专利名称：一种粘帚菌素及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种粘帚菌素及其应用，属医用抗生素技术领域。
背景技术：
迄今已发现的来源于微生物的抗生素已近万余种之多，其中许多已广泛用于治疗各种微生物感染性疾病。近年来由于病原真菌及病原细菌的抗性、病毒的变异，原有的医用抗菌素、抗病毒抗生素治疗效果在减退，需要不断开发新的抗生素，而发明新的抗生素活性成份是问题的关键。
经文献检索，未发现与本发明相同的公开报道。
发明内容
本发明的目的在于提拱一种其化学结构新颖的粘帚菌素，粘菌帚素可作为制备医用抗生素的应用。
本发明是这样实现的1、粘帚菌素的制备(1)粘帚菌素的生产菌的分离筛选本发明的生产菌株为Gliocladium roseum Gr87，该菌株是从云南的淡水湖泊的腐木中分离得到的，已于2002年10月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC No.0807。
“Gliocladium roseum Gr87菌株”具有下述形态和培养特征在PDA培养基上于28℃生长5天，其菌落可铺满平板，白色、粉红色或橙红色。显微镜下能够观察到粉红粘帚霉有两种分生孢子梗，主分生孢子梗是轮状分枝，长100-200μm，瓶梗3-4轮，大小为17-30X3μm，分生孢子头状分散；次生孢子梗(部分在菌落中心形成)，聚集成扫帚状，瓶梗紧紧压缩成4-7轮，大小为10-18X2-3μm。分生孢子椭圆形，无色，壁光滑，大小为10-12X3-4μm，分生孢子粘着形成覆瓦状的柱或不规则的粘层块。
(2)粘帚菌素的制备用Gliocladium roseum Gr87菌株，通过抗生素常规的液体或固体的发酵方法，制得本发明所述的粘帚菌素。
本发明所述的粘帚菌素对培养基中的营养源无特殊要求，可利用常用于微生物培养的碳源、氮源及其它营养源。其中碳源可为淀粉，糊精，甘油，葡萄糖，麦芽糖，蔗糖，麸皮等。氮源可为黄豆粉，黄豆饼粉，花生饼粉，棉籽饼粉，玉米浆，酵母粉，胨，铵盐，硝酸盐，以及其它有机或无机含氮化合物。对其它营养源，可适量添加一些无机盐类，例如，食盐，磷酸盐以及钾、钙、铁、镁、锰、锌之类的金属盐。还可添加些动、植、矿物油等作为消泡剂。
本发明所述的粘帚菌素对培养条件也没有严格限制，以适于抗生素生产菌的生长和获得抗生素粘帚菌素的最高产量为宜。一般培养温度为20-30℃，以26℃下菌丝体生长较快；培养基的pH范围为4-9，以接近中性为好。其它条件如培养基组成、通气量等均应根据具体情况进行适当的调节，以获得最好的效果。
粘帚菌素由上述所得的培养物，通过常规提取代谢物的方法提取。例如可利用粘帚菌素与杂质在溶解度、离子结合力、吸咐亲和力及分子量等方面的差别进行提取。具体地讲，粘帚菌素存在于发酵液中时，可用阳离子、阴离子交换树脂进行交换，然后用稀盐酸或醋酸进行解吸，也可用大孔吸咐树脂或活性炭进行吸咐，然后用含水丙酮进行解吸。这样可得到粗提物，粗提物再通过大孔吸咐树脂或离子交换树脂，就可制得淡黄色的半精制品。最后采用Sephedex-LH20凝胶柱层析，即可得到粘帚菌素的橙黄色结晶。而菌丝体中存在粘帚菌素时，则用任选的有机溶剂(例如甲醇、乙醇、丙醇，乙酸乙酯，四氢呋喃，乙腈)冷浸提取4次，将浓缩的粗提物吸收在固体吸收材料(例如粉碎的天然材料，如高岭土、粘土、滑石，石英等；或粉碎的合成材料，如微粒状硅胶，氧化铝等)上，在硅胶柱中进行色谱分离，干法上样，以氯仿/丙酮为洗脱剂进行梯度解吸。这样得到的粗提物再进行类似于从发酵液中提取粘帚菌素的操作，依次通过大孔吸咐树脂或离子交换树脂、Sephedex-LH20凝胶柱层析，即可得到粘帚菌素的橙黄色结晶。
2、粘帚菌素的理化及生物性质a.分子式为C21H16N6O2，分子量为384(FAB法测定)，结构式为
b.物化特征为外观橙黄色粉未状物质；溶解性溶于丙酮、甲醇、二甲亚砜等，不溶于氯仿和水等；高分辨正离子FAB质谱实测值为385.1402，计算值为385.1413；紫外吸收UV(pyridine)λmax(ε)为289.4(0.1818)，238.8(0.2925)，217.4(0.7205)，203.4(0.7806)nm；红外吸收IR(film)vmax为3409，1734，1682，1634，1605，1547，1482，1458，1428，1345，1303，1246，1142，1114，744；核磁谱特征见表1，其溶解溶剂为pyridine-d6，500MHz，TMS为内标，δppm.
表1粘帚菌素的核磁谱特征(吡啶，500MHz)
c.生物活性目前经实验已证明在纸片法抑菌活性的测定试验中，当粘帚菌素溶液浓度为200ppm时，处理时间为12小时时，其对宋氏痢疾杆菌(Shigellla flexneri)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、志氏痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、溶血性链球菌(Streptococcus haemolyticus)、副氏痢疾杆菌(Bacteriumparadysenteriae)等八种病原细菌的抑菌圈分别为1.60、2.13、1.37、1.80、2.17、2.20、1.53、1.80cm。
本发明的积极效果在于粘帚菌素对病原细菌的生长具有明显的抑制作用，在科研及相关药物的开发利用中具有重要的研究和应用价值。
具体实施例方式实施例1从粉红粘帚霉的固体发酵物中提取分离得到本发明化合物粘帚菌素，具体步骤如下a.真菌粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)Gr87的种子培养改良的PDA培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母提取物1.0g，甘油6.0g，琼脂17g，水1000mL，制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，28℃培养5天；b.真菌粉红粘帚霉的固体发酵培养麦子培养基(制备过程为将麦子浸于自来水中48h，然后洗净，沥干清水，分别装入500cm的三角瓶中，用棉布包扎瓶口15psi下灭菌两次，每次40min)。
将斜面培养好的菌株挑入固体发酵培养基，于室温25℃静置培养30天；c.将上述培养好的粉红粘帚霉的菌丝体冻干，再用任选的有机溶剂(例如甲醇、乙醇、丙醇，乙酸乙酯，四氢呋喃，乙腈)冷浸提取4次，将浓缩的粗提物吸收在固体吸收材料(例如粉碎的天然材料，如高岭土、粘土、滑石，石英等；或粉碎的合成材料，如微粒状硅胶，氧化铝等)上，在硅胶柱中进行色谱分离，干法上样，以氯仿/丙酮＝0-50％为洗脱剂梯度洗脱。
d.收集1％-10％的氯仿/丙酮洗脱液，减压浓缩。
e.将上述浓缩液再次在硅胶柱中进行色谱分离，干法上样，以石油醚/丙酮＝10-80％为洗脱剂梯度洗脱。
f.收集TLC板上硫酸显色为橙黄色的20-30％的石油醚/丙酮洗脱液，浓缩得褚黄色结晶，即为结构式所示的混合物。再经Sephedex-LH20多次分离，即可获得粘帚菌素。
实施例2采用纸片法检测粘帚菌素对宋氏痢疾杆菌，结核分枝杆菌，绿脓杆菌，志氏痢疾杆菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，溶血性链球菌，副氏痢疾杆菌等八种病原细菌的拮抗活性试验。
1.试验用药剂将试验用样品先溶于少量有机试剂DMSO，再加入一定浓度的吐温水溶液分别制备浓度为200ppm的样品测试溶液。在该溶液中，DMSO的终浓度＜3％、吐温的终浓度＜5‰。另将相同浓度的DMSO溶解于含有0.5％(V/V)的吐温-20的水溶液作为对照。
2.病原细菌的培养培养基配方为常规牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000mL，pH7.5)，将待测试病原细菌菌种接种到250mL三角瓶中(每瓶装50mL)，37℃下摇床(转速为220rpm)培养24小时，病原细菌含量大于1×1010/mL。
制备混菌平板将直径9cm培养皿来菌后，倒入20mL45℃的前述常规牛肉膏蛋白胨培养基和0.1mL的病原细菌发酵菌液，充分混匀，制成混菌平板。
3.试验方法纸片测定法。使用的纸片直径为2mm，进行试验时，将蘸有测试样品溶液的纸片放在混菌平板中间，于37℃下培养12小时，测量抑菌圈直径，重复三个样品。
4.试验结果表3粘帚菌素(200ppm)对病原细菌的抑菌作用
结果表明培养12小时后，对照未出现抑菌圈，而粘帚菌素对所测试的八种病原细菌的生长具有明显的抑制作用，抑菌圈最大的为2.20cm，最小的也为1.37cm，显示了其对病原细菌的较好抗性。
权利要求
1.一种粘帚菌素，由生产菌株，通过液体或固体发酵及提取代谢物的方法得到，其特征在于a.生产菌株是粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)Gr87，该菌株于2002年10月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏号为CGMCCNo.0807；b.粘帚菌素的分子式为C21H16N6O2，分子量为384，结构式为 c.粘帚菌素的物化特征为外观橙黄色粉未状物质；溶解性溶于丙酮、甲醇、二甲亚砜等，不溶于氯仿和水等；高分辨正离子FAB质谱实测值为385.1402，计算值为385.1413；紫外吸收UV(pyridine)λmax(ε)为289.4(0.1818)，238.8(0.2925)，217.4(0.7205)，203.4(0.7806)nm；红外吸收IR(film)νmax为3409，1734，1682，1634，1605，1547，1482，1458，1428，1345，1303，1246，1142，1114，744。
2.权利要求1所述粘帚菌素可作为制备防治宋氏痢疾杆菌，结核分枝杆菌，绿脓杆菌，志氏痢疾杆菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，溶血性链球菌，副氏痢疾杆菌的抗生素应用。
全文摘要
本发明涉及一种粘帚菌素及其应用，属医用抗生素技术领域。该粘帚菌素由生产菌株通过常规的液体或固体发酵及提取代谢物的方法得到。生产菌株为Gliocladium roseum Gr87，该菌株于2002年10月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏号为CGMCC No.0807；粘帚菌素的分子式为C
文档编号A61P31/06GK1683546SQ20051001069
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月16日 优先权日2005年3月16日
发明者董锦艳, 张克勤 申请人:云南大学