专利名称：肝细胞生长因子在预防或治疗组织粘连中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及肝细胞生长因子在预防或治疗组织粘连中的应用。
背景技术：
外科手术后肠粘连或盆腔手术后盆腔粘连仍然是临床上难以解决的困难之一。70-80％的粘连是由于外科手术造成的，术后肠粘连或盆腔粘连可造成肠梗阻、女性不孕及局部反复长期的疼痛等，严重者不得不进行二次手术。目前，术后组织粘连的防治研究中发现，抗生素、抗组织胺及皮质激素等抗炎药物，葡聚糖及组织纤溶酶原激活剂在防治术后组织粘连中有一定作用；研究中还发现有一些能被组织分解吸收的局部屏障剂如壳聚糖也有一定的效果，但疗效并不显著并且存在一定的副作用。
组织粘连形成具有很复杂的病理过程，一般大致的认识是腹腔或盆腔内组织或器官的浆膜(间皮层)的损伤造成局部毛细血管通透性增加及炎性物渗出，因而在损伤处由于血凝块和纤维蛋白酶的渗出，使组织器官发生有机化而形成永久粘连。
综上所述，预防或治疗组织粘连非常重要，如何防治手术后组织粘连目前仍是医学中的一大难题。
发明内容
本发明人发现肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)在预防或治疗术后组织粘连中出人意料的具有良好效果。
因此，本发明涉及肝细胞生长因子在制备用于预防或治疗术后组织粘连的药物中的用途。
根据本发明，优选本发明中的肝细胞生长因子是人肝细胞生长因子。
进一步，本发明中的肝细胞生长因子以携带肝细胞生长因子基因的重组质粒或重组腺病毒形式使用。
优选本发明的重组质粒中人肝细胞生长因子基因受巨细胞病毒启动子、牛生长激素基因的聚腺苷酸信号调控。
在本发明中含肝细胞生长因子的药物可以制成注射液、涂抹液、喷雾剂或贴膜(例如以可吸收性材料为载体制成贴膜)等形式使用。
根据本发明，本发明中所述的组织粘连是指腹腔手术后肠粘连、盆腔手术后盆腔粘连和其它组织受创后的粘连等组织粘连。
本发明的药物中除肝细胞生长因子外，根据需要还可含有本领域技术人员已知的制药中常用的药物助剂，如赋形剂、稳定剂、防腐剂、载体等。
本发明还涉及一种用于防治组织粘连的方法，该方法包括将携带人肝细胞生长因子基因的重组质粒或重组腺病毒给予需防治组织粘连的患者。
本发明中优选的重组质粒是含有人HGF基因的表达质粒pcDNA3H和pUDKH，手术后局部涂抹或喷雾后，证实其具有防治手术后组织粘连的功效。
本发明中还优选E1、E3缺失的重组腺病毒介导HGF基因(Ad-HGF)进行防治组织粘连研究，结果表明Ad-HGF同样具有防治组织粘连的功效。
应用本发明提供的方法，用携带人肝细胞生长因子基因的重组质粒pcDNA3H和/或pUDKH，向患者体内导入人肝细胞生长因子基因，达到防治组织粘连的目的。因此应用本发明提供的方法应用重组质粒防治组织粘连比以往的防治手段更具有科学性，疗效更明确。本发明为目前尚无较好防治手段的组织粘连的临床治疗提供一种有效的防治手段，这种疗法较以往的防治手段更具有科学性，疗效更明确。
下面的实施例将通过描述携带人肝细胞生长因子的重组质粒或重组腺病毒对大鼠肠粘连的防治作用来进一步阐述本发明。
实施例1.携带人肝细胞生长因子基因的重组质粒pcDNA3H以及pUDKH或重组腺病毒Ad-HGF(1)pcDNA3H质粒的构建用常规分子生物学技术，从人胎盘cDNA文库(购自Clontech公司，美国)中通过多聚酶链反应(PCR)(上游引物为5’-ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc-3’，下游引物为5’-tgggatccgccgccgcctatgactgtggtacctt-3’)分离得到人HGF编码区cDNA(2184bp)，然后将其亚克隆至真核表达载体pcDNA3(购自Invitrogen公司，美国)的多克隆位点(BamH I，Apa I位点)，获得携带人肝细胞生长因子基因的重组载体pcDNA3H，人肝细胞生长因子基因受CMV启动子调控。用限制性内切酶Not I和Hind III从载体pEGFP-N1(购自Invitrogen公司，美国)上切下EGFP(绿色荧光蛋白)基因序列，并将其克隆至载体pcDNA3的多克隆位点(Not I，Hind III位点)，获得携带EGFP的质粒pcDNA3-GFP，用于质粒转染靶组织效率的观察。
(2)pUDKH质粒的构建i.用PCR方法从人胎盘cDNA文库(购自Clontech公司，美国)中扩增肝细胞生长因子cDNA。按文献报道的人肝细胞生长因子HGF cDNA序列设计引物，从人胎盘cDNA文库克隆人肝细胞生长因子基因。测序并进行综合分析，将测得的人HGF全长cDNA序列与Gene Bank已公布的人HGF全长cDNA序列进行比较分析表明，我们克隆的人HGFcDNA序列与GeneBank已公布的人HGF全长cDNA序列完全一致。PCR产物克隆至pBluescript SK(+)(pSK)载体中，命名为pSK-HGF。
ii.构建带有卡那抗性基因、CMV启动子、多克隆位点和polyA加尾信号的用于插入HGF基因的表达载体(pUDK)。首先用内切酶Pac I从载体pShuttle-CMV(Stratagene公司，美国)上切下含卡那抗性基因(Kan+)、pBR322复制子区域的片段(-2930bp)，回收、末端补平并去除5’-P；再用内切酶Pvu II和Nru I依次酶切pcDNA3质粒，回收含CMV启动子、多克隆位点和polyA加尾信号的片段(-1080bp)；最后将上述2个片段连接并转化大肠杆菌DH5α感受态，用常规分子生物学方法鉴定阳性重组子。所得质粒命名为pUDK。
iii.构建携带HGF基因的基因治疗用载体pUDKH.先用内切酶EcoRV酶切pUDK质粒，去除5’-P后回收；再用BamH I和Apa I依次酶切pSK-HGF质粒，回收HGF基因片段(-2200bp)，末端补平后再回收；上述2个片断连接并转化大肠杆菌DH5α感受态，用常规分子生物学方法鉴定阳性重组子，保存菌种。所得质粒命名为pUDKH。HGF的表达装置依次为CMV启动子、人HGF cDNA、BGH polyA信号。
用EcoRI，PvuII，KpnI，及HindIII4种限制性内切酶对构建完成的质粒进行进一步的酶切鉴定，最终结果表明质粒pUDKH构建成功。
pUDKH的构建过程如
图1用HindIII，NotI限制性内切酶从载体pcDNA3-GFP(参见(1))切下GFP(绿色荧光蛋白)基因序列，并将其克隆至载体pUDK的HindIII，NotI多克隆位点，获得携带GFP的质粒，pUDK-GFP用于质粒转染靶组织效率的观察。
以上所有限制性内切酶和DNA连接酶均购自宝生物工程(TaKaRa)公司。
(3)质粒的制备、纯化及质量控制用本领域的常规技术方法，将pcDNA3H、pUDKH质粒以及pcDNA3-GFP和pUDK-GFP分别转化常规的感受态细菌(例如大肠杆菌DH5α)，然后大规模发酵细菌扩增质粒，离心回收菌体，采用碱变性法提取重组质粒，层析法大规模纯化质粒，琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法确定DNA的纯度和含量。获得所需的质粒用于下述实验。
(4)重组腺病毒Ad-HGF的构建与制备将HGF cDNA克隆至pXCJL1-CMV/pA(含有CMV启动子、PolyA信号以及腺病毒基因组左端序列的穿梭质粒，由美国百特医疗用品公司基因治疗部提供)载体的Hind III和Not I位点之间，从而获得携带人肝细胞生长因子基因表达盒以及腺病毒基因组左端序列的穿梭质粒(pXCJL1-CMV/pA-HGF)。然后用LipofectAMIN(购自GIBCO公司，美国)介导pXCJL1-CMV/PA-HGF和GT4050(含有E1区、E3区及包装信号区缺失的复制缺陷型5型腺病毒基因组的质粒，由美国百特医疗用品公司基因治疗部提供)共转染293细胞(以腺病毒E1基因转化的人胚肾细胞系，ATCC)，当出现明显细胞病变效应(CPE)后，用噬斑分析法筛选单克隆重组腺病毒，PCR法鉴定阳性重组腺病毒，并将其在293细胞中扩增后用氯化铯密度梯度离心法纯化。然后通过测定260nm和280nm光吸收、快速CPE分析及噬斑分析确定病毒的纯度和感染滴度。
Ad-GFP(携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒，由美国百特医疗用品公司基因治疗部提供)，制备同Ad-HGF，用于重组腺病毒转染靶组织效率的观察。
2.HGF重组质粒或重组腺病毒对术后肠粘连的防治作用的效果观察(1)pcDNA3H，pUDKH或重组腺病毒Ad-HGF对术后肠粘连的防治作用i.模型制备及基因转移Wistar大鼠(军事医学科学院动物实验中心提供)，体重200-250g。腹腔麻醉后暴露盲肠，并用消毒纱布擦拭至有均匀出血点为止，并即刻分别将200μg pcDNA3-GFP或100μg、200μg pcDNA3H重组质粒；100μg pUDK-GFP或100μg pUDKH重组质粒；重组腺病毒Ad-GFP(1×108pfu)或Ad-HGF(1×108pfu，1×109pfu)局部涂擦于创伤的盲肠表面。对照组涂抹同体积磷酸盐缓冲液。
ii.重组质粒或重组腺病毒转染效率观察术后转移pcDNA3-GFP重组质粒后第3天、第6天将局部盲肠间皮剥离，在荧光显微镜下观察GFP表达。结果，第3天即可见散在或成片的GFP表达荧光，第6天同样有散在或成片的GFP表达荧光；术后于转染pUDK-GFP重组质粒后第3天、第6天将局部盲肠间皮剥离，在荧光显微镜下观察GFP蛋白表达。结果，第3天即可见散在或成片的绿色荧光表达，第6天同样有散在或成片的绿色荧光表达，第10天见绿色荧光已明显减弱；术后转移Ad-GFP后第3天、第6天将局部盲肠间皮剥离，在荧光显微镜下观察GFP表达。结果，第3天可见较强的GFP表达荧光，第6天荧光有所减弱。
iii.效果分析术后14天，依据文献(A Ar’Rajab，B Aheren，J Rozga，andS Bengmark.Phosphatidylcholine Prevents Postoperative PeritonealAdhesionsAn Experimental Study in the Rat. J SurgicalReseach，1991，50，212-215)评价标准判断粘连程度0度 无粘连带1度 有一条粘连带或容易分离的细粘连2度 有二条粘连带或粘连带能抵抗拉力3度 广泛粘连涉及邻近的肠系膜、肠管或其他腹腔内脏器4度 脏器直接粘连到腹壁质粒pcDNA3H，pUDKH和Ad-HGF防治肠粘连形成的效果
注不同剂量的pcDNA3H，pUDKH和Ad-HGF均溶于100ul PBS中iv.结论实验结果表明，pcDNA3-GFP，pUDKH-GFP或Ad-GFP可有效转染盲肠间皮细胞，pcDNA3H，pUDKH和Ad-HGF可有效防治大鼠手术后肠粘连的发生，减轻粘连的程度。
(2)pUDKH质粒对术后子宫粘连的防治作用i.子宫粘连模型的制备开腹后的大鼠将子宫角(双测)靠近体部的1cm长区域的浆膜用新的手术刀片反复刮3次，见出现均匀密布的点状出血后，将30μg质粒pUDKH溶于50μl的生理盐水中涂抹于创伤表面，对照组用50μl生理盐水涂抹。以上完成后，常规关腹。
ii.评价标准以大网膜或其它组织粘连于损伤区域的面积占损伤区域的面积的百分比来计算。
iii.评价结果质粒pUDKH防治子宫粘连连形成的效果
iv.结论实验结果表明质粒pUDKH可有效防治大鼠手术后子宫粘连的发生，减轻粘连的程度。
根据以上结果说明，本发明涉及的肝细胞生长因子确实具有预防和治疗组织粘连的作用。
权利要求
1.肝细胞生长因子在制备用于预防或治疗术后组织粘连的药物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述的肝细胞生长因子以携带肝细胞生长因子基因的重组质粒或重组腺病毒形式使用。
3.权利要求2的用途，其特征在于所述的肝细胞生长因子是人肝细胞生长因子。
4.权利要求3的用途，其特征在于重组质粒为pcDNA3H。
5.权利要求3的用途，其特征在于重组质粒为pUDKH。
6.权利要求3的用途，其特征在于重组腺病毒为Ad-HGF。
7.权利要求3的用途，其中重组质粒中肝细胞生长因子基因受巨细胞病毒启动子、牛生长激素基因的聚腺苷酸信号调控。
8.权利要求1-7任一项中的用途，其中的药物可以制成注射液、涂抹液、喷雾剂或贴膜等形式使用。
9.权利要求1-7任一项中的用途，其中所述的组织粘连选自腹腔手术后肠粘连、盆腔手术后盆腔粘连和其它组织受创后粘连。
10.权利要求8的用途，其中所述的组织粘连选自腹腔手术后肠粘连、盆腔手术后盆腔粘连和其它组织受创后粘连。
全文摘要
本发明涉及生物学医学领域，具体地说是涉及肝细胞生长因子在防治或治疗组织粘连中的应用。将人肝细胞生长因子全长编码区cDNA插入到质粒载体(pcDNA3或pUDK或其它)中，或插入到腺病毒(如Ad5或gutless腺病毒)载体中，获得携带人肝细胞生长因子基因的重组质粒或重组腺病毒。该重组质粒或重组腺病毒经局部涂抹于腹腔或盆腔手术后，可防治术后肠粘连或盆腔粘连或其它组织粘连。因此，该携带人肝细胞生长因子基因的重组质粒或重组腺病毒在防治或治疗术后组织粘连中具有极好的应用前景。
文档编号A61K38/18GK1698885SQ20051006876
公开日2005年11月23日 申请日期2005年5月12日 优先权日2004年5月14日
发明者刘红军, 吴祖泽, 哈小琴, 吴彬, 毕建进, 唐仲雄, 王立生, 鲁茁壮, 段海峰 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所, 北京丰原联合医药科技发展有限公司