。两种方法所确定的结合值显示前序列结构域与成熟SpeB结构域之间的高亲和力。前序列结构域与成熟SpeB之间的交联导致蛋白酶活性的抑制。这是应用经试卤灵标记的酪蛋白作为底物，使用酪蛋白水解裂解检测加以证实的(图2A)。使用0.1μM成熟SpeB，在0至100μM抑制浓度范围内分析前序列结构域或溶菌酶对照。结果显示前序列结构域在0.3μM(IC50＝0.3μM)浓度时抑制蛋白酶最大活性的一半，但是在相同浓度范围内，作为抑制剂加入溶菌酶却对成熟SpeB的活性无影响。在同样条件下，对密切相关的半胱氨酸蛋白酶(木瓜蛋白酶)的分析显示对木瓜蛋白酶活性无影响(图2B)。这些结果进一步表明SpeB与前序列结构域之间相互作用的特异性，并表明前序列结构域的分子内抑制活性可于原位调节蛋白酶的活性。体外使用经尿素变性的成熟半胱氨酸蛋白酶来证明前序列结构域的分子内分子伴侣活性。在浓度渐增的前序列结构域存在的条件下变性成熟蛋白酶的重新折叠，这证明复性的蛋白酶活性的明显增加，如同由试卤灵标记的酪蛋白底物的裂解所监控到的一样(图3)。在反应中加入不可逆的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(E-64)防止底物裂解，这显示所观察到的酪蛋白水解性裂解是特异地归因于重新折叠的成熟SpeB的活性。这些数据表明SpeB前序列结构域充当分子内的分子伴侣指导成熟SpeB的折叠。另外，这些结果证实这两个区域无需共价结合即可指导正确折叠。实例3基于双质粒的SPEB前序列结构域与成熟SPEB的共表达前序列结构域在体外指导成熟SpeB多肽正确再折叠的能力表明在体内两种蛋白独立的独立共表达可潜在地导致产生正确折叠的成熟SpeB。因此，在这一实例中，研制了一种双粒共表达系统，其中一种质粒(pLP682)编码前序列结构域，而另一种质粒(pLP680或pLP681)编码成熟SpeB多肽(图4)。将pLP680或pLP681任一种单独，或与pLP682共转化E.coli，使用这种经转化的E.coli，利用SDS-PAGE及Western印迹法来研究蛋白的表达。成熟野生型或成熟C192SSpeB构建体任一个的单一表达(数据未给出)导致显著不溶的28kDa成熟SpeB的产生。这表明，在无前序列结构域存在的条件下成熟SpeB的表达导致非正确折叠蛋白的产生。相反，成熟SpeB多肽与前序列结构域一起在体内的共表达导致两种蛋白在细胞可溶部分中相当高水平的产生，显示两种蛋白独立的共表达促进SpeB的正确折叠。利用抗SpeB酶原的多克隆抗体的Western印迹分析允许对前序列结构域及成熟SpeB多肽的同时检测(数据未给出)。印迹(blot)分析证实所表达蛋白的特性并进一步验证依据于SDS-PAGE的结果。这些结果再次证实体外数据显示前序列结构域与成熟SpeB多肽无需共价交联以指导成熟SpeB的正确折叠。实例4基于多顺反子的SPEB前序列结构域与成熟SPEB的共表达如实例3所述，基于双质粒的前序列结构域与成熟SpeB的共表达证明了利用这种方法产生可溶的正确折叠SpeB的有效性。为进行成熟SpeB的大规模生产，研制了一种多顺反子表达系统以用于前序列结构域与成熟SpeB多肽的独立共表达。因此，该系统设计为具有以前序列结构域为第一顺反子，后面接着一个含有一个翻译增强子和优化的Shine-Dalgamo核糖体结合位点的合成接头，该接头在第二顺反子的5′端(Barrick等人，1994；Curry和Tomich，1998；Ringquist等人，1992)(图5)。对第一顺反子翻译终止密码子与第二顺反子Shine-Dalgarno之间长度渐增的合成接头(5nt、10nt、20nt、40nt)进行研究，研究其在这两种蛋白表达水平上的差异。接头区设计为将经转录的RNA中两个顺反子之间的二级结构减至最小，以允许在第二顺反子上的不受限制的核糖体流动和翻译的有效重启。利用分别含有5nt、10nt、20nt及40nt接头的多顺反子成熟C192SSpeB表达构建体pLP683、pLP684、pLP685及pLP686，以及成熟野生型SpeB的20nt多顺反子表达构建体(pLP687)来进行实验。使用pLP685及pLP687多顺反子构建体的蛋白表达分析证实了前序列结构域(12kDa)和成熟SpeB(28kDa)两者的产生(数据未给出)。如双质粒系统所证明的，在E.coli中两种蛋白同时及独立的共表达导致成熟SpeB在细胞的可溶部分中显著产生。来自4个C192S多顺反子构建体每一个的诱导培养物的全细胞裂解物的可溶部分也以SDS-PAGE进行分析(图6)。为对表达水平进行定量，使用显像密度计对凝胶进行分析，并且测量对应于28kDa成熟SpeB或12kDa前序列结构域的每一条带区(图6B)。虽然未观察到由各个构建体所表达的前序列结构域水平上的差异，但是观察到来自含有40nt接头的多顺反子的可溶成熟SpeB表达的明显降低。有趣的是，来自含有119nt接头区的构建体的可溶成熟SpeB的表达证明了其表达水平与含有5nt、10nt及20nt接头顺反子的表达水平堪有一比(数据未给出)。实例5多顺反子mRNA转录分析及转录水平评价从所有多顺反子构建体野生型SpeB酶原、成熟野生型SpeB、成熟C192SSpeB及前序列结构域的诱导培养物中分离总RNA。对经分离的RNA进行Northern印迹分析以检测由含有20nt接头的构建体所产生的转录本大小，以及作为指示的适当的阳性对照(数据未给出)。所得结果证明来自对照的成熟野生型SpeB(约892个碱基)、成熟C192SSpeB(约892个碱基)及前序列结构域(约487个碱基)mRNA转录本全部迁移至预期大小。对来自野生型及含有20nt接头的C192S多顺反子表达系统的mRNA转录本的检测揭示了转录本信号以相同的大小(约1287个碱基)进行迁移，稍微高于野生型SpeB酶原对照的信号(约1246碱基)。如所预料的，这些结果对于每一个全长多顺反子mRNA的产生是一致的。在这些样本中未检测到与见于成熟SpeB及前序列结构域对照中相当的、小一些的转录本，这表明SpeB的表达是直接归因于多顺反子转录本产生而并非是多种mRNA存在的结果。对产生自所有多顺反子种类的全长自然转录本也通过cDNA的PCR分析进行验证。使用来自多顺反子样本及单顺反子对照的总RNA来产生相应的cDNA，并且由PCR分析经稀释的cDNA样本。产生含有除逆转录酶(-RT)以外的所有反应组份的、每一样本的阴性对照以便检测所分离的RNA中潜在质粒DNA的污染。使用前序列结构域(367bp)、成熟SpeB(770bp)及全长前序列/成熟SpeB(1119-1180bp)编码区的特异性引物对检定cDNA样本、-RT阴性对照及pLP685阳性对照(数据未给出)。对前序列结构域的PCR扩增在所有于其表达构建体中含有前序列结构域核苷酸序列的cDNA样本中产生了预期大小的产物。缺失此序列、成熟野生型SpeB及成熟C192SSpeB表达构建体的样本未能产生出扩增产物。对于成熟蛋白酶编码区的扩增，除前序列结构域表达系统以外，所有cDNA样本都产生出阳性条带。对全长前序列/成熟SpeB区的扩增只产生了多顺反子的及SpeB酶原样本的产物，而来自成熟野生型SpeB、成熟C192SSpeB及前序列结构域表达系统的样本证实了产生产物的缺失，正如所预料的一样。所有样本的-RT阴性对照未产生出扩增产物，这表明在cDNA样本中观察到的阳性信号产生是源于mRNA的逆转录，而并非是污染DNA的扩增。对不同表达系统mRNA转录水平的检定取决于对cDNA样本及-RT对照的定量PCR分析。使用前序列及成熟SpeB区域之每一个的特异性引物/探针对比较各培养物之间的转录水平。鉴于在所有表达构建体中存在编码卡那霉素的抗性基因，在分析时使用KanRmRNA作为内标控制表达样本之间质粒拷贝数的潜在差异。结果证明在各构建体诱导过程中产生的mRNA转录本水平相当(图7)。更重要的是，这些数据表明前序列的mRNA水平可比得上成熟SpeB的mRNA水平。这些结果暗示所能观察到的多顺反子构建体之间可溶成熟SpeB量上的明显差异并非是由于转录的提前终止。实例6共表达成熟SpeB的特征鉴定对由基于双质粒的系统和多顺反子系统所产生的纯化成熟SpeB都进行SDS-PAGE分析(数据未给出)，并且所有蛋白都经受热诱导去折叠实验(图8和图9)。在渐增之温度范围内(0-90℃)加热蛋白样本得到熔解(即变性)曲线，同时监控内在荧光比例上的变化。由双质粒以及多顺反子共表达C192S(图8)或野生型成熟SpeB(图9)产生的变性曲线证明了明确界定的跃迁部分的中点与表达为SpeB酶原及经过体外裂解加工(木瓜蛋白酶产生的)或自催化的(野生型SpeB酶原)所对应的曲线跃迁部分的中点相似。这些结果表明由任一共表达系统所产生的重组蛋白以相似于其所对应的经重组表达和加工的酶原折叠的方式进行折叠。所有重组成熟野生型SpeB的内在蛋白酶活性是通过测定其操作摩尔浓度来评价的(图10)。对于每一种，在浓度渐增的不可逆半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64存在的条件下，在加入经试卤灵标记的酪蛋白底物之前，预培育相等浓度的SpeB(0.12μM)。以分光光度法测量经标记的肽的释放并且将结果绘图为抑制剂浓度的函数图。得到的对于双质粒(0.121μM)、多顺反子(0.124μM)及自催化加工(0.124μM)的成熟SpeB多肽数值显示，其在催化方面是无法区别的并且与基于蛋白质浓度的0.12μ.M的预期值是相当的。以前的数据显示所产生的对抗由木瓜蛋白酶体外水解产生的成熟C192SSpeB的抗体能够抑制野生型SpeB的蛋白水解活性(Matsuka等人，1999)。为确定由任一共表达系统所产生的重组蛋白是否能够引发类似活性，使用酪蛋白水解测试对经过由双质粒或者20nt多顺反子系统所产生的成熟C192SSpeB免疫的小鼠的浓度渐增的抗血清进行分析(图11)。结果表明，相对于免疫前的对照，在经过由任一共表达系统所产生的蛋白免疫的动物的浓度渐增的抗血清存在的条件下，底物的水解受到抑制。另外，每一种所证实的抑制程度可比得上以前所报道的对抗成熟C192SSpeB所产生的抗血清，其中成熟C192SSpeB表达为SpeB酶原且使用胃蛋白酶在体外经过处理(Matsuka等人，1999)。参考文献InternationalApplicationNo.EP125,023InternationalApplicationNo.EP171,496InternationalApplicationNo.EP184,187InternationalApplicationNo.EP173,494InternationalApplicationNo.EP264166InternationalApplicationNo.PCT/US86/02269InternationalApplicationNo.WO86/01533InternationalApplicationNo.WO91/17271InternationalApplicationNo.WO92/01047InternationalApplicationNo.WO92/09690InternationalApplicationNo.WO92/15679InternationalApplicationNo.WO92/18619InternationalApplicationNo.WO92/20791InternationalApplicationNo.WO93/01288InternationalApplicationNo.WO00/63364InternationalApplicationNo.WO94/12650InternationalApplicationNo.WO93/13302InternationalApplicationNo.WO92/19265InternationalApplicationNo.WO00/18434InternationalApplicationNo.WO93/13202InternationalApplicationNo.WO96/05858InternationalApplicationNo.WO98/20734InternationalPatentNo.WO98/42375U.S.Patent4,196,265U.S.Patent4,816,567U.S.Patent4,873,316U.S.Patent4,987,071U.S.Patent4,912,094U.S.Patent4,837,151U.S.Patent4,522,811U.S.Patent4,554,101U.S.Patent4,683,202U.S.Patent4,987,071U.S.Patent5,968,502U.S.Patent5,223,409U.S.Patent5,116,742U.S.Patent5,723,127U.S.Patent5,643,576U.S.Patent5,593,972U.S.Patent5,580,859U.S.Patent5,168,062U.S.Patent5,078,996U.S.Patent5,057,540U.S.Patent5,116,742U.S.Patent5,108,744U.S.Patent5,593,972U.S.Patent5,601,831U.S.Patent5,614,382U.S.Patent5,785,973U.S.Patent6,207,646U.S.Patent6,168,918U.S.Patent6,127,170U.S.Patent6,113,918Amannetal.，Gene69301-315，1988.Anonymous，″Consensus″，Pediatr.Infect.Dis.J.，8594-597，1989.Ausubeletal.，1995，CurrentProtocolsinMo1ecularBiology，eds.，JohnWiley&Sons，Inc.，sections2.10and6.3-6.4Baldarietal.，EmboJ.6229-234，1987.Banerjietal.，Cell，33729-740；1983.Baranyetal.，Int.J.PeptideProteinRes.30，705-739，1987.Barricketal.，Nucl.AcidsRes.，221287-1295，1994.Bennett，Haggard，Silva，&Stewart，″Behavioranddevelopmentaleffectsofotitismediawitheffusionintotheteens，″Arch.Dis.Child.，85，91-95，2001.Bo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种多顺反子质粒转化、转导、转染或感染一宿主细胞，该质粒包括(a)一编码SpeB多肽原(pro-peptide)结构域的多聚核苷酸序列及(b)一编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列；以及在允许该宿主细胞表达该成熟SpeB多肽及该SpeB多肽原结构域的条件下培养该宿主细胞，且其中该成熟SpeB多肽可溶在该宿主细胞中。2.如权利要求1所述的方法，其中该SpeB多肽原结构域进一步定义为含有第2号序列中28至145位氨基酸残基的多肽。3.如权利要求1所述的方法，其中该成熟SpeB多肽进一步定义为含有第2号序列中146至398位氨基酸残基的多肽。4.如权利要求1所述的方法，其中该成熟SpeB多肽中的192位氨基酸残基半胱氨酸由丝氨酸取代。5.如权利要求1所述的方法，其中该成熟SpeB多肽在哺乳动物宿主中具有免疫原性。6.如权利要求1所述的方法，其中该成熟SpeB多肽的特异性抗体与野生型SpeB多肽交叉反应且抵消SpeB多肽的活性。7.如权利要求1所述的方法，其中该质粒是含有T7启动子的质粒。8.如权利要求7所述的方法，其中该质粒选自下列各物组成之群pET、pRSET、pCRT7-CTTOPO和pIVeX。9.如权利要求1所述的方法，其中该宿主细胞是细菌细胞。10.如权利要求9所述的方法，其中该宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。11.如权利要求10所述的方法，其中该E.coli为选自下列各物组成之群的菌株BLR(DE3)、BLR(DE3)pLysS、AD494(DE3)、AD494(DE3)pLysS、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、BL21(DE3)pLacl、BL21trxB(DE3)、BL21trxB(DE3)pLysS、HMS174(DE3)、HMS174(DE3)pLysS、HMS174(DE3)pLysE、Origami(DE3)、Origami(DE3)pLysS、Origami(DE3)pLysE、Origami(DE3)pLacl、OrigamiB(DE3)、OrigamiB(DE3)pLysS、OrigamiB(DE3)pLysE、OrigamiB(DE3)pLacl、Rosetta(DE3)、Rosetta(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)pLysE、Rosetta(DE3)pLacl、Tuner(DE3)、Tuner(DE3)pLysS和Tuner(DE3)pLacl。12.一种在宿主细胞中重组表达成熟SpeB多肽的方法，该方法包括(a)以(i)一种包括编码SpeB多肽原结构域的多聚核苷酸序列的质粒和(ii)一种包括编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列的质粒转化、转导、转染或感染宿主细胞；及(b)在适于共表达该SpeB多肽原结构域及该成熟SpeB多肽的条件下培养该宿主细胞，其中该成熟SpeB多肽可溶在该宿主细胞中。13.如权利要求12所述的方法，其中该SpeB多肽原结构域进一步定义为包括第2号序列中28至145位氨基酸残基的多肽。14.如权利要求12所述的方法，其中该成熟SpeB多肽进一步定义为包括第2号序列中146至398位氨基酸残基的多肽。15.如权利要求12所述的方法，其中该成熟SpeB多肽中的192位氨基酸残基半胱氨酸由丝氨酸取代。16.如权利要求12所述的方法，其中该成熟SpeB多肽在哺乳动物宿主具有免疫原性。17.如权利要求12所述的方法，其中该成熟SpeB多肽的特异性抗体与野生型SpeB多肽交叉反应且抵消SpeB多肽的活性。18.如权利要求12所述的方法，其中该质粒是含有T7启动子的质粒。19.如权利要求18所述的方法，其中该质粒选自下列各物组成之群pET、pRSET、pCRT7-CTTOPO和pIVeX。20.如权利要求12所述的方法，其中该宿主细胞是细菌细胞。21.如权利要求20所述的方法，其中该宿主细胞是E.coli。22.如权利要求21所述的方法，其中该E.coli为选自下列各物组成之群组的菌株BLR(DE3)、BLR(DE3)plysS、AD494(DE3)、AD494(DE3)pLysS、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE、BL21(DE3)pLacl、BL21trxB(DE3)、BL21trxB(DE3)plysS、HMS174(DE3)、HMS174(DE3)pLysS、HMS174(DE3)plysE、Origami(DE3)、Origami(DE3)pLysS、Origami(DE3)pLysE、Origami(DE3)pLacl、OrigamiB(DE3)、OrigamiB(DE3)pLysS、OrigamiB(DE3)pLysE、OrigamiB(DE3)pLacl、Rosetta(DE3)、Rosetta(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)pLysE、Rosetta(DE3)pLacl、Tuner(DE3)、Tuner(DE3)pLysS和Tuner(DE3)pLacl。23.一种用于产生成熟SpeB多肽的方法，其包括以下步骤(a)在一种宿主细胞中重组表达一包括编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列的质粒，其中该SpeB多肽在该宿主细胞中形成一不可溶的多肽聚集体；(b)使该多肽聚集体溶解，其中该被溶解的多肽定义为非天然(non-native)成熟SpeB多肽；(c)在一种或一种以上伴侣蛋白质存在条件下再折叠该变性成熟SpeB多肽，其中该变性成熟SpeB多肽被折叠为天然(native)成熟SpeB多肽；及(d)回收该天然的成熟SpeB多肽。24.如权利要求23所述的方法，其中该一种或一种以上的伴侣蛋白质选自下列各物组成之群GroEL、GroEL/GroES、肽酰-脯氨酰异构酶(PPI)、肽二硫键异构酶(PDI)和SpeB多肽原结构域。25.如权利要求23所述的方法，其中该伴侣蛋白质是包括第2号序列中28至145位氨基酸残基的SpeB多肽原结构域。26.如权利要求23所述的方法，其中该成熟SpeB是包括第2号序列中146至398位氨基酸残基的多肽。27.如权利要求26所述的方法，其中该成熟SpeB多肽中的192位氨基酸残基半胱氨酸由丝氨酸替代。28.如权利要求23所述的方法，其中该不可溶的多肽聚集体进一步定义为包涵体。29.如权利要求23所述的方法，其中使该多肽溶解的是选自下列各物组成之群的非天然剂尿素、盐酸胍和热力。30.一种在宿主细胞中重组表达成熟SpeB多肽的方法，其包括在宿主细胞中表达包括(i)编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列和(ii)编码GroEL多肽的多聚核苷酸序列的多顺反子质粒，其中该成熟SpeB多肽可溶在该宿主细胞中。31.如权利要求30所述的方法，其中该成熟SpeB多肽中的192位氨基酸残基半胱氨酸由丝氨酸替代。32.如权利要求30所述的方法，其中该质粒进一步包括编码GroES多肽的多聚核苷酸。33.一种用于产生成熟SpeB多肽的方法，其包括以下步骤(a)以包括(i)编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列和(ii)编码GroEL多肽的多聚核苷酸序列的多顺反子质粒转化、转导、转染或感染宿主细胞；(b)在适于表达该成熟SpeB多肽和该GroEL多肽的条件下培养该宿主细胞，其中该成熟SpeB多肽可溶在该宿主细胞中；及(c)回收该天然成熟SpeB多肽。34.如权利要求33所述的方法，其中该成熟SpeB多肽中的192位氨基酸残基半胱氨酸由丝氨酸替代。35.一种根据权利要求1所述的方法产生的成熟SpeB多肽。36.一种根据权利要求12所述的方法产生的成熟SpeB多肽。37.一种根据权利要求23所述的方法产生的成熟SpeB多肽。38.一种根据权利要求30所述的方法产生的成熟SpeB多肽。39.一种根据权利要求33所述的方法产生的成熟SpeB多肽。40.一种包括如权利要求35所述的SpeB多肽的免疫原性复合物。41.一种包括如权利要求36所述的SpeB多肽的免疫原性复合物。42.一种包括如权利要求37所述的SpeB多肽的免疫原性复合物。43.一种包括如权利要求38所述的SpeB多肽的免疫原性复合物。44.一种包括如权利要求39所述的SpeB多肽的免疫原性复合物。45.一种免疫哺乳动物个体以使其抗化脓性链球菌的方法，其包括对该个体投药免疫剂量的如权利要求40所述的复合物。46.一种免疫哺乳动物个体以使其抗化脓性链球菌的方法，其包括给该个体投与免疫剂量的如权利要求41所述的复合物。47.一种免疫哺乳动物个体以使其抗化脓性链球菌的方法，其包括给该个体投与免疫剂量的如权利要求42所述的复合物。48.一种免疫哺乳动物个体以使其抗化脓性链球菌的方法，其包括给该个体投与免疫剂量的如权利要求43所述的复合物。49.一种免疫哺乳动物个体以使其抗化脓性链球菌的方法，其包括给该个体投与免疫剂量的如权利要求44所述的复合物。50.一种多顺反子质粒，其包括(a)编码SpeB多肽原结构域的多聚核苷酸序列和(b)编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列，其中该成熟SpeB多肽在宿主细胞中表达时是可溶的。51.如权利要求50所述的质粒，其中该成熟SpeB多肽中的192位氨基酸残基半胱氨酸由丝氨酸替代。52.如权利要求50所述的质粒，其中该质粒是含有T7启动子的质粒。53.一种包括编码SpeB多肽原结构域的多聚核苷酸序列的质粒和一种含有编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列的质粒，其中该成熟SpeB多肽在宿主细胞中表达时是可溶的。54.如权利要求53所述的质粒，其中该成熟SpeB多肽中的192位氨基酸残基半胱氨酸由丝氨酸替代。55.如权利要求53所述的质粒，其中该质粒是含有T7启动子的质粒。56.一种多顺反子质粒，其包括(a)编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列及(b)编码GroEL多肽的多聚核苷酸序列，其中该成熟SpeB多肽在宿主细胞中表达时是可溶的。57.如权利要求56所述的质粒，其中该成熟SpeB多肽中的192位氨基酸残基半胱氨酸由丝氨酸替代。58.如权利要求56所述的质粒，其中该质粒是含有T7启动子的质粒。59.一种多顺反子质粒，其包括(a)编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列、(b)编码GroEL多肽的多聚核苷酸序列和(c)编码GroES多肽的多聚核苷酸序列，其中该成熟SpeB多肽在宿主细胞中表达时是可溶的。60.如权利要求59所述的质粒，其中该成熟SpeB多肽中的192位氨基酸残基半胱氨酸由丝氨酸替代。61.如权利要求59所述的质粒，其中该质粒是含有T7启动子的质粒。62.一种多顺反子质粒，其包括(a)编码成熟SpeB多肽的多聚核苷酸序列和(b)编码选自下列各物组成之群的一种或一种以上多肽的多聚核苷酸序列GroEL、GroES、SpeB多肽原结构域、PDI和PPI，其中该成熟SpeB多肽在宿主细胞中表达时是可溶的。63.如权利要求62所述的质粒，其中该成熟SpeB多肽中的192位氨基酸残基半胱氨酸由丝氨酸替代。64.如权利要求62所述的质粒，其中该质粒是含有T7启动子的质粒。65.一种以权利要求50所述的质粒转化、转导、转染或感染的宿主细胞。66.一种以权利要求53所述的质粒转化、转导、转染或感染的宿主细胞。67.一种以权利要求56所述的质粒转化、转导、转染或感染的宿主细胞。68.一种以权利要求59所述的质粒转化、转导、转染或感染的宿主细胞。69.一种以权利要求62所述的质粒转化、转导、转染或感染的宿主细胞。70.如权利要求24所述的方法，其中该PPI是化脓性链球菌RopAPPI。71.如权利要求62所述的质粒，其中该PPI是化脓性链球菌RopAPPI。全文摘要本发明大体上是关于分子生物学、临床细菌学和蛋白质折叠的领域。更明确的说，本发明是关于一种在宿主细胞中重组表达可溶成熟化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)外毒素B(SpeB)多肽的方法。文档编号A61K39/00GK1820023SQ200480019503公开日2006年8月16日申请日期2004年7月7日优先权日2003年7月10日发明者洛里·安妮·温特,于里·弗拉基米罗维奇·马茨卡,伊丽沙白·特雷米·安德森,斯蒂芬·布鲁斯·奥姆斯特德申请人:惠氏控股公司