专利名称：一种抗肿瘤活性物质及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤活性物质及其制备方法和应用，属微生物医药技术领域。
背景技术：
肿瘤(癌症)在全球范围内是仅次于心血管疾病的第二大“杀手”。据美国癌症研究院(NCI)2003年的统计资料，美国男子约有一半、女子约有三分之一将在他(她)们的生命过程中患上癌症；全美每年新诊断肿瘤病例超过100万人，每年死于这类疾病的人数超过50万。我国的肿瘤发病率同样十分惊人，每年新增肿瘤病人200万人，死亡130多万人，目前全国癌症病人总数估计在500万以上。随着全球老龄化社会的到来和肿瘤发病率的不断提高，抗肿瘤药物市场也在不断地增长。据中国东方健康市场研究中心2001年的《中国抗肿瘤药物市场研究报告》，1999年中国抗肿瘤药物市场增长了17％，达6.03亿美元，估计到2006年此类药品的销售额可达17亿美元。
随着肿瘤发病率的日趋升高，人们对抗肿瘤药物的研究也在不断加强和深入。目前所用的抗肿瘤药物中，多数对人体副作用较大，特异性不强，迫切需要开发活性高、特异性强的新型抗肿瘤药物造福于人类。
三七是中国的传统名贵药材，利用微生物转化的方法，对三七进行二次开发，产生新的具有抗肿瘤活性的发酵物，是进一步利用中草药，实现中药现代化的有利手段。
国内外文献检索表明，未见有关利用微生物转化三七产生抗肿瘤活性物质的公开文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用红色红曲霉发酵三七及其在抗肿瘤活性方面的应用。
本发明是这样实现的本发明的生产菌株是红色红曲霉(Monascus ruber)3081，该菌株已于2005年2月28日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.1319。
红色红曲霉属子囊菌亚门(Ascomycotina)，不整囊菌纲(Plectomyhcetes)，散囊菌目(Eurotiales)，红曲科(Monascaceae)，红曲霉属(Monascus)。3081菌株在麦芽汁琼脂培养基上生长良好，菌丝初为白色，老熟后变为赭红色。菌落的结构呈绒毡状。能形成红色色素，故使培养物的背面着色。
本发明是这样实现的将三七用Monascus ruber 3081菌株通过固体培养，提取有抗肿瘤活性的代谢产物，制备成抗肿瘤的制剂。
实验表明三七红色红曲霉发酵物对人白血病细胞株K562和人肺癌细胞株A549显示了明显的抑制活性；对致癌基因Raf1和c-Myc的潜在靶点酪氨酸磷酸酯酶cdc25a和cdc25b具有显著的抑制作用。
本发明将以三七为底物的Monascus ruber 3081发酵物作为制备抗肿瘤制剂的应用。
本发明与现有技术相比，利用了微生物自身独特的代谢体系以三七为底物生产具有抗肿瘤活性的代谢物质，并通过人工培养技术实现生产控制。
具体实施例方式一、本发明化合物的发酵生产方法实施例11、将红色红曲霉(Monascus ruber)3081接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为麦芽汁培养基，20℃下培养8天，获得试管种；2、将试管种接种到250ml三角瓶中(每瓶装50ml)固体培养基中，培养基配方为三七须根粉末20％，水80％，自然pH，培养温度30℃，最适25-28℃，静置培养20天，直到菌丝长满。
3、将固体培养物冷冻干燥。用90％的乙醇室温浸提2天，减压浓缩，蒸干溶剂后即得活性物质。
实施例2基本同实施例1。不同之处为试管固体培养的温度28℃、时间为下培养6天；固体培养基配方为三七须根粉末25％，水75％，培养温度25℃，静置培养18天；用95％的乙醇室温浸提。
实施例3基本同实施例1。不同之处为试管固体培养的温度30℃、时间为下培养4天；固体培养基配方为三七须根粉末30％，水70％，培养温度20℃，静置培养15天；用92％的乙醇室温浸提。
二、本发明化合物抗肿瘤活性的药效试验1、对人肿瘤细胞的生长抑制作用将对数生长期细胞调整为适当浓度后加入96孔培养板，90ul/孔。受试浓度为100ug/ml，设3个平行孔，10ul/孔。阴性对照为等体积培养液，阳性对照为抗癌药物顺铂(DDP)。同时设相应浓度的DMSO溶媒对照和有色样品显色浓度的平行对照，以消除有色样品颜色的干扰。贴壁生长的细胞(A549)接种后培养24小时待其贴壁后加药，悬浮生长细胞(K562)接种后即加药，加药后细胞置37℃，5％CO2培养箱培养一定时间(A549培养72小时，K562培养48小时)后加入MTT(5mg/ml)，20ul/孔，继续培养4小时后加入三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.012mol/L HCl，W-V-V)，100ul/孔，放置过夜后，用酶标仪在570nm，630nm双波长下测定各孔的OD值。
2、对致癌基因Raf1和c-Myc的潜在靶点酪氨酸磷酸酯酶cdc25a和cdc25b的抑制作用将20ml酪氨酸磷酸酯酶cdc25a或cdc25b加入含有20mlDDT(100mM)的Tris缓冲液中(50mM Tris，pH8，50mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT)，再加入140mlTris缓冲液。平板预先在37℃的培养箱内保持15分钟，然后加入20mL500mM的发酵物，37℃反应30分钟后，在405nm波长下测定OD值。
实施1发酵物对人肿瘤细胞的生长抑制将0.5mg三七发酵物溶于少量二甲亚砜，用无菌蒸馏水稀释为100ug/ml溶液，二甲亚砜的终浓度不超过2％。
按上述试验方法1进行药效试验。
表1三七发酵物对人肿瘤细胞的生长抑制作用K562％ A549％DMSO control 1.98 0DDP control 0.1ug/ml32.000.871.0ug/ml41.4134.1710ug/ml 100.00 100.00Extract fermented by M.rubber 308178.5722.71结果表明，三七红色红曲霉发酵物对人白血病细胞株K562的抑制率达到78.57％，对人肺癌细胞株A549的抑制率达到22.71％，显示了明显的抑制活性。
实施2发酵物对酪氨酸磷酸酯酶cdc25a和cdc25b的抑制将0.5mg三七发酵物溶于少量二甲亚砜，配制为50ug/ml的水溶液，待测溶液中二甲亚砜的终浓度不超过2％。
按上述试验方法2进行药效试验。
表2 三七发酵物对酪氨酸磷酸酯酶cdc25a和cdc25b的抑制作用编号 cdc25a抑制率％ cdc25b抑制率％DMSO Control 2.012.972.22 2.54XXX Control 93.10 98.30 95.1191.88Extract fermented by M.rubber 308179.70 79.40 64.5462.01结果表明，三七红色红曲霉发酵物对致癌基因Raf1和c-Myc的潜在靶点酪氨酸磷酸酯酶cdc25a的抑制率为79.55％，对cdc25b的抑制率为63.28％，具有显著的抑制作用。
实施3发酵物对人肿瘤细胞的生长抑制活性的增强实施例3方法同实施例1，不同之处为分别将0.5mg三七发酵物，0.5mg三七乙醇提取物，和0.5mg红色红曲霉自然发酵物各溶于少量二甲亚砜，用无菌蒸馏水稀释为100ug/ml溶液，二甲亚砜的终浓度不超过2％。
表3三七发酵物对人肿瘤细胞的生长抑制活性的增强K562A549DMSO control1.980DDP control 0.1ug/ml 32.00 0.871.0ug/ml 41.41 34.1710ug/ml100.00 100.00P.notoginseng control 69.46 1.16M.rubber 3081 control 2.9010.26Extract fermented by M.rubber 3081 78.57 22.71结果表明，三七经红色红曲霉发酵之后，可以提高对人肿瘤细胞的生长抑制活性，提高率为13.11％。
权利要求
1.一种抗肿瘤活性物质，由生产菌株经试管培养、固体培养及冷冻干燥工序后制成，其特征在于生产菌株为红色红曲霉(Monascus ruber)3081，该菌株已于2005年2月28日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.1319。
2.权利要求1所述活性物质的制备方法，包括试管培养、固体培养及冷冻干燥工序，其特征在于2.1试管培养为将红色红曲霉(Monascus ruber)3081接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为麦芽汁培养基，在20-30℃下培养4-8天，获得试管种；2.2固体培养基组成为三七须根粉末20％-30％，水70％-80％，自然pH。2.3固体培养中温度20-30℃，静置培养15-20天，直到菌丝长满；2.4冷冻干燥工序为用90～95％的乙醇在室温浸提2天，减压浓缩后蒸干溶剂后即得活性物质。
3.权利要求1所述的抗肿瘤活性物质，其特征在于该活性物质对人肿瘤细胞的生长、对酪氨酸磷酸酯酶cdc25a和cdc25b具有抑制作用，可以用以制备抗肿瘤制剂。
全文摘要
本发明涉及一种抗肿瘤活性物质及其制备方法和应用，属微生物医药技术领域。该活性物质采用常规方法制备，其中生产菌株为红色红曲霉(Monascus ruber)3081，保藏号CGMCC No.1319。试管种采用常规的麦芽汁培养基，于20－30℃下培养4－8天。固体发酵培养基为三七须根粉末20％－30％，水70％－80％，自然pH。固体培养温度20－30℃，静置培养15－20天后，用90～95％的乙醇在室温浸提2天，减压浓缩后蒸干溶剂后即得活性物质。本发明得到的活性物质对人白血病细胞株K562的抑制率达到78.57％，对人肺癌细胞株A549的抑制率达到22.71％；对致癌基因Raf1和c－Myc的潜在靶点酪氨酸磷酸酯酶cdc25a的抑制率为79.55％，对cdc25b的抑制率为63.28％，该活性物质具有显著的抑制作用，可作为制备抗肿瘤制剂的应用。
文档编号A61P35/00GK1682771SQ200510010690
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月16日 优先权日2005年3月16日
发明者刘亚君, 张克勤 申请人:云南大学