专利名称：针对活化Th1细胞的重组免疫毒素MIP－1α－DT390的质粒及制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种特异攻击并杀伤活化Th1细胞的重组免疫毒素表达真核质粒及其制备方法与应用。
背景技术：
免疫毒素(Immunotoxins，ITs)是将生物毒素与导向分子(抗体或细胞因子)连接起来的药物，又称生物导弹或导向毒素。第一代免疫毒素是将载体与毒素分子通过化学偶联而成，分子量大、免疫原性强、稳定性差、半衰期短、渗透性差、疗效较差，难以大规模生产，限制了其应用。近年来人们通过基因重组技术对免疫毒素进行了改进，导向载体开始选用基因工程抗体和一些配体，在不影响效应的前提下减小了分子量，稳定性强、渗透性好、具有较好的导向特异性、制备简单易行、可短期内大量制备，很大程度上弥补了第一代免疫毒素的不足，极大地推动了免疫毒素在相关领域的深入研究。
自身免疫性疾病(autoimmune disease)是由于各种原因导致免疫系统对自身抗原反应，造成自身组织损伤和功能障碍的一大类疾病。目前的治疗措施主要是采用非特异的免疫抑制剂，往往使患者免疫系统受到普遍性抑制而导致感染、肿瘤的发生及骨髓抑制等，并不能有效防止疾病的复发。
基础免疫学的研究进展表明，自身免疫性疾病中识别自身抗原的自身反应性T细胞，主要是CD4+Th1细胞，而CD4+Th2则仅具有一定的调节作用(见Liblau RS，etal.Immunol.Today；1995，1634；Costa GL，et al.J.Immunol.2000，1643581)。由此提示，如果能利用特异性更高的免疫毒素只将这些活化的自身反应性TH1细胞杀死，而不影响TH2细胞，则有可能弥补上述缺陷，治疗自身免疫性疾病。根据此设计理念，申请号为200410081390.6和200410081391.0中国专利申请构建出了针对活化Th1细胞的重组免疫毒素Rantes-DT390的质粒和重组免疫毒素IP10-DT390的质粒，试验表明，上述两种重组质粒对Th1细胞均具有良好的靶向特异性，对自身免疫性疾病动物模型EAE的临床症状均有明显缓解作用。但为了攻克自身免疫性疾病，有必要构建出更多的针对活化Th1细胞的重组免疫毒素的质粒。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的针对活化Th1细胞的重组免疫毒素的真核质粒，以便开发出疗效更好的治疗自身免疫性疾病的药物。
本发明所述的针对活化Th1细胞的重组免疫毒素的基因，由小鼠的巨噬细胞炎症蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)cDNA碱基序列(来自genebank)和白喉毒素的活性片段DT390cDNA碱基序列(来自gene bank)连接而成，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。本发明所述的针对活化Th1细胞的重组免疫毒素的质粒，含有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列，可表达特异性的重组免疫毒素MIP-1α-DT390。
中心粒细胞、单核细胞、活化T细胞、肥大细胞、成纤维细胞及某些肿瘤细胞等多种细胞具有分泌MIP-1α的潜能。MIP-1α的受体有趋化因子受体CCR1、CCR3和CCR5，当其与受体结合后，表现出趋化免疫细胞、抑制造血干细胞生长及抑制人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Viruses，HIV)感染的作用。
实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)的发生发展过程中存在着Th1和Th2型细胞平衡失调，并以激活的Th1型细胞占优势。在免疫应答的过程中，活化的T细胞将表达多种受体，如细胞因子白细胞介素-2(interleukin，IL)、IL-12、干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)的受体以及多种化学趋化因子CCR5、CXCR3等的受体。这些T细胞膜受体中，MIP-1α受体的表达限于活化的Th1细胞，而Th2细胞低表达，因此，MIP-1α受体可以作相关的免疫治疗的理想靶位。
本发明选用MIP-1α为导向分子，白喉毒素的活性片段DT390为毒素分子，构建MIP-1α-DT390重组免疫毒素的真核质粒，转染动物体内，表达重组免疫毒素，以特异攻击并杀伤活化的Th1细胞，诱导自身免疫耐受，实现有效治疗自身免疫性疾病的目的。本发明通过实验证明重组免疫毒素MIP-1α-DT390具有特异攻击并杀伤活化的Th1细胞的特性，而对Th2及B细胞无此影响(见实施例2及图4、图5)。经重组免疫毒素MIP-1α-DT390治疗后，自身免疫性疾病动物模型EAE的临床症状明显缓解，病理切片显示，治疗组与未治疗组比较，小脑及脊髓脱髓鞘病变减轻，脑膜下及血管周围淋巴细胞浸润减少(见实施例3)。与申请号为200410081390.6和200410081391.0的中国专利申请构建的针对活化Th1细胞的重组免疫毒素Rantes-DT390和IP10-DT390相比，实验动物的发病延迟，反映临床症状严重程度的评分降低(表明对自身免疫性疾病动物模型EAE的初步治疗效果更好，见实施例4)。综上所述，本发明所述的针对活化Th1细胞的重组免疫毒素的质粒具有临床应用前景，可在制备治疗或预防自身免疫系统疾病的药中应用。
构建重组免疫毒素真核表达质粒的步骤依次如下1、通过RT-PCR反应，获得MIP-1α基因；2、将上述扩增的MIP-1α基因片段插入到含有DT390片段的SRα真核质粒中，构建重组质粒。再转染至感受态细菌中进行扩增，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；3、PCR扩增和限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析，以保证重组质粒中MIP-1α插入片段的正确性；4、通过MTT法测定重组免疫毒素真核表达质粒的活性。
上述制备方法中，构建重组质粒可选用的真核质粒载体还可以是pSecTag2或pcDNA3.1(+)。
本发明具有以下有益效果1、选择细胞因子MIP-1α为导向分子、白喉毒素的活性片段DT390为毒素分子，构建了一种新型的针对活化Th1细胞的重组免疫毒素的真核质粒，为自身免疫性疾病的治疗提供了新药品。
2、试验表明，本发明所述重组免疫毒素MIP-1α-DT390具有特异攻击并杀伤活化的Th1细胞的特性，经其治疗后，自身免疫性疾病动物模型EAE的临床症状有明显缓解作用，且与申请号为200410081390.6和200410081391.0的中国专利申请构建的针对活化Th1细胞的重组免疫毒素Rantes-DT390和IP10-DT390相比，对自身免疫性疾病动物模型EAE的初步治疗效果更好。
3、本发明所述免疫毒素的质粒是通过基因重组技术来获得，可直接转染细胞而表达重组免疫毒素，勿需进一步提纯免疫毒素蛋白质。避免了原来化学偶联免疫毒素复杂的制备工艺和难以标化的缺点，更易产业化。
4、本发明所述免疫毒素MIP-1α-DT390的质粒亦可用于移植排斥反应及某些肿瘤的防治。
图1是本发明所述针对活化Th1细胞的重组免疫毒素MIP-1α-DT390的质粒的结构示意图，真核质粒载体为SRα；
图2是免疫荧光法鉴定重组免疫毒素MIP-1α-DT390在NIH3T3细胞的瞬时表达图；图3是转染SRα-MIP-1α-DT390的NIH3T3细胞上清对活化T细胞的细胞毒作用(MTT法)实验结果图；图4是流式细胞仪测定实验小鼠活化T、B细胞实验结果图；图5是流式细胞仪测定实验小鼠Th1、Th2的细胞实验结果图；图6是实验小鼠的临床评分结果图；图7是实验小鼠的免疫组织化学病理切片图；图8是本发明所述MIP-1α-DT390重组质粒与申请号200410081390.6的专利申请所公开的重组质粒和申请号200410081391.0的专利申请所公开的重组质粒对自身免疫性疾病动物模型EAE的初步治疗的临床评分结果比较图。
图中，1-1-DT390基因、1-2-MIP-1α基因、1-3-SRα载体、2-1-SRα-MIP-1α-DT390质粒转染NIH3T3细胞瞬时表达检测结果(荧光，100×，一抗羊抗鼠MIP-1αIgG)、2-2-SRα-MIP-1α-DT390瞬时表达检测结果(平光，100×，一抗羊抗鼠MIP-1αIgG)、2-3-SRα-MIP-1α-DT390瞬时表达检测结果(荧光，100×，一抗羊抗DT IgG)、2-4-SRα-MIP-1α-DT390瞬时表达检测结果(平光，100×，一抗羊抗DT IgG)、2-5-SRα质粒转染NIH3T3细胞瞬时表达检测结果(荧光，100×，一抗羊抗DT IgG)、2-6-SRα质粒瞬时表达检测结果(平光，100×，一抗羊抗DT IgG)；4-1-正常小鼠标记T、B细胞流式结果、4-2-治疗小鼠标记T、B细胞流式结果、4-3-未治疗小鼠标记T、B细胞流式结果；5-1-正常小鼠标记IFN-γ流式结果、5-2-治疗小鼠标记IFN-γ流式结果、5-3-未治疗小鼠标记IFN-γ流式结果、5-4-正常小鼠标记IL-4流式结果、5-5-治疗小鼠标记IL-4流式结果、5-6-未治疗小鼠标记IL-4流式结果；7-1-未治疗组小鼠脑组织淋巴细胞浸润40×、7-2-未治疗组小鼠脑膜血管周淋巴细胞浸润40×、7-3-治疗组小鼠脑组织40×、7-4-治疗组小鼠脑组织40×、7-5-正常组小鼠脑组织40×、7-6-正常组小鼠脑组织40×。
具体实施例方式
实施例1构建重组免疫毒素的真核表达质粒载体选用含DT390的SRα真核质粒(由美国Wisconsin大学PhD.Hu Huaizhong提供，可从Invitrogen公司购买)，具体步骤如下1、获得小鼠MIP-1α基因(1)用Trizol试剂(购自Invitrogen公司)提取小鼠肝总RNA
1)无菌条件下取小鼠肝组织100mg。
2)加1mlTrizol。
3)匀浆(要彻底，后转至EP管，组织匀浆量＞100mg时分装，1ml/每EP管)。
4)颠倒混匀10下，室温静置5分钟。
5)加氯仿1/5体积(0.2ml)(必须按总体积的1/5)。
6)颠倒混匀10下，室温静置5分钟。
7)4℃，离心12000g，15分钟。
8)转上层水相(约400μl)于另-1.5mlEP管中。
9)加等体积异丙醇(约400μl)，混匀室温静置10分钟。
10)4℃，离心12000g，10分钟。
11)弃上清。
12)加冰预冷的75％乙醇1ml，用二乙基焦磷酰胺(diethylpyrocarbonate，DEPC)水配。
13)4℃离心7500g，5分钟。
14)弃上清，空气干燥5-10分钟(不能完全干燥)。
15)溶于DEPC水中至20μl(10μl-20μl，可在55-60℃水中，＜10分钟助溶)。
(2)逆转录反应1)按下表配液(稀释10倍后用)
2)混匀，离心，70℃，5min。
3)立即冰水浴，稍离心。
4)按下表配制试剂
5)混匀，离心，42℃，60min。
6)95℃，10min(破坏MLV)。
7)4℃保存。
(3)cDNA的PCR反应1)反应体系如下
2)PCR扩增引物上游引物5’-CATGCCATGGGCGCCATATGGAGCTGAC-3’(5’端设有NcoI酶切位点加保护碱基)下游引物5’-GGAATTCTCAGGCATTCAGTTCCAGGTCA-3’(5’端设有EcoRI酶切位点加保护碱基，含终止密码子TGA)3)PCR反应条件94℃预变性3min，94℃变性35sec、62℃复性30sec、72℃延伸55sec，34个循环，72℃延伸10min。
(4)扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析。
2、重组免疫毒素SRα真核表达质粒的预处理(1)用限制性内切酶NcoI及EcoRI双酶切SRα真核质粒，反应体积20μl(其中含有NcoI酶1μl、EcoRI酶1μl、10×NEbuffer22μl、SRα真核质粒10μl、ddH2O 6μl)，37℃过夜(限制性内切酶均购自New England公司)；(2)反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统的紫外灯下，按胶回收试剂盒(购自Omega公司)的说明回收大片段。
3、MIP-1α与SRα真核表达质粒的连接及转化(1)将上述步骤中所获得的载体片段及插入片段粗略定量后，按插入片段载体分子摩尔数比＝3～10∶1的连接反应原则进行连接实验；(2)反应体系如下表，整个反应过程在T4DNA连接酶(购自New England公司)作用下在PCR仪中16℃反应过夜。连接反应时应分别设立无插入片段和无载体的对照管。使上述扩增的MIP-1α基因片段插入到含有DT390片段的SRα真核质粒中，MIP-1α基因片段与DT390片段通过NcoI酶切位点连接，与SRα真核质粒通过EcoRI酶切位点连接，所构建的重组质粒见图1。
(3)将连接产物分别转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(购自Takara公司)。连接产物的转化方法按《分子克隆操作指南》进行，主要步骤如下1)取连接产物4μl加入感受态细胞30μl置于1.5ml Ep管中，阴性对照为感受态细胞30μl置于1.5ml Ep管中。
2)置于冰上30min，每隔几分钟轻弹。
3)42℃水浴30Sec。
4)冰上放置3min。
5)加0.3ml SOC培养基(10ml SOC+50μl 2mol/L MgCl2)，置于冰上。
6)37℃，250rpm振摇1小时。
7)取50μl转化细胞+5μl 0.1g/ml Amp，均匀涂布于含Amp的平板，置37℃孵箱培养过夜。
4、PCR扩增和限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析，以保证重组质粒中MIP-1α插入片段的正确性。测序结果表明，重组质粒中所含碱基序列如SEQ ID NO.1所述。
5、MIP-1α-DT390真核表达质粒在NIH3T3细胞中的表达(1)在转染前24h，将NIH3T3细胞(购自Takara公司)接种于六孔培养板中，每孔细胞约1×106，置于37℃5％CO2孵箱培养。
(2)待细胞长满至约80-90％融合后，分别以SRα空质粒及SRα-MIP-1α-DT390质粒转染真核细胞NIH3T3，具体操作按QIAGEN公司脂质体转染试剂盒中的说明书进行。
(3)转染细胞培养48小时后，经免疫荧光染色后在倒置荧光显微镜下可观察到重组质粒转染组部分细胞有较强的绿色荧光，而对照组均未见有绿色荧光出现(结果见图2)。
实施例2体外重组免疫毒素MIP-1α-DT390的生物活性测定1、转染上清中MIP-1α-DT390对效应细胞的细胞毒作用(MTT法)(1)效应细胞的准备6-8周龄，20g左右雌性C57BL/6小鼠眼球放血后处死，无菌解剖剥离脾脏，用注射器针芯轻压脾组织，加入RPMI1640培养基，收集离心，获得脾细胞的悬液，并调整细胞浓度为5×106/ml，接种于细胞培养瓶，加入含伴刀豆凝集素A(concanavalin A，ConA)的RPMI1640培养基(ConA终浓度为5μg/ml)，37℃，5％CO2孵箱培养，培养72小时后，收集悬浮生长被ConA激活的淋巴细胞作为效应细胞。
(2)将收集的效应细胞浓度调整至1×106/ml，加入96孔细胞培养板，100μl/孔，再分别将收集的上述转染上清按原液1/2、1/4、1/8、1/16、1/32稀释的浓度加入，50μl/孔，各浓度设立三复孔。
(3)于37℃，5％CO2孵箱中共同培养24小时、48小时后，分别取出培养板，每孔加20μl MTT(5μg/ml)，继续培养4小时，将培养板以1000转/分离心5min，小心去除上清，每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，充分混匀，37℃放置20min，使结晶物充分溶解，在酶标仪上测定各孔光吸收值(波长570nm)，按下列公式计算细胞活性 (4)结果显示细胞转染上清对小鼠活化T细胞具有较强的细胞抑制效应，共育48小时的抑制效应高于24小时，且该抑制效应具有剂量依赖关系，即随着上清稀释度的增加而抑制效应随之降低(见图3)。
2、流式细胞仪测定其细胞毒性(1)无菌操作下取小鼠脾脏，用RPMI1640培养基制成脾细胞悬液，与ConA(10ug/ml)混合培养；(2)37℃，5％CO2孵箱培养3天后，加入上述转染上清按原液1/2、1/4、1/8、1/16、1/32稀释的浓度，50μl/孔，各浓度设立三复孔；(3)继续培养24h，收集细胞，流式细胞仪测定免疫毒素MIP-1α-DT390分别对活化T、Th1、Th2细胞和B细胞的细胞毒性(CD4+T细胞膜表面标记；IFN-γTh1细胞内标记；IL-4Th2细胞内标记；CD19+B细胞膜表面标记)；(4)流式细胞仪测定结果显示，T细胞及Th1细胞数目下降40％-60％，而对Th2及B细胞无此影响(见图4、图5)。由此表明重组免疫毒素MIP-1α-DT390具有良好的靶向特异性。
实施例3重组免疫毒素MIP-1α-DT390的真核质粒对自身免疫性疾病动物模型EAE的初步治疗效果1、EAE动物模型的建立根据常规方法用髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)免疫C57BL/6小鼠，建立EAE模型。
(1)用C57BL/6小鼠建立EAE动物模型，将自提的MBP粗提液与完全福氏佐剂(full freund adjuvant，FCA)(内含结核分枝杆菌5mg/ml)等体积混和，使用3ml注射器反复推拉成为油包水的乳剂，采用腹腔注射的方法。
(2)免疫剂量每只小鼠注射MBP∶FCA(1∶1)混和液0.4ml，百日咳杆菌菌液PBS(1∶50)混和液0.2ml(内含百日咳杆菌0.6-1.8×106个)。
(3)对照组每只小鼠腹腔注射百日咳杆菌菌液与PBS混和液0.2ml(内含百日咳杆菌0.6-1.8×106个)。
(4)免疫时间第1天、第7天免疫两次。
2、重组质粒对EAE模型的初步治疗(1)用MIP-1α-DT390重组真核质粒对EAE动物模型进行治疗试验治疗时间在MBP免疫小鼠后第1天、第3天分别治疗2次；治疗方法使用阳离子脂质体包被的MIP-1α-DT390重组质粒，采用试验小鼠大腿肌肉注射的方式；治疗剂量50μg/只。
(2)观察治疗后治疗组及未治疗组的症状表现，根据临床评分标准进行打分(Kono分级法)，具体为0分没有任何临床症状；1分动物尾部无力；2分动物尾部无力+前肢或后肢中等无力；3分前肢或后肢严重无力，人为翻身后不能恢复；4分肢体麻痹，人为翻身后不能恢复；5分濒死状态(见图6)。
(3)处死动物并取脑组织及骨髓做病理切片，经免疫组织化学染色后镜下观察病理改变(见图7)。
结果动物模型临床评分显示，其治疗组与未治疗组均有明显差异(p＜0.05)，经重组免疫毒素MIP-1α-DT390质粒治疗后，自身免疫性疾病动物模型EAE的临床症状有明显缓解作用。病理切片显示，治疗组与未治疗组比较，小脑及脊髓脱髓鞘病变减轻；脑膜下及血管周围淋巴细胞浸润减少。
实施例4MIP-1α-DT390的重组真核质粒与申请号200410081390.6所公开的重组真核质粒Rantes-DT390和申请号200410081391.0所公开的重组真核质粒IP10-DT390对自身免疫性疾病动物模型EAE的初步治疗效果的比较1、MIP-1α-DT390重组真核质粒对EAE模型的初步治疗结果的临床评分来自于上述
SEQUENCE LISTING<110>四川大学<120>针对活化Th1细胞的重组免疫毒素MIP-1α-DT390的质粒及制备方法与应用<130>1<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1449<212>DNA<213>小鼠<400>1ggcgctgatg atgttgttga ttcttctaaa tcttttgtga tggaaaactt tgctagctac 60cacgggacta aacctggtta tgtagattcc attcaaaaag gtatacaaaa gccaaaatct120ggtacacaag gaaattatga cgatgattgg aaagggtttt atagtaccga caataaatac180gacgctgcgg gatactctgt agataatgaa aacccgctct ctggaaaagc tggaggcgtg240gtcaaagtga cgtatccagg actgacgaag gttctcgcac taaaagtgga taatgccgaa300actattaaga aagagttagg tttaagtctc actgaaccgt tgatggagca agtcggaacg360
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权利要求
1.一种针对活化Th1细胞的重组免疫毒素的基因，其特征在于它由MIP-1αcDNA碱基序列和白喉毒素的活性片段DT390 cDNA碱基序列连接而成，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。
2.一种针对活化Th1细胞的重组免疫毒素的质粒，其特征在于它含有权利要求1所述的碱基序列。
3.一种权利要求2所述针对活化Th1细胞的重组免疫毒素的质粒的制备方法，其特征在于依次包括以下步骤(1)通过RT-PCR反应，获得MIP-1α基因；(2)将上述扩增的MIP-1α基因片段插入到含有DT390片段的真核质粒中构建重组质粒，再将重组质粒转染至感受态细菌中进行培养，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；(3)利用PCR扩增和限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析。
4.根据权利要求3所述针对活化Th1细胞的重组免疫毒素的质粒的制备方法，其特征在于构建重组质粒选用的真核质粒载体为SRα、pSecTag2、pcDNA3.1(+)中的一种。
5.根据权利要求3或4所述针对活化Th1细胞的重组免疫毒素的质粒的制备方法，其特征在于限制性内切酶选用SalI、NcoI、EcoRI。
6.权利要求2所述针对活化Th1细胞的重组免疫毒素的质粒在制备治疗或预防自身免疫系统疾病的药中的应用。
全文摘要
本发明选用MIP－1α为导向分子，白喉毒素的活性片段DT390为毒素分子，构建MIP－1α－DT390重组免疫毒素的真核质粒，转染动物体内，表达重组免疫毒素。本发明通过实验证明重组免疫毒素MIP－1α－DT390具有特异攻击并杀伤活化的Th1细胞的特性，而对Th2及B细胞无此影响。经重组免疫毒素MIP－1α－DT390治疗后，自身免疫性疾病动物模型EAE的临床症状明显缓解，病理切片显示，治疗组与未治疗组比较，小脑及脊髓脱髓鞘病变减轻，脑膜下及血管周围淋巴细胞浸润减少，可在制备治疗或预防自身免疫系统疾病的药中应用。
文档编号A61P37/00GK1766114SQ20051002160
公开日2006年5月3日 申请日期2005年9月5日 优先权日2005年9月5日
发明者张 林, 吕梅励, 李虹, 陈文捷, 贾怡, 梁伟波, 李明远 申请人:四川大学