专利名称：人溶菌酶在制备治疗瘙痒症的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及人溶菌酶的新用途，特别是人溶菌酶在医药领域的新用途。
背景技术：
瘙痒见于多种炎症性或非炎症性皮肤病，致病因素较为复杂，可分为内因和外因引起的瘙痒症(pruritus)。
1、内因(1)老年性皮肤改变；皮肤随着年龄增加而发生相应老化，汗腺和皮肤腺萎缩，分泌功能减退，角质层水合能力降低，皮肤表面水脂乳化物减少，缺乏润泽而变得干燥。
(2)肝脏疾病即胆汁淤积性瘙痒。
(3)肾脏疾病多数慢性肾功能衰竭患者伴有不同程度的全身性瘙痒。
(4)内分泌和代谢性疾病甲状腺功能亢进患者可伴发全身性瘙痒。
(5)恶性病变和血液病慢性白血病、肺癌、缺铁性贫血、血色素沉着亦可发生不同程度的瘙痒。
(6)神经精神疾病；少数多发硬化患者表现发作性瘙痒。
(7)其它类风湿性关节炎、免疫性疾病等可发生不同程度的瘙痒。
2、外因(1)药物、食品及毒品引起瘙痒。
(2)感染旋毛虫病、丝虫病感染等引起瘙痒。
(3)生活环境因素及其它季节、温度的变化，风吹、日晒、空气干燥等引起瘙痒。
瘙痒症根据临床表现可分为全身性瘙痒症、局限性瘙痒症；全身性瘙痒症最初仅局限于身体某处，主要见于两小腿身侧，其次为两大腿身侧，再次为发展到两上肢身侧，严重者包括前胸、后背、头面等处，继而扩展至多个部位直至弥漫全身。局限性瘙痒症肛门瘙痒、阴囊瘙痒、女阴瘙痒等。瘙痒根据季节又分为冬季瘙痒症(winteritch)。冬季瘙痒症又称为皮脂缺乏性湿疹(asteatotic eczema)、裂隙性湿疹(eczema craquele)、冬令瘙痒症(pruritus hiemalis)、干燥性湿疹(xerotic eczema)，是一种多见于老年人的与冬季气候干燥有明显关系的瘙痒性皮肤病。瘙痒根据年龄又分为老年瘙痒症(senilepruritus)。老年瘙痒症特指高龄老人无系统性疾病、皮肤干燥、萎缩所引起的皮肤瘙痒。瘙痒症目前一般采用的治疗用药物，如天津天骄制药有限公司生产的“乐肤液”等，副作用非常大，擦到皮肤上有烧灼、刺痛感，皮肤损伤者更为严重，如果大面积长期使用有激素效应，影响身体健康。
发明内容
本发明的目的是针对瘙痒症，提供一种人溶菌酶在制备治疗瘙痒症的药物中的应用，药物药效快，药效延续时间长，无刺激、无过敏反映，不产生耐药性、不产生激素效应、安全无毒副作用。
实际上本发明是人溶菌酶在制备治疗瘙痒症的药物中的应用。尤其是人溶菌酶在制备治疗由各种炎症性或非炎症性引起的瘙痒症的药物中的应用。
所述人溶菌酶在制备治疗冬季瘙痒症或老年瘙痒症的药物中的应用。
所述人溶菌酶为基因工程表达的重组人溶菌酶或基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶或基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
所述药物中含有人溶菌酶1500U～30万U/mL/g。药物可按常规制剂方法制成喷雾剂、滴剂或软膏剂。具体制法为
1、喷雾剂或滴剂将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得1500U～30万U/mL，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)75～85％、5～25％丙二醇、1～5％水溶性氮酮、万分之五吐温80，在常温下混合均质，(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)制成喷雾剂或滴剂。
2、软膏剂将纯度95％～99％的基因重组人溶菌酶制得1500U～30万U/ml/g备用，分别称取5～25％丙二醇(或丙三醇)、5～15％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、1～5％水溶性氮酮、羊毛脂1～5％、65～75％凡士林，并于120℃高压灭菌30min，待温度降至60～70度，分别过虑、除杂、除菌备用，待温度降至50度时，称取重组人溶菌酶混合均质，最后倒入凡士林中其它原料搅拌、混合均质，制成软膏剂。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用基因重组人溶菌酶的药效试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为准，用磷酸4-8毫升、硫酸镁1-5克，硫酸钾2-6克，氢氧化钾1-3克，硫酸钙1-3.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的基因重组人溶菌酶浓缩液进行测蛋白、测活性保存。将纯度95％基因重组人溶菌酶浓缩液溶于水中制得30000U/mL。
一、人溶菌酶对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响(1)受试药物人溶菌酶白色粉末，批号020110，3万单位/毫克，由大连奇龙生物技术研究所提供。临用时用无菌双蒸水配成所需浓度。
(2)对照品鸡溶菌酶白色粉末，2万单位/毫克，Lysozyine Sigma L6878.临用时用无菌双蒸水配制。
(3)试剂角叉菜胶，浅黄白色粉末，批号21H0340，Sigam Chemical CO生产。临用时用无菌生理盐水配成1％的浓度。
实验方法选用体重130-150克的健康雄性SD大鼠50只，由四川抗菌素工业研究所动物中心提供。合格证川实动管第99-32号。每笼5只。动物自由饮水，试验室温度控制在22~28℃左右，动物喂饲大鼠标准饲料。随机分成5组，每组10只。测量各鼠正常左后足跖容积。第1组为空白对照组，外涂等容积无菌双蒸水；第2、3、4组为人溶菌酶，剂量分别为120、60、30IU/只；第5组为鸡溶菌酶，剂量为30IU/只。每鼠外涂各组药物(20μl/只)一次后1小时，给大鼠左后足跖皮下注射1％的角叉菜胶0.1ml。致炎后半小时再涂一次药。致炎前和致炎后1、2、4、6小时按微量吸管测量法测定致炎前后大鼠左后足容积。致炎前后足容积差为肿胀度。试验重复一次。
数据处理和统计分析对计量资料，把原始数据按组分别输入Microsoft Excel中，各组结果以算术平均数±标准差表示。根据《新药西药临床前研究指导原则汇编》中的有关新药药效研究中统计处理的指导原则，选择Student t检验进行各用药组均数与模型对照组均数、相同剂量的受试药组与对照品组的差异显著性检验。
试验结果见表1，大鼠外涂人溶菌酶30、60、120IU/只，在致炎后1-4小时内，使由1％角叉菜胶诱发的左后足跖肿胀度明显减轻。说明人溶菌酶具有抗炎作用，重组人溶菌酶不但有杀菌作用，而且有很好的抗炎作用。
表1(1)人溶菌酶对大鼠由角叉菜胶所致足跖肿胀的影响(第一次试验结果)
注经统计学处理，与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
表1(2)人溶菌酶对大鼠由角叉菜胶所致足跖肿胀的影响(第二次试验结果)
注经统计学处理，与空白对照组比较，*P＜0.05。
二、人溶菌酶对巴豆油诱发小鼠耳廓肿胀的影响选用体重27-30克的健康雄性昆明小鼠50只，随机分成5组，每组10只。动物自由饮水。试验室温度控制在22-28℃左右。动物喂饲大鼠标准饲料。第一组为空白对照组；第二、三、四组为人溶菌酶，剂量分别为120、60、30IU/只；第五组为鸡溶菌酶(阳性对照)，30IU/只。首先，各组小鼠全部右耳内侧涂1％巴豆油30μL致炎，(巴豆油，浅棕色油状液体，药用级，批号000309，由江西吉水县华宝天然药用厂生产。临用前用乙醇∶水∶乙醚25∶5∶70混合溶媒配制成1％浓度备用。)半小时后分别用双蒸水20μl、人溶菌酶(6000IU/ML)20μl、人溶菌酶(3000IU/ML)20μl、人溶菌酶(1500IU/ML)20μl、鸡溶菌酶(1500IU/ML)20μl涂抹各组小鼠右耳内侧。致炎后4小时将小鼠脱颈椎致死，沿耳廓基线剪下左右两耳片，用8mm打孔器冲下两耳片，精确称重，左右耳片重量之差为肿胀度。经T检验，比较药物组与空白对照组的差异，并求出抑制率。试验重复一次。
试验结果见表17-22。小鼠经外涂人溶菌酶120、60、30IU/只，使小鼠由巴豆油诱发耳廓肿胀度明显减轻，经T检验，药物组与空白对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)。结果表明人溶菌酶具有抗炎作用。
表17-22 人溶菌酶对巴豆油诱发小鼠耳廓肿胀的影响
注与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
三、外用基因重组人溶菌酶喷雾剂治疗瘙痒症的疗效观察1、病例选择；全部病例40人均为门诊长期治疗不愈患者，年龄50～80岁，性别不限，男性29例，女性11例，平均年龄65岁，明确诊断为皮肤无原发损害而先有痒感，继发抓痕、血痂、苔藓样变及色素沉着等(参照王光超主编皮肤病及性病学)，临床症状及体证符合瘙痒症的诊断。病程6年至13年，平均9年。瘙痒部位主要分布在全身性瘙痒症；主要见于两小腿伸侧，其次为两大腿身侧，再次为发展到两上肢身侧，严重者可遍布全身，包括前胸、后背等。局部性瘙痒症；主要见于肛门瘙痒，阴囊瘙痒，女阴瘙痒。排除标准；皮肤原发有损伤而有瘙痒症的患者。
2、治疗方法；将患者按皮损严重程度分轻、中、重度三组，轻度瘙痒症皮肤无损伤而有瘙痒感为主，中度瘙痒症皮肤有继发抓痕、血痂为主，重度瘙痒症皮肤有血痂、苔藓样变及色素沉着等为主。三组患者各收集10例，均外用大连奇龙生物技术研究所生产的基因重组人溶菌酶喷雾剂，2次/天，疗程为20天，三组患者均于每次用药治疗后观察记录瘙痒感部位止痒时间、止痒程度和皮肤变化情况。对照组选瘙痒症轻、中、重度混杂的患者10例，用天津天骄制药有限公司生产的“乐肤液”作对照治疗，2次/天，疗程为20天。
3、疗效判定标准；痊愈为每次用药后1～10分钟止痒、疗程结束后皮肤抓痕、血痂、苔藓样变及色素沉着等消失，皮肤恢复正常。疗程结束后10天瘙痒部位不痒。有效为每次用药后1～10分钟止痒，疗程结束后瘙痒部位还痒。无效为每次用药后不止痒。
结果基因重组人溶菌酶喷雾剂治疗瘙痒症疗效轻度组痊愈10例，痊愈率100％，总有效率100％。中度组痊愈8例，有效2例，痊愈<p>表2鱼类
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的描述实施例1基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为准，用磷酸6毫升、硫酸镁3克，硫酸钾4克，氢氧化钾1克，硫酸钙1.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20℃，在恒温床上培养36小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的基因重组人溶菌酶浓缩液冰冻干燥，测定蛋白量、纯度和溶菌酶活性保存。
将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得1500U/mL/g，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、15％丙二醇、1％水溶性氮酮、万分之五吐温80，在常温下混合均质，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程制成喷雾剂。
实施例2按照实施例1所述方法制得基因重组人溶菌醇，将纯度97％的基因重组人溶菌酶制得30000U/mL/g，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)84％、13％丙二醇、2％水溶性氮酮、万分之五吐温80，在常温下混合均质，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程制成滴剂。
实施例3按照实施例1所述方法制得基因重组人溶菌酶，将纯度98％的基因重组人溶菌酶制得100000U/mL/g，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)78％、21％丙二醇、1％水溶性氮酮、万分之五吐温80，在常温下混合均质，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程制成滴剂。
实施例4按照实施例1所述方法制得基因重组人溶菌酶，将纯度96％的基因重组人溶菌酶制得15万ml/g备用，其他原料为16％(重量百分比)丙二醇、11％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、4％水溶性氮酮、羊毛脂3％、70％凡士林。具体制法为分别称取羊毛脂、凡士林、水溶性氮酮、吡咯烷酮-5-羧酸钠、丙二醇，并于120℃高压灭菌30min，待温度降至60～70度，分别过虑、除杂、除菌备用。待温度降至50度时，称取重组人溶菌酶混合均质，最后到入凡士林中其它原料搅拌、混合均质，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程制成软膏剂。
实施例5按照实施例1所述方法制得基因重组人溶菌酶，将纯度96％的基因重组人溶菌酶制得22万ml/g备用，分别称取2％羊毛脂、65％凡士林、3％水溶性氮酮、8％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、22％丙三醇，并于120℃高压灭菌30min，待温度降至60～70度，分别过虑、除杂、除菌备用。待温度降至50度时，称取重组人溶菌酶混合均质，最后到入凡士林中其它原料搅拌、混合均质，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程制成软膏剂。
实施例6按照实施例1所述方法制得基因重组人溶菌酶，将纯度96％的基因重组人溶菌酶制得30万ml/g备用，分别称取4％羊毛脂、70％凡士林、2％水溶性氮酮、14％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、10％丙二醇，并于120℃高压灭菌30min，待温度降至60～70度，分别过虑、除杂、除菌备用。待温度降至50度时，称取重组人溶菌酶混合均质，最后到入凡士林中其它原料搅拌、混合均质，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程制成软膏剂。
权利要求
1.人溶菌酶在制备治疗瘙痒症的药物中的应用。
2.人溶菌酶在制备治疗由各种炎症性或非炎症性引起的瘙痒症的药物中的应用。
3.人溶菌酶在制备治疗冬季瘙痒症或老年瘙痒症的药物中的应用。
4.根据权利要求1、2或3所述的人溶菌酶在制备治疗瘙痒症的药物中的应用，其特征是人溶菌酶为基因工程表达的重组人溶菌酶或基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶或基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
5.根据权利要求1、2或3所述的人溶菌酶在制备治疗瘙痒症的药物中的应用，其特征是药物中含有人溶菌酶1500U～30万U/mL/g。
6.根据权利要求1、2或3所述的人溶菌酶在制备治疗瘙痒症的药物中的应用，其特征是药物可按常规制剂方法制成喷雾剂、滴剂或软膏剂。
7.根据权利要求6所述的人溶菌酶在制备治疗瘙痒症的药物中的应用，其特征是将纯度95％的基因重组人溶菌酶制得1500U～30万U/mL，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)75～85％、5～25％丙二醇、1～5％水溶性氮酮、万分之五吐温80，在常温下混合均质，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程制成喷雾剂或滴剂。
8.根据权利要求6所述的人溶菌酶在制备治疗瘙痒症的药物中的应用，其特征是将纯度95％～99％的基因重组人溶菌酶制得1500U～30万U/ml/g备用，分别称取5～25％丙二醇或丙三醇、5～15％ 2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、1～5％水溶性氮酮、羊毛脂1～5％、65～75％凡士林，并于120℃高压灭菌30min，待温度降至60～70度，分别过虑、除杂、除菌备用，待温度降至50度时，称取重组人溶菌酶混合均质，最后倒入凡士林中其它原料搅拌、混合均质，制成软膏剂。
全文摘要
本发明涉及人溶菌酶的新用途，实际上是人溶菌酶在制备治疗瘙痒症的药物中的应用。药物可做成喷雾剂、滴剂、软膏剂等。本发明基因重组人溶菌酶发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。基因重组人溶菌酶它起效快，药效延续时间长，无刺激、无过敏反映，不产生耐药性、不产生激素效应、安全无毒副作用，使用方便，并且基因重组人溶菌酶来源丰富，制备工艺简单，有很好的药用前景，是今后治疗皮肤瘙痒症的新选择。
文档编号A61K9/06GK1679927SQ200510045709
公开日2005年10月12日 申请日期2005年1月17日 优先权日2005年1月17日
发明者张华 申请人:张华