专利名称：siRNA表达系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及其于U1 snRNA基因调控区的重组siRNA载体。
RNA干扰是在进化过程中高度保守的序列特异的转录后基因沉默过程。序列特异的信使RNA降解的中介物是21-23个核苷酸的小分子干扰RNAs(siRNAs)，其是由核糖核酸酶III从较长的dsRNAs切割产生的。该过程最初在秀丽线虫(C.elegans)中有描述(Fire等，1998)，随后报导于昆虫、植物和真菌中，最近通过使用短双链RNAs再现于哺乳动物细胞中(21-23个碱基对；Elbashir等，2001)。由于这种分子的效率非常高，siRNA双螺旋可以用于人类和非人类细胞中的靶向基因失活，并且用于病毒性或遗传性疾病的治疗剂开发。
目前，已有数个小组报导了设计用于将siRNAs通过寡核苷酸转染导入哺乳动物细胞的系统(Elbashir等，2001；McManus and Sharp，2002)。鉴于使用人造siRNAs的主要缺陷在于需要周期性给药，显然有需要产生编码siRNAs的质粒以获得长期的效果。
迄今为止，所有的siRNA载体均依靠pol III依赖型启动子，例如U6 snRNA(Lee等，2002；Paul等，2002)或H1-RNA(Brummelkamp等，2002)基因以及近期的tRNA表达盒(Kawasaki and Taira，2003)，专利申请WO03/0006477。本发明的发明人已开发了一种基于U1 snRNA基因的pol II依赖型调控区的新质粒载体。该U1启动子在所有的细胞类型中具有活性并且诱导高水平转录物的积聚。此外，存在负责U1 snRNA的正确3’端形成的3’元件，保证了有效和准确的转录物3’端形成。
本发明的构建体具有以下优点i)它们对5’和3’端形成没有或仅有很小的序列需求；ii)前-siRNA快速地输出到细胞质中，在其中有效转变成成熟形式；iii)通过双链寡核苷酸的方式易于进行克隆，如此避免了经常会产生异常产物的PCR扩增步骤；iv)U1 snRNA基因具有强pol II启动子，其在稳定的细胞克隆中不会经受沉默。此外，本发明人已经鉴定了使得可以选择单一siRNA链作为干扰的应答中介物的特定元件。
将针对核纤层蛋白A/C mRNA的发夹序列插入到这些调控区域之间，并且产生了正确大小的双链siRNA在体内的有效积聚。对提取自用siRNA表达质粒转染的HeLa细胞的蛋白质进行Western印迹分析显示作为本发明目的的这些载体能够非常有效地抑制核纤层蛋白A/C蛋白质的表达。也已经鉴定了决定两个双链siRNA之一的不对称释放的序列。
因此，本发明的目的在于可使siRNA或miRNA在哺乳动物细胞中正确、稳定和有效表达的重组载体，其从5’到3’包括a)来源于U1 snRNA基因的聚合酶II RNA依赖型启动子序列；b)用于克隆转录前-siRNA或前-miRNA的序列的合适的限制性位点；c)转录前-siRNA的序列，其包括在位置+1的A或G残基；对应于由将被沉默的基因转录的mRNA有义区域的21到23个核苷酸的序列，其构成前-siRNA茎干的第一个部分；从前-miRNA序列选择的序列，其组成前-siRNA的环状区域；对应于由将被沉默的基因转录的mRNA反义区域的21到23个核苷酸的序列，其构成前-siRNA茎干的第二个部分；两个终末残基UU，其突出的方式使得得到下列结构 或备选地转录前-miRNA的序列；d)来源于U1 snRNA基因3’端序列的终止序列，其对于分别正确形成前-siRNA或前-miRNA的3’端是必须且足够的。
优选地，转录前-siRNA的序列5’端的克隆位点为Bgl II。
优选地，转录前-siRNA的序列进一步在5’末端和3’末端包括使得转录的前-siRNA具有下述结构的序列 其中N为A、U、G或C，以及N’为其互补核苷酸。
更优选地，转录前-siRNA的序列进一步在5’末端和3’末端包括使得转录的前-siRNA具有下述结构的序列
本发明的载体虽然比基于pol III的载体产生较低水平的siRNAs，但其可以方便有利地应用。事实上，这些水平足以介导RNA干扰应答，且没有因高转录物水平导致的非特异性靶向而产生的副作用。因此当由上述较低水平的siRNA获得同样的应答时，治疗应用更加安全。
U1 snRNA基因启动子由作为转录增强子的远侧序列元件(DSE)和决定转录起始位置的近侧序列元件(PSE)组成。PSE与+1核苷酸之间的距离是严格保守的，虽然其初级序列(primary sequence)并不保守。该启动子结构有助于修饰和转化其为诱导型启动子。
最近几年，已经估计1％的人类基因编码一组20-25个核苷酸长的非编码微RNA(microRNAs)(miRNAs)，其在植物和动物物种的基因表达调控中起重要作用(Bartel，2004)。它们的结构和生物合成与siRNAs几乎相同，虽然它们转录为更长的前体。本发明的载体也可以有效用于产生微RNA(microRNAs)。
用于人类基因治疗的siRNA表达系统使用载体在体内表达siRNAs作为针对所选疾病模型产生RNAi应答的治疗工具而具有强有力的应用。
RNAi途径可以用于击倒(knocking down)基因表达，从而1)下调有害基因表达2)重新激活细胞防御，以及3)抑制病毒基因表达。
这使得能够对许多急性和顽固持久性疾病，包括癌症和其它遗传机能障碍，以及严重感染进行治疗。
针对所选的靶RNAs制备的构建体的效果可以如下进行分析1)在转染的细胞或在已建立的细胞系中。
2)在从特殊遗传疾病的患者建立的原代细胞和/或动物模型中。
动物模型有助于在开始人体临床试验前，检验siRNA载体的优化特异性、效力、稳定性和递送能力。
本发明下面将根据给出的实施例并参考下述附图进行描述
图1.表示psiUX载体的概略图；标示了位于U1 snRNA启动子下游的多接头(polylinker)中的位点。下面显示了从第-393位到第-6位(相对于起始位点)延伸的U1启动子区域的序列。
图2.图A)不同psiUx衍生物和相关寡核苷酸的序列。指示了转录物的5’端和3’端。从核纤层蛋白A/C mRNA推断出有义和反义序列，并且用会聚的箭头表示。在psiUcmut-lam构建体中引入的突变标示于序列上。U1基因的3’终止序列标示为“3’框”。位于psiUb-lam和psiUd-lam构建体中的内环和变异序列用灰色显示。图B)四种测试的抗核纤层蛋白初级转录物的预测结构。箭头标示推测的Dicer酶加工位点。siRNA序列用加粗斜体显示。加下划线的核苷酸表示来源于U1 snRNA的5’和3’区的序列。星号表示单甲基帽(monomethylcap)。
图3.由psiUx-lam构建体转录的siRNAs的表达和活性分析。用6μg不同的psiU-lam构建体(psiU泳道)或6μg的U6-lam(U6泳道)转染HeLa细胞。在所有的例子中用2μg的对照U7构建体进行共转染。48小时后，提取总RNA，取15μg在10％聚丙烯酰胺-尿素凝胶上进行Northern印迹分析。图A和A’)与识别反义链(左向箭头)的a和amut探针杂交。图A”)与特异于U7 snRNA的探针进行杂交。方括号表示前体产物的位置。pBR322/Mspl分子大小标记的迁移显示于左边。泳道NT含有从非转染细胞中提取的RNA。图B)与识别有义链(右向箭头)的α探针杂交。图c)转染后70个小时从与先前实验相同的细胞中提取的20μg总细胞蛋白质用抗核纤层蛋白单克隆抗体进行Western印迹分析。箭头指向核纤层蛋白的两个同种型(A和C)。图下方显示滤膜的丽春红染色。
图4.分析psiUa-lam、psiUb-lam和U6-lam转录物在非洲爪蟾(Xenopuslaevis)卵母细胞中的表达。将2.76ng的质粒DNA显微注射到非洲爪蟾卵母细胞的细胞核中。培养12个小时后，从细胞核(N)和细胞质(C)中提取RNA并且在10％聚丙烯酰胺-尿素凝胶上进行Northern印迹分析。箭头表示初级转录物。方括号标示环内切割的产物(见旁边的图解)。
材料和方法构建psiUx载体。基于U1 snRNA基因的载体来源于含有整个人类基因的质粒pHU1-ID(De Angelis等，2002)；该质粒携带600bp的BamHI片段，其含有以与SP6启动子反方向插入到pSP65载体(Promega)BamHI位点的人U1snRNA基因的转录单元。质粒psiUx来源于后者，其通过用BglII和NheI双消化和在存在含有5’-BglII、KpnI、XhoI、NheI、BamHI和NheI-3’位点的多接头(polylinker)的条件下进行重新连接而得到。U1 snRNA基因中的BglII位点作图在相对于转录起始位点第-6位，而NheI位点在载体中SP6启动子上游300个核苷酸。通过使两条寡核苷酸退火制备接头接头上游(linkup)5’-GATCTGGTACCCTCGAGGCTAGCGGATCCG-3’接头下游(linkdn)5’-CTAGCGGATCCGCTAGCCTCGAGGGTACCA-3’表达核纤层蛋白A/C蛋白的siRNAs的psiU衍生物的构建。
核纤层蛋白A/C上所选的靶序列来源于Sui等(2002)并且覆盖了NCBI数据库中X03444第1602-1622位的核苷酸。使下列寡核苷酸a-lamUP5’GATCTCATACAGGGCAATTGGCAGATCAAGCGTTGTGAAGCCACAGATGAACGCTTGATCTGCCAATTGCCCTTTATCCCCTGACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGAC 3’和a-lamDN5’TCGAGTCTACTTTTGAAACTCCAGAAAGTCAGGGGATAAAGGGCAATTGGCAGATCAAGCGTTCATCTGTGGCTTCACAACGCTTGATCTGCCAATTGCCCTGTATGA 3’退火，并插入到psiUx的BglII和XhoI位点，生成质粒psiUa-lam。通过在psiUx的BglII和Xhol位点克隆下列寡核苷酸获得质粒psiUb-lam和psiUc-lampsiUb-lamb-lamUP5’GATCTCATACAGGGCAATTGGCAGATCAAGCGTTTGTGTAGCGCTTGATCTGCCAATTGCCCTTTATCCCCTGACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGAC 3’和b-lamDN5’TCGAGTCTACTTTTGAAACTCCAGAAAGTCAGGGGATAAAGGGCAATTGGCAGATCAAGCGCTACACAAACGCTTGATCTGCCAATTGCCCTGTATGA 3’psiUc-lamc-lamUP
5’GATCTCGGGCAATTGGCAGATCAAGCGTTTGTGTAGCGCTTGATCTGCCAATTGCCCTTACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGAC 3’和c-lamDN5’CTGAGTCTACTTTTGAAACTCCAGAAAGTAAGGGCAATTGGCAGATCAAGCGCTACACAAACGCTTGATCTGCCAATTGCCCGA 3’psiUd-lamd-lamUP5’GATCTCGGGCAATTGGCAGATCAAGCGTTTGACTTCGCATGAATGAGTTCATTCATGAAGCGAAACGCTTGATCTGCCAATTGCCCTTACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGAG 3’和d-lamDN5’CTAGCTCTACTTTTGAAACTCCAGAAAGTAAGGGCAATTGGCAGATCAAGCGTTTCGCTTCATGAATGAACTCATTCATGCGAAGTCAAACGCTTGATCTGCCAATTGCCCGA3’。
通过克隆下列寡核苷酸获得质粒psiUcmut-lamcmut-lamUP5’GATCTCGGGCAATTGcgAGATCAAGCGTTTGTGTAGCGCTTGATCTcgCAATTGCCCTTACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGAC 3’和cmut-lamDN5’CTGAGTCTACTTTTGAAACTCCAGAAAGTAAGGGCAATTGcgAGATCAAGCGCTACACAAACGCTTGATCTcgCAATTGCCCGA 3’(小写字母表示相对于核纤层蛋白序列突变的核苷酸)。
细胞培养和转染。根据厂商的说明使用脂质转染胺(Lipofectamine)2000(Life Technologies，Gibco BRL)在60mm平皿中转染亚融合的HeLa细胞。将6μg的psiUx质粒衍生物与作为转染内对照的2μg质粒U7-3’(DeAngelis等，2002)进行共同转染。
非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞显微注射。根据Caffarelli等(1987)，将9.2nl的质粒DNA(300ng/μl)注射到IV阶段非洲爪蟾卵母细胞的细胞核中。根据记载(Caffarelli等，1987)，在19℃培养12个小时后，手工分开细胞核和细胞质，并提取RNA。
Northern印迹。根据厂商的说明使用Ultraspec RNA分离系统(BiotechLaboratories，Houston)从瞬时转染的HeLa细胞中分离总RNA。为检测siRNA，使15μg的总RNA在10％的聚丙烯酰胺-8M尿素凝胶中电泳，并通过电印迹转移到Hybond-N+膜上(Amersham Pharmacia Biotech.)。于37℃在5×SSPE、5×Denhardt’s溶液、0，5％SDS、25μg/ml鲑精DNA(Invitrogen)中进行杂交。于37℃在6×SSPE和2×SSPE以及0.2×SSPE中进行洗涤。使用的探针为末端32P-放射性标记的DNA寡核苷酸探针a5’-GGCAATTGGCAGATCAAGCG-3’；探针a-mut5’-GGCAATTGcgAGATCAAGCG-3’；α探针5’-CGCTTGATCTGCCAATTGCC-3’。
用探针U7a(DeAngelis等，2002)检测U7-3’转录物。
免疫印迹。在10％的聚丙烯酰胺-SDS凝胶中分离蛋白提取物(20μg)，并转移到硝化纤维膜上(ProTran，Schleicher and Schuell)。膜用含3％脱脂奶的TBS封闭。小鼠单克隆抗核纤层蛋白A/C抗体(sc-7292，Santa CruzBiotechnology)在TBS/3％脱脂奶中1∶200稀释，用作初级抗体。使用ECLWestern印迹检测系统(Amersham UK)进行免疫染色。
结果系统利用人U1 snRNA及其启动子和终止区(Hernandez，1985，Hernandezand Weiner，1986)的特性。U1启动子调控RNA聚合酶II转录，普遍有活性，并保证了高水平的表达。初级转录物具有单甲基化帽(monomethylated cap)，并且RNA高效输出到细胞质中。这对于有效加工前-siRNA是非常重要的，因为已经显示Dicer酶定位于细胞质中(Billy等，2001)。此外，U1 snRNA的正确3’端形成是由位于U1 snRNA编码区下游10个核苷酸处的框元件(GTTTCAAAAGTAGAC-3’框)指导的，其仅与特定的U1启动子序列协同作用(Hernandez and Weiner 1986；de Vegvar等，1986)。已经发现类似的序列还可指导U2 snRNA的正确3’端形成(Hernandez，1985)。在这方面已表明这些snRNAs必须通过不同于合成mRNAs的特殊转录机制进行转录。最近Medlin等人的工作(2003)显示如果缺失pol II的CTD，将不会出现正确的终止，这表明3’端形成所需要的因子在转录过程中非常早就被恢复补充。含有U1 snRNA基因启动子的区域从相对于起始位点位于第-400位的BamHI位点延伸到第-6位的BglII位点，通过使用合成的多接头(polylinker)将其克隆到pSP65质粒的BamHI/Nhel位点(图1A)。获得的构建体(psiUx)具有强启动子但缺乏转录起始位点和终止子。根据我们的设计，将通过插入的合成双链片段，以及siRNA目标序列而提供这些序列。起始序列为5’-GATCTC’A-3’，其中最后的残基对应于U1 snRNA的+1位核苷酸(在该位置G也可以接受)。终止元件为5’-CCCCTG’ACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGAC-3’，其中加下划线序列为所谓的3’框，位于转录物3’端下游10个核苷酸处。CCCCTG序列对应于U1 snRNA最后6个转录的核苷酸，其显示有助于高效和位点特异的3’端形成(Hernandez，1985)。可以通过插入具有与质粒的选择位点相适应的末端的扩增片段或退火的合成寡核苷酸而容易地将siRNA前体序列克隆到psiUx中。5’BglII末端是必须的，因其是为重建起始位点所需要的，任何包含在多接头(polylinker)中的位点(Kpnl、Xhol、Nhel和BamHl)都能够用于3’端(图1)。
对于测试我们载体效率的目标序列，我们选择了证实对siRNAs敏感(Sui等，2002)的核纤层蛋白A/C mRNA中的位点。将发夹结构(来源于核纤层蛋白A/C mRNA的21个核苷酸的有义和反义序列)以不同的方式克隆从而确定对有效的siRNA表达最适当的(psiU-lam构建体)。获得的构建体的差别不仅在于插入环序列的类型，还在于转录区域的5’和3’端。不同插入片段的序列显示于图2A中，初级转录物的结构图解表示于图B中。在psiUa-lam、psiUb-lam和psiUc-lam中使用的环是从微前-RNAs导出的(Zeng等，2002和Castanotto等，2002)，而在psiUd-lam中的是从酵母Rht1P核酸内切酶-一种RNaseIII样酶-的标准底物导出的(Chanfreau等，1998)。此外，构建体psiUa-lam和psiUb-lam含有的末端区域包括3个核苷酸的茎干，其对应于U1转录物5’和3’端的保守核苷酸。为了防止Dicer酶切割该区域，插入了两个不匹配的碱基。这些延伸部分在psiUc-lam和psiUd-lam中不存在。在这些构建体中，为了匹配核纤层蛋白靶序列，转录物的5’端包括一个G，并且保守的3’区域由CCCCTG转变为CCCTT。
通过在psiUc-lam中核纤层蛋白mRNA配对区域中心部分引入两处两个核苷酸的错配得到对照构建体(psiUcmut-lam)。由该构建体产生的这个siRNA将不能够介导干扰应答。
为了比较这些载体系统与以前应用的其它系统的活性，U6载体(质粒U6-lam)中的抗核纤层蛋白A/C发夹序列如Sui等(2002)所述的进行克隆。通过转染HeLa细胞测试不同构建体的表达和活性。作为内对照，共转染经修饰的U7 snRNA基因(DeAngelis等，2002)。在48小时，提取RNA并用Northern印迹进行分析。
图3中图A和A’显示用特异于有义反义链的探针(探针a)进行的杂交。所有U1衍生的构建体均产生了21到23个核苷酸的反义链的积聚。由于这些RNAs积聚于体内超过了延长时间，表明它们以稳定的复合物存在。在其它情况中将类似的发现解释为对与干扰竞争复合体关联的诊断。21-23个核苷酸大小的同样类型的分子，在U6衍生的构建体的情况下随时间积聚(泳道U6)。在根据共转染的U7 snRNA的杂交信号标准化后(图A”)，U6和U1衍生的siRNAs水平之间的比较显示psiU-lam构建体的转录水平略低于U6-lam。然而，如图3C中所示，它们介导了同样水平的RNA干扰应答。来源于psiUCmut-lam的siRNA仅在使用amut探针的时候可见，其与该突变完全互补(图3A’)。
用反义探针(探针α，图B)进行的杂交显示了一个有趣的特征即使将该凝胶长时间曝光，psiUa-lam和psiUb-lam构建体也显示没有有义链的积聚(图2B中的上方链)。相反，所有的其它构建体都显示产生了有义链，即使其水平低于反义链的水平(在图A和B中前体与成熟体杂交信号进行比较)。这些结果表明psiUa-lam和psiUb-lam构建体的末端区域(图2B)，而不是内环，是赋予对干扰复合物中包括的链的非对称选择的元件。psiU(图3A)和其它独立产生的构建体的表达分析表明可能可以除去U1 snRNA 3’端的大部分保守核苷酸，但仍然获得有效的终止和加工。因此，克隆到psiUx载体中没有序列约束，除了在第+1位存在A或G。
polIII和polII siRNA载体之间的有趣差别在于，在U1驱动的转录物中仅能检测到少量的前体(表示为前-siRNA)。相反，在U6载体的情况下，有大量的这种物质(图3A)。
对于这种差异的可能解释是U6驱动的转录物不能有效地输出到细胞质中。为了验证该假设，将U6-lam和psiUa-lam以及psiUb-lam质粒显微注射到非洲爪蟾卵母细胞的细胞核中，培养12个小时后，从细胞核和细胞质区室提取RNA。图4显示大部分U6驱动的转录物仍然留在细胞核中，而那里没有发现U1驱动的产物的痕迹。在两种情况中，只发现对前体分子预期大小的RNA转录物(前-siRNA)，以及如果在环区域内的任意位置发生了断裂而预期大小的更短的RNA产物。在非洲爪蟾系统中，只有在长时间过度曝光后可显示很少量的21-23个核苷酸长的产物，表明Dicer样活性，如果存在，其量非常低。这些数据显示在U1启动子作用下产生的前-siRNAs可以有效地输出到细胞质中。
用于分析siRNA产物的相同细胞也用于检测RNAi的活性。通过抗核纤层蛋白A/C抗体的Western印迹分析从U1和U6衍生的构建体瞬时转染的细胞中提取的20微克总蛋白。如图3B所示，如果我们考虑到转染的效率在80-85％的数量级(未显示)，那么所有的siRNA载体均产生良好水平的干扰。核纤层蛋白的消耗水平在所有的U1构建体中是相似的且类似于U6衍生的表达盒。
通过将在21个核苷酸长的配对区域的中心部分含有两处错配的构建体(psiUcmut-lam)转染HeLa细胞检测干扰应答的特异性。尽管该构建体获得的siRNAs的积聚水平类似于从亲代构建体所获得的(图3A’)，核纤层蛋白积聚水平(图3B，泳道mut)类似于对照(泳道NT)表明它们不介导干扰。
总而言之，这些数据表明基于U1的载体与其它的siRNA载体相比具有几个有趣的特性i)它们在转录物的5’和3’末端的序列需求很小；ii)它们在转录区域接受U序列，这与pol III载体不同；iii)克隆很容易并且可以选择不同的克隆位点；iv)初级转录物能够有效地输出到细胞质并转变为成熟形式。此外，可以将特殊序列插入到5’和3’末端，如此可以选择必须整合到干扰复合物中的单siRNA链。这对于siRNA载体是重要的特性，因为它消除了有义链的积聚，其会导致不希望出现的靶向。
基于U1的可诱导表达载体U1 snRNA基因启动子由作为转录增强子的远侧序列元件(Distal SequenceElement)(DSE)和决定转录起始位置的近侧序列元件(Pfoximal SequenceElement)(PSE)组成。PSE和第+1位核苷酸之间的距离是严格保守的，虽然其初级序列不保守。该启动子结构有助于修饰和转化其为诱导型启动子。
一个例子的代表是Cre-loxP策略(Hoess，R.H.，A.Wierzbicki，andK.Abremski，1986；Sauer，B.and N.Benderson，1988)。长填充DNA(含有选择标记的信息，即嘌呤霉素、新霉素或其它)侧面与噬菌体P1的2个loxP位点连接，可将其插入到PSE和+1位置之间。这种插入阻止了siRNA的转录。通过添加Cre重组酶，两个LoxP位点发生重组，导致填充DNA和其中一个loxP位点被除去。只要PSE和第+1位核苷酸之间的距离维持不变，一个loxP位点的存在不会干扰启动子活性，而发生前-siRNA的转录。
微RNAs(microRNAs)的表达miRNA的功能与许多复杂的细胞回路有关，例如蝇虫中细胞增殖、细胞死亡和脂肪代谢的调控，线虫中的神经元模式，哺乳动物中的造血系分化的调节，以及植物中叶和花发育的调控。最近，又提出了微RNAs(microRNAs)在肿瘤形成中的作用。主要来自蠕虫和蝇虫的研究表明微RNAs(microRNAs)在细胞中通过RNAi途径进行加工和赋予功能，并且通过与mRNA的3’非翻译区域的碱基配对，导致其表达的明显降低。
本工作中描述的基于U1的载体也可用于产生高水平的miRNAs。为了优化miRNA表达，可以遵循下述两种不同的策略1)pri-miRNA序列(该序列包括具有明确的二级结构的大约80-110个核苷酸的区域，并且能够从基因组数据中导出(Griffiths-Jones等，2003)被克隆到psiUx载体的启动子和终止区之间；2)miRNA序列被克隆到psiU中作为反义siRNA序列。
总而言之，这些数据表明基于U1的载体与其它的siRNA载体相比具有几介有趣的特性i)它们在转录物5’和3’末端的序列需求很小；ii)它们在转录区域接受U序列，这与pol III载体不同；iii)克隆很容易并且可以选择不同的克隆位点；iv)初级转录物能够有效地输出到细胞质并转变为成熟形式；v)可以将特殊序列添加到5’和3’末端，这使得可以选择两条siRNA链中只有一条整合到干扰复合物中。这对于siRNA载体是重要特性，因为它消除了会导致不希望出现的靶向的有义链积聚。如果该表达系统被用于人类的临床方案中，这是保证高水平安全性的非常重要的方面。
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Zeng，Y.，Wagner，E.J.& Cullen，B.R.Mol Cell.9，1327-1333(2002).
权利要求
1.用于在哺乳动物细胞中正确、稳定并有效表达siRNA或miRNA的重组载体，其从5’到3’包括a)来源于U1 snRNA基因的RNA聚合酶II依赖型启动子序列；b)用于克隆转录前-siRNA或前-miRNA的序列的合适的限制性位点；c)转录前-siRNA的序列，其包括在第+1位的A或G残基；对应于由将被沉默的基因转录的mRNA有义区域的21到23个核苷酸的序列，其构成前-siRNA茎干的第一个部分；从前-miRNA序列选择的序列，其构成前-siRNA的环状区域；对应于由将被沉默的基因转录的mRNA反义区域的21到23个核苷酸的序列，其构成前-siRNA茎干的第二个部分；两个最后的残基UU，其突出的方式使得得到下列结构 或备选地为转录前-miRNA的序列；d)来源于U1 snRNA基因3’端序列的终止序列，其对于正确形成前-siRNA或前-miRNA的3’端是必须且足够的。
2.权利要求1所述的载体，其中转录前-siRNA的序列5’端的克隆位点为Bgl II。
3.权利要求1所述的载体，其中转录前-siRNA的序列进一步在5’末端和3’末端包括使得转录的前-siRNA具有下述结构的序列 其中N为A、U、G或C，以及N’为其互补核苷酸。
4.权利要求3所述的载体，其中转录前-siRNA的序列在5’末端和3’末端含有使得转录的前-siRNA具有下述结构的序列
5.权利要求4所述的载体，其中来源于U1 snRNA基因3’端序列的终止序列如下所示CCCCTG/ACTTTCTGGAGTTTCAAAAGTAGAC。
6.前述任一权利要求所述的载体，进一步包括使RNA pol II启动子可诱导的合适序列。
7.包括前述任一权利要求所述载体的用于基因治疗的组合物。
8.权利要求1至6中任一项所述的载体在治疗应用中的用途。
全文摘要
本发明人描述了可在哺乳动物细胞中正确、稳定并有效表达siRNA的表达系统，其包括a)来源于U1 RNA基因的聚合酶II RNA－依赖型启动子；该序列下游b)用于克隆转录前－siRNA的序列的合适的限制性位点；所述位点下游c)来源于U1 snRNA基因3’端序列的序列，其对于正确形成前siRNA的3’端是必须且足够的。
文档编号A61K31/713GK1820074SQ200480019454
公开日2006年8月16日 申请日期2004年7月9日 优先权日2003年7月9日
发明者I·博佐尼, M·A·登蒂, A·罗萨 申请人:罗马“智慧”大学