利用nogo受体拮抗剂治疗涉及多巴胺能神经元退变的疾病的制作方法

专利名称：利用nogo受体拮抗剂治疗涉及多巴胺能神经元退变的疾病的制作方法
专利说明利用NOGO受体拮抗剂治疗涉及多巴胺能神经元退变的疾病 发明领域 本发明涉及神经生物学和药理学。更具体地，它涉及通过施用Nogo受体-1拮抗剂治疗有关多巴胺能神经元退变的疾病。

背景技术：
某些神经退行性病症的特征是多巴胺神经元的退变。例如，帕金森病与中脑黑质中多巴胺神经元的进行性破坏相关联。这种破坏导致化学递质多巴胺的水平降低。帕金森病的身体症状包括随意运动的损害以及肌肉群不可控制的节律性颤搐，该颤搐产生特征性颤动。
对于帕金森病使用最广泛的治疗是施用多巴胺前体，左旋多巴(L-3，4-二羟基苯丙氨酸)，其通过替代流失的多巴胺而间接地起作用。不过，左旋多巴的使用有缺陷。患者经常遭受诸如运动障碍、恶心、呕吐、腹胀等副作用以及精神病学副作用的痛苦，并且随着时间的推移患者一般变得对左旋多巴更不具反应性。利用突触后多巴胺激动剂的备选治疗形式也有副作用。另外，尽管左旋多巴治疗提高了患者的生活质量，但并未停止疾病进程。
其它化合物，如胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)，已经显示当通过慢速输注递送时有希望用于治疗人类患者中的帕金森病。见，例如，Gill等，″Direct brain infusion of glial cell linederived neurotrophic factor inParkinson disease，″Nature Med.9589-95(2003)。不过，这些治疗方案仍然处于发展早期。
许多其它疾病和病症可以涉及多巴胺能神经元的退变。这些包括多系统萎缩症，纹状体黑质退变，橄榄桥脑小脑萎缩，香-德综合征(Shy-Dragersyndrome)，具有帕金森病特征的运动神经元病，Lewy小体痴呆，进行性核上麻痹，皮层-基底神经节退变，额颞性痴呆，伴随帕金森氏综合征的阿尔茨海默氏病，威尔逊病，苍白球色素性退变综合征(Hallervorden-Spatzdisease)，Chediak-Hagashi病，SCA-3脊髓小脑共济失调，与X染色体连锁的张力障碍帕金森氏综合征(DYT3)，亨廷顿病(Westphal变体)，朊蛋白病，血管性帕金森氏综合征，大脑性麻痹，重复头外伤，脑炎后帕金森氏综合征和神经梅毒。
因此，对于帕金森病以及其它病症的其它治疗方法一直有所需求，所述其它病症的特征是多巴胺能神经元的退变。
发明概述 本发明涉及通过施用Nogo受体-1拮抗剂治疗涉及多巴胺能神经元退变的病症，包括帕金森病的方法。
在一些实施方案中，本发明提供了促进哺乳动物中多巴胺能神经元的再生或存活的方法，所述哺乳动物呈现多巴胺能神经元退变的征象或症状，所述方法包括向哺乳动物给药治疗上有效量的NgR1拮抗剂。
在一些实施方案中，将所述NgR1拮抗剂直接给药到中枢神经系统中。在一些实施方案中，所述NgR1拮抗剂直接给药到黑质或纹状体中。在一些实施方案中，通过快速浓注(bolus injection)或慢速输注(chronic infusion)给药所述NgR1拮抗剂。
在一些实施方案中，所述NgR1拮抗剂包含可溶形式的哺乳动物NgR1。在一些实施方案中，可溶形式的哺乳动物NgR1包含人NgR1的氨基酸26-310(SEQ ID NO3)，具有高至十个保守性氨基酸取代并缺失功能性跨膜结构域和功能性信号肽。在一些实施方案中，可溶形式的哺乳动物NgR1包含人NgR1的氨基酸26-344(SEQ ID NO4)，具有高至十个保守性氨基酸取代并缺失功能性跨膜结构域和功能性信号肽。在一些实施方案中，可溶形式的哺乳动物NgR1包含大鼠NgR1的氨基酸27-310(SEQ ID NO5)，具有高至十个保守性氨基酸取代并缺失功能性跨膜结构域和功能性信号肽。在一些实施方案中，可溶形式的哺乳动物NgR1包含大鼠NgR1的氨基酸27-344(SEQ ID NO6)，具有高至十个保守性氨基酸取代并缺失功能性跨膜结构域和功能性信号肽。
在一些实施方案中，可溶形式的哺乳动物NgR1进一步包含融合部分。在一些实施方案中，所述融合部分为免疫球蛋白部分。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白部分是Fc部分。
在一些实施方案中，用于本发明的方法中的NgR1拮抗剂包含结合哺乳动物NgR1的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体选自多克隆抗体，单克隆抗体，Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，Fv片段，Fd片段，双抗体(diabody)，以及单链抗体。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合到一种多肽上，所述多肽被选自HB7E11(ATCC编号PTA-4587)，HB1H2(ATCC编号PTA-4584)，HB 3G5(ATCC编号PTA-4586)，HB5B10(ATCC编号PTA-4588)和HB2F7(ATCC编号PTA-4585)的杂交瘤产生的单克隆抗体结合。在一些实施方案中，所述单克隆抗体由HB7E11杂交瘤生产。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合这样一种多肽，其包含选自下列的氨基酸序列AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQ ID NO7)；LDLSDNAQLR(SEQID NO8)；LDLSDDAELR(SEQ ID NO9)；LDLASDNAQLR(SEQ ID NO10)；LDLASDDAELR(SEQ ID NO11)；LDALSDNAQLR(SEQ ID NO12)；LDALSDDAELR(SEQ ID NO13)；LDLSSDNAQLR(SEQ ID NO14)；LDLSSDEAELR(SEQ ID NO15)；DNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO16)；DNAQLR(SEQ ID NO17)；ADLSDNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO18)；LALSDNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO19)；LDLSDNAALRVVDPTT(SEQ IDNO20)；LDLSDNAQLHVVDPTT(SEQ ID NO21)；和LDLSDNAQLAVVDPTT(SEQ ID NO22)。
在一些实施方案中，用于本发明的方法中的NgR1拮抗剂的治疗有效量为0.001mg/kg-10mg/kg。在一些实施方案中，所述治疗有效量为0.01mg/kg-1.0mg/kg。在一些实施方案中，所述治疗有效量为0.05mg/kg-0.5mg/kg。
在一些实施方案中，多巴胺能神经元退变与选自帕金森病，多系统萎缩症，纹状体黑质退变，橄榄桥脑小脑萎缩，香-德综合征，具有帕金森病特征的运动神经元病，Lewy小体痴呆，进行性核上麻痹，皮层-基底神经节退变，额颞性痴呆，伴随帕金森氏综合征的阿尔茨海默氏病，威尔逊病，苍白球色素性退变综合征，Chediak-Hagashi病，SCA-3脊髓小脑共济失调，与X染色体连锁的张力障碍帕金森氏综合征(DYT3)，亨廷顿病(Westphal变体)，朊蛋白病，血管性帕金森氏综合征，大脑性麻痹，重复头外伤，脑炎后帕金森氏综合征和神经梅毒的疾病或病症相关联。
在一些实施方案中，本发明提供治疗帕金森病的方法，包括向哺乳动物给药治疗上有效量的NgR1拮抗剂。
附图简述

图1A显示在用盐酸6-羟基多巴胺(6OHDA)单侧注射入纹状体4周后与杂合体和野生型同窝出生仔畜对照相比在Nogo受体敲除小鼠中多巴胺能神经元的存活。在受损黑质中的酪氨酸(TH)阳性神经元的数目表示为TH阳性神经元数目在对侧完好黑质中的百分比。图1B显示在单侧注射6OHDA入纹状体4周后用sNgR(310)Fc处理的大鼠中多巴胺能神经元的存活。在受损黑质中的酪氨酸(TH)阳性神经元的数目表示为TH阳性神经元数目在对侧完好黑质中的百分比。
图2A显示在对侧注射6OHDA入纹状体四周后与杂合体和野生型同窝出生仔畜对照相比在Nogo受体敲除小鼠中安非他明诱导的转动行为减少。图2B显示在对侧注射6OHDA入纹状体7，14，21和28天后与媒介物处理的对照相比在用sNgR(310)Fc处理的大鼠中安非他明诱导的转动行为减少。
图3显示在单侧注射6OHDA入纹状体4周后在用sNgR(310)Fc处理的大鼠中纹状体多巴胺水平提高。
发明详述 除非另外定义，本文所用的技术和科学术语全部都具有与本发明所属领域普通技术人员一般理解相同的意义。在发生冲突时，包括定义的本申请将占优势。另外，除非上下文需要，单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。为了所有目的将本文提及的所有出版物，专利和其它参考文献的全部内容并入作为参考，好像每个个别出版物或专利申请被特定地和单独地指定并入作为参考。
尽管与本文所述的方法和材料类似的那些可以用在实践或本发明的测试中，下面还是描述了合适的方法和材料。所述材料，方法和实施例仅是说明性的而且并不意欲成为限制性的。由详细描述以及由权利要求书本发明的其它特征和优点将是显而易见的。
在整个本发明书和权利要求书中，用词“包含(comprise)”，或变异形式如“comprises”或“comprising”，表示包括任何列举的整体或整体组，但不排除任何其它整体或整体组。
为了进一步定义本发明，提供下列术语和定义 如本文所用的，“抗体”意为完整的免疫球蛋白，或其抗原结合片段。本发明的抗体可以是任何同种型或类型的(例如，M，D，G，E和A)或任何亚类(例如，G1-4，A1-2)并且能够具有kappa(κ)或lambda(λ)轻链。
如本文所用的，“人源化抗体”意为一种抗体，其中至少一部分非人序列被人序列所替代。如何制备人源化抗体的例子可以见于美国专利号6,054,297，5,886,152和5,877,293。
如本文所用的，“治疗上有效的量”指实现所需治疗结果所必需的在剂量上以及时间上有效的量。
如本文所用的，“预防上有效的量”指实现所需预防结果所必需的在剂量上以及时间上有效的量。一般，由于预防剂量是在疾病之前或早期用于受试者，所述预防上有效的量将比治疗上有效的量更少。
如本文所用的，“患者”意为哺乳动物，例如，人。
如本文所用的，“融合蛋白”意为包含融合至另一多肽，一般是异源多肽的多肽的蛋白质。
如本文所用的，“Nogo受体拮抗剂”意为抑制Nogo受体1与配体(例如，NogoA，NogoB，NogoC，mAG，OM-gp)结合的分子。
如本文所用的，“Nogo受体多肽”包括全长Nogo受体1蛋白及其片段。
本发明是基于这样的发现，即用Nogo受体拮抗剂处理使得损伤后多巴胺能途径的恢复改善以及缘自多巴胺能神经元退变症状的显著改善。
Nogo受体拮抗剂 任何Nogo受体拮抗剂都可以用在本发明的方法中。例如，可以用在本发明方法中的Nogo受体拮抗剂包括，但不限于可溶性Nogo受体多肽；针对Nogo受体蛋白的抗体及其抗原结合片段；和小分子拮抗剂。
可溶性Nogo受体-1多肽 在本发明的一些实施方案中，所述拮抗剂是可溶性Nogo受体-1多肽(Nogo受体-1也不同地称为“Nogo受体”，″NogoR″，″NogoR-1″，″NgR″和″NgR-1″)。全长Nogo受体-1由信号肽，N-末端区(NT)，八个亮氨酸富集重复(LRR)，LRRCT区(八个亮氨酸富集重复C末端的亮氨酸富集重复结构域)，C末端区(CT)和GPI锚定区。全长人和大鼠Nogo受体的序列显示于表1中。
表1.人和大鼠Nogo受体-1多肽的序列 用在本发明方法中的可溶性Nogo受体多肽包含NT结构域；8个LRRs，和LRRCT结构域，并且缺少信号序列以及功能性GPI锚定区(即，无GPI锚定区或不能有效连接到细胞膜上的GPI锚定区)。合适的多肽包括，例如，人Nogo受体的氨基酸26-310(SEQ ID NO3)和26-344(SEQ ID NO4)以及大鼠Nogo受体的氨基酸27-310(SEQ ID NO5)和27-344(SEQ IDNO6)(表2)。可以用于本发明方法中的其它多肽在，例如，国际专利申请PCT/US02/32007和PCT/US03/25004中进行了描述。
表2.来自人和大鼠的可溶性Nogo受体多肽 作为融合蛋白的组分的可溶性Nogo受体多肽也可以用在本发明的方法中。在一些实施方案中，融合蛋白的外源部分是免疫球蛋白恒定结构域。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白恒定结构域是重链恒定结构域。在一些实施方案中，所述异源多肽是Fc片段。在一些实施方案中，所述Fc连接到可溶性Nogo受体多肽的C末端。在一些实施方案中，所述融合Nogo受体蛋白是二聚体。
抗体 可以利用特异性结合免疫原性Nogo受体-1多肽并抑制Nogo受体-1结合配体(例如，NogoA，NogoB，NogoC，mAG，OM-gp)的抗体或其抗原结合片段实施本发明的方法。可以体内或体外生产用在本发明方法中的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段是鼠或人的。在一些实施方案中，所述抗Nogo受体-1抗体或其抗原结合片段是重组的，改造的，人源化的和/或嵌合的。在一些实施方案中，所述抗体选自在国际专利申请号PCT/US03/25004中所述的抗体。可用于本发明的抗体可以进行修饰或不进行修饰而使用。
可以用在本发明方法中的抗体的示例性抗原结合片段为Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv，Fd，dAb，和包含互补性决定区(CDR)片段的片段，单链抗体(scFv)，嵌合抗体，双抗体以及包含至少一部分免疫球蛋白的多肽，所述免疫球蛋白足以赋予抗原与多肽(例如，免疫粘合素)的特异性结合。
如本文所用的，Fd意为由VH和CH1结构域组成的片段；Fv意为由单臂抗体的VL和VH结构域组成的片段；而dAb意为由VH结构域组成的片段(Ward等，Nature 341544-46(1989))。如本文所用的，单链抗体(scFv)意为一种抗体，其中VL区和VH区通过合成性接头配对形成单价分子，这能够使得它们被制成单一蛋白链(Bird等，Science 242423-26(1988)和Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-83(1988))。如本文所用的，双抗体意为了一种双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单一多肽链上表达，但使用太短而不能允许同一链两个结构域之间配对的接头，由此迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并且生成两个抗原结合位点(见，例如，Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-48(1993)和Poljak等人，Structure 21121-23(1994))。
免疫 用于本发明的方法中的抗体可以通过免疫合适的宿主(例如，脊椎动物，包括人，小鼠，大鼠，绵羊，山羊，猪，牛，马，爬行动物，鱼类，两栖类，以及在鸟类、爬行动物和鱼类的卵中)来生成。这些抗体可以是多克隆的或单克隆的。对于制备抗体的方法的综述，见，例如，Harlow和Lane(1988)，Antibodies，A Laboratory Manual；Yelton等人，Ann.Rev.ofBiochem.，50657-80(1981)；和Ausubel等人(1989)，Current Protocols inMolecular Biology(New YorkJohn Wiley&Sons)。可以通过本领域公知的几种方法中的任何一种决定与免疫原性Nogo受体多肽的免疫反应性，包括，例如，免疫印迹测定法和ELISA。用于本发明的方法中的单克隆抗体可以通过如在例如Harlow和Lane(1988)，同上中所述的标准方法制备。
例如，可以用免疫原性Nogo受体-1多肽加或不加佐剂对宿主进行免疫。合适的多肽在，例如，国际专利申请PCT/US01/31488，PCT/US02/32007和PCT/US03/25004中进行描述。还可以用Nogo受体-1免疫宿主，所述Nogo受体-1与完整或被破坏细胞的细胞膜相联，鉴定结合到Nogo受体-1多肽的抗体。用来生产抗体的其它合适技术包括将淋巴细胞体外接触Nogo受体-1或本发明的免疫原多肽，或备选地，筛选噬菌体或类似载体中的抗体文库。见Huse等人，Science 2461275-81(1989)。
用在本发明方法中的抗Nogo受体-1抗体还可以通过筛选重组组合抗体文库进行分离。用于制备和筛选这些文库的方法是本领域已知的。商业上现有用于生成噬菌体展示文库的的方法和材料(例如，the Pharmacia TMRecombinant Phage Antibody System，目录号27-9400-0 1；Stratagene SurfZAP噬菌体展示试剂盒，目录号240612；以及来自MorphoSys的其它商品)。从重组免疫球蛋白展示文库中筛选和分离抗Nogo受体-1抗体后，可以从展示包装中(例如，从噬菌体基因组中)回收编码选定抗体的核酸并通过标准重组DNA技术亚克隆入其它表达载体中。为了表达通过筛选组合文库分离的抗体，将编码抗体重链和轻链或其可变区的DNA克隆入重组表达载体中并导入宿主细胞中。
Nogo受体拮抗剂的用途 本发明涉及促进哺乳动物中多巴胺能神经元的再生或存活的方法，所述哺乳动物呈现多巴胺能神经元退变的征象或症状。在本发明的一些实施方案中，所述多巴胺能神经元退变与疾病，病症或状况相关联，包括，但不限于，帕金森病。
在优选的实施方案中，所述疾病，病症或状况为帕金森病。
Nogo受体拮抗剂药物组合物 可以将用在本发明的方法中的Nogo受体拮抗剂配制成药物组合物用于向哺乳动物，包括人给药。用在本发明的方法中的药物组合物包含可药用的载体。
可用在这些药物组合物中的可药用的载体包括，例如，离子交换剂，矾土，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白，如人血清白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物性脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，盐或电解液，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯基吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇、羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。
用在本发明的方法中的组合物可以通过任何合适的方法进行给药，例如，肠胃外，心室内，口服，通过吸入喷雾，局部，直肠，鼻，口腔，阴道或通过植入的储存器进行给药。如本文所用的术语“肠胃外”包括皮下，静脉内，肌内，关节内，滑膜内，胸骨内，鞘内，肝内，病灶内和颅内注射或输注技术。在本发明的方法中，所述Nogo受体拮抗剂必须穿越血-脑屏障。这种穿越能够缘自Nogo受体拮抗剂分子自身固有的物理-化学特性，缘自药物制剂中的其它组分，或缘处机械装置如针、插管或手术器具的使用以突破所述血-脑屏障。当所述Nogo受体拮抗剂为可溶性Nogo受体，抗Nogo受体抗体，或其它本来不穿越血-脑屏障的分子时，合适的给药途径为颅内的，例如直接给药入黑质或纹状体中。当所述Nogo受体拮抗剂为本来就穿越血-脑屏障的分子时，给药途径可以是下面所述各种途径中的一种或多种。
用在本发明方法中的组合物的无菌可注射形式可以是水性或油质的悬浮液。可以根据本领域已知的技术利用合适的分散或湿润剂和悬浮剂配制这些悬浮液。所述无菌可注射制品还可以是无菌可注射溶液或在无毒的可以在肠胃外施用的稀释剂和溶剂中的悬浮液，例如作为1，3-丁二醇中的溶液。在可接受媒介物和溶剂中，可以采用的为水，林格溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌混合的油传统上被用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何温和不变的油，包括合成性单或双甘油酯。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物可以用于可注射物的制备，如同天然可药用的油一样，所述天然可药用的油如橄榄油或蓖麻油，特别是其多聚氧乙基化(polyoxyethylated)形式。这些油溶液或悬浮液还可以包含长链醇稀释剂或分散剂，如羧甲基纤维素或类似的分散剂，其一般用于配制可药用的剂量形式，包括乳剂和悬浮液。其它常用的表面活性剂，如Tweens，Spans和其它乳化剂或生物利用率增强剂(其一般用于生产可药用的固体，液体，或者其它剂量形式)也可以用于配制目的。
肠胃外制剂可以是快速灌注剂量，输注或载荷快速灌注剂量其后接维持剂量。这些组合物可以一天给药一次或根据需要进行给药。
用在本发明方法中的某些药物组合物可以以口服上可以接受的形式，包括，例如，胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液进行口服给药。某些药物组合物还可以通过鼻气雾剂或吸入进行给药。可以采用苯甲醇或其它合适的防腐剂，提高生物利用率的吸收促进剂，碳氟化合物，和/或其它常规溶解剂或分散剂将这些组合物制备为在盐水中的溶液。
可以组合载体材料以生产单一剂量形式的Nogo受体拮抗剂的量将根据接受治疗的主体以及特定的给药模式而变化。所述组合物可以作为单剂量，多剂量，或在已确定的时期内以输注进行给药。还可以调节剂量方案以提供最佳所需反应(例如，治疗或预防反应)。
本发明的方法使用Nogo受体拮抗剂的“治疗上有效的量”或“预防上有效的量”。用在本发明方法中的治疗上或预防上有效的量可以根据诸如疾病状态、年龄、性别，和个体体重的因素而变化。治疗上或预防上有效的量还是这样一种量，其中治疗上有益的效果超过了任何毒性或有害效果。
对于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将依赖于多种因素，包括特定的Nogo受体拮抗剂，患者的年龄，体重，一般性健康，性别，和饮食，以及给药时间，排泄速率，药物组合，和要治疗的特定疾病的严重性。医护人员判断这些因素是本领域的普通技术。拮抗剂的量将依赖于要治疗的个别患者，给药途径，制剂类型，所用化合物的特点，疾病的严重性，以及所需效果。通过本领域公知的药理学和药物动力学原理可以确定拮抗剂的量。
在本发明的方法中，一般将Nogo受体拮抗剂进行脑室内，鞘内给药或直接给药到中枢神经系统(CNS)，例如给药到中脑，黑质或纹状体中。可以将根据本发明的方法给药的组合物进行这样的配制，从而每天给药为0.001-10mg/kg体重剂量的Nogo受体拮抗剂。在一些实施方案中，剂量为0.01-1.0mg/kg体重每天。在一些实施方案中，所述剂量为0.05-0.5mg/kg体重每天。
还可以将补充活性化合物掺入到本发明方法中所用的组合物里。例如，可以将Nogo受体抗体或其抗原结合片段，或可溶性Nogo受体多肽或融合蛋白与一种或多种另外的治疗剂共配制和/或共给药。
本发明包括任何将Nogo受体拮抗剂递送到选定靶组织中的任何合适递送方法，包括Nogo受体拮抗剂水溶液的快速浓注或缓释系统的植入。使用缓释植入物减少了反复注射的需要。
用在本发明方法中的Nogo受体拮抗剂可以直接输注到脑中。用于化合物的直接脑输注的各种植入物是已知的并且在向患神经病症的人患者递送治疗性化合物中是有效的。这些包括利用泵，立体植入的，暂时形成空隙的导管，永久颅内导管植入物，以及手术植入的可以生物降解的植入物而向脑内长期输注。见，例如，Gill等人，同上；Scharfen等人，″High ActivityIodine-125 Interstitial Implant For Gliomas，″Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.24(4)583-91(1992)；Gaspar等人，″Permanentless Implants forRecurrent Malignant Gliomas，″Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.43(5)977-82(1999)；66章，577-580页，Bellezza等人，″Stereotactic InterstitialBrachytherapy，″in Gildenberg等人，Textbook of Stereotactic and FunctionalNeurosurgery，McGraw-Hill(1998)；和Brem等人，″The Safety of InterstitialChemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy inthe Treatment of Newly Diagnosed Malignant GliomasPhase I Trial”，J.Neuro-Oncology 26111-23(1995)。
所述组合物还可以包含分散在可以生物降解的载体材料中的Nogo受体拮抗剂，所述载体材料作为对于化合物适合的递送或支持系统而起作用。持续释放载体的合适例子包括以诸如栓剂或胶囊的成形物形式存在的半透过性聚合物基质。可植入的或微囊持续释放基质包括聚丙交酯(美国专利号3,773,319；EP58,481)，L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酰胺的共聚物(Sidman等人，Biopolymers 22547-56(1985))；聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)，乙烯醋酸乙烯酯(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.1298-105(1982))或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP133,988)。
在本发明的一些实施方案中，通过直接输注到脑的合适区域将Nogo受体拮抗剂向患者给药。见，例如，Gill等，″Direct brain inrusion ofglial celllinederived neurotrophic factor in Parkinson disease，″Nature Med.9589-95(2003)。现有可选择的技术并且可以应用来给药根据本发明的Nogo受体拮抗剂。例如可以利用使用Riechert-Mundinger单元和ZD(Zamorano-Dujovny)多用途定位单元立体放置具有Nogo受体拮抗剂的导管或植入物。对比度提高的计算机断层摄影术(CT)扫描，注射120ml的碘苯六醇，350mg碘/ml，切片厚度2mm，能够允许三维多平面处理方案(STP，Fischer，Freiburg，Germany)。这种设备允许在磁共振成像研究的基础上进行设计，合并CT和MRI靶信息用于清楚的靶标确认。
经改进以便和GE CT扫描仪(General Electric Company，Milwaukee，WI)以及Brown-Roberts-Wells(BRW)立体系统(Radionics，Burlington，MA)一起使用的Leksell立体系统(Downs Surgical，Inc.Decatur，GA)可以用于此目的。因而，在当天的早晨，可以将BRW立体框架的环状基底环系到患者的头骨上。用夹在托板上的石墨棒定位器框架以(靶组织)区域中3mm的间隔得到连续的CT切片。计算机化的处理设计程序可以使用石墨棒图象的CT坐标、在VAX 11/780计算机(Digital Equipment Corporation，Maynard，Mass.)上运行，以在CT间隙和BRW间隙之间绘图。实施例 实施例1在大鼠6-羟基多巴胺损害后可溶性Nogo受体(310)-Fc减弱转动行为并且提高纹状体多巴胺水平 利用异氟醚麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠(150-200g，Charles River)并置于立体定位框中。用聚维酮碘和乙醇擦拭手术位点并制造1英寸的中线矢状面切口以暴露前囟。在头骨中于注射位点上面制造小的凿洞并将2μl(生理盐水/0.2％抗坏血酸盐)中的20μg盐酸6-羟基多巴胺(6-OHDA)以座标AP+0.7，中线侧面侧面2.8mm，头骨表面腹面DV-5.5mm处立体输注到左侧纹状体中。利用附着至聚乙烯管的注射器泵以0.5μl/min的速率在4min时间内输注6-OHDA至29号不锈钢套管。输注6-OHDA后，将所述套管再留在原处2min随后缓慢收回。随后将5mm长的alzet脑输注套管穿过同一凿洞植入并利用超强力胶水固定在头骨上。将所述套管连接到预处理的Alzet渗透泵(2004型)上，其包含PBS或50mM sNgR(310)Fc(包含大鼠Nogo受体-1的氨基酸26-310和大鼠Fc片段的融合蛋白；见国际专利申请PCT/US03/25004)，以0.25μl/h的速率持续释放28天。将渗透泵植入颈背的皮下间隔中。利用止血钳(autoclips)闭合切口位点并将大鼠置于加湿的孵育箱中直到从麻醉中恢复。
在6-OHDA输注7，14，21和28天后，用安非他明处理(1mg/kg ip)大鼠并在2小时的时间上测量转动行为。“转动行为”(rotational behavior)是当黑质纹状体多巴胺途径单侧受损的动物被给药多巴胺激动剂如阿朴吗啡(apormorphine)或多巴胺释放剂如安非他明时所展现的行为。动物偏离遭受较大纹状体多巴胺受体刺激的脑侧反复绕圈。转动反应的大小，即进行转动的数目，与黑质纹状体多巴胺途径所受损害的程度直接成比例。见，例如，Fuxe 等人，″Antiparkinsonian drugs and dopaminergic neostriatialmechanismsstudies in rats with unilateral 6-hydroxydopamine-induceddegeneration of the nigro-neostriatal DA Pathway and quantitative recording ofrotational behaviour，”Pharmacol.Ther.[B]241-47(1976)。在最后转动后的至少24小时，通过CO2窒息处死大鼠。快速移除脑并在视交叉后缘切入冠状面。从脑的前部分两侧解剖纹状体并在干冰上冷冻用于通过HPLC/EC测量儿茶酚胺。将脑的后面部分沉浸固定于4％PFA中持续48 h并转移到30％蔗糖中用于冷冻保护直到冷冻切片用于黑质酪氨酸羟化酶免疫组织化学。
用sNgR(310)Fc处理显著提高了多巴胺能神经元在黑质中的存活(图1B)并且显著减少了在纹状体6-OHDA损害后响应安非他明刺激所产生的转动行为(图2B)。与对照相比在sNgR(310)-Fc处理大鼠的受损纹状体中多巴胺水平得以显著提高(图3)。在sNgR(310)Fc处理后完好纹状体中的多巴胺水平并未显著改变。这些数据显示用Nogo受体拮抗剂sNgR(310)-Fc进行处理提高了细胞存活并且增进了损伤后脑中多巴胺途径的恢复。
实施例2在纹状体的6-OHDA损害后在无NgR小鼠中响应阿朴吗啡刺激所产生的转动行为减少 利用氯胺酮和赛拉嗪(分别是100和10mg/kg ip)麻醉雄性或雌性Nogo受体敲除小鼠杂合体和野生型同窝出生仔畜(15-30g)并置于立体定位框中。用聚烯吡酮碘和乙醇擦拭手术位点并制造0.5cm的中线矢状面切口以暴露前囟。在头骨中于注射位点上面制造小的凿洞并将1μl(生理盐水/0.2％抗坏血酸盐)中的10μg盐酸6-羟基多巴胺(6-OHDA)于座标AP+0.7，中线侧面侧面2.8mm，头骨表面腹面DV5.5mm处立体输注到左侧纹状体中。利用附着至聚乙烯管的注射器泵以0.5μl/min的速率在2min时间内输注6-OHDA至29号不锈钢套管。输注6-OHDA后，将所述套管再留在原处2min随后缓慢收回。使用伤口夹闭合切口并将大鼠置于温暖的衬垫上直到从麻醉中恢复。在6-OHDA输注28天后用阿朴吗啡注射大鼠并在30分钟的时间上记录转动行为。在测量转动行为后至少24小时后，通过CO2窒息处死大鼠。快速移除脑并在视交叉后缘切入冠状面。将脑的后面部分沉浸固定于4％PFA中持续48h并转移到30％蔗糖中用于冷冻保护直到冷冻切片用于黑质酪氨酸羟化酶免疫组织化学。
单侧注射6-OHDA后四周，与其杂合体和野生型同窝出生仔畜对照相比，Nogo受体敲除小鼠的黑质中的存活多巴胺神经元数目显著更大(图1A)。与杂合体和野生型同窝出生仔畜对照相比，无NgR小鼠中响应阿朴吗啡刺激所产生的转动行为显著较低(图2A)。这些数据显示在缺失NgR1的小鼠的损伤后，神经元存活增强而脑中多巴胺途径的功能恢复改善。
尽管在一些细节上通过例证和实施例的方式为了理解清楚的目的描述了前述发明，对于本领域普通技术人员来说根据本发明的教导显而易见可以对其作出某些改变和改进而不背离随附权利要求书的精神或范围。
权利要求
1.一种促进哺乳动物中多巴胺能神经元的再生或存活的方法，所述哺乳动物呈现多巴胺能神经元退变的征象或症状，所述方法包括向哺乳动物给药治疗上有效量的NgR1拮抗剂。
2.权利要求1的方法，其中所述NgR1拮抗剂直接给药到中枢神经系统中。
3.权利要求2的方法，其中将所述NgR1拮抗剂直接给药到黑质或纹状体中。
4.权利要求2的方法，其中通过快速浓注或慢速输注给药所述NgR1拮抗剂。
5.权利要求1的方法，其中所述NgR1拮抗剂包含可溶形式的哺乳动物NgR1。
6.权利要求5的方法，其中所述可溶形式的哺乳动物NgR1
(a)包含人NgR1的氨基酸26-310(SEQ ID NO3)，具有多至十个保守性氨基酸取代；和
(b)缺乏
(i)功能性跨膜结构域，和
(ii)功能性信号肽。
7.权利要求5的方法，其中所述可溶形式的哺乳动物NgR1
(a)包含人NgR1的氨基酸26-344(SEQ ID NO4)，具有多至十个保守性氨基酸取代；和
(b)缺乏
(i)功能性跨膜结构域，和
(ii)功能性信号肽。
8.权利要求5的方法，其中所述可溶形式的哺乳动物NgR1
(a)包含大鼠NgR1的氨基酸27-310(SEQ ID NO5)，具有多至十个保守性氨基酸取代；和
(b)缺乏
(i)功能性跨膜结构域，和
(ii)功能性信号肽。
9.权利要求5的方法，其中所述可溶形式的哺乳动物NgR1
(a)包含大鼠NgR1的氨基酸27-344(SEQ ID NO6)，具有多至十个保守性氨基酸取代；和
(b)缺乏
(i)功能性跨膜结构域，和
(ii)功能性信号肽。
10.权利要求5的方法，其中所述可溶形式的哺乳动物NgR1进一步包含融合部分。
11.权利要求10的方法，其中所述融合部分为免疫球蛋白部分。
12.权利要求11的方法，其中所述免疫球蛋白部分是Fc部分。
13.权利要求1的方法，其中所述NgR1拮抗剂包含结合哺乳动物NgR1的抗体或其抗原结合片段。
14.权利要求13的方法，其中所述抗体选自多克隆抗体，单克隆抗体，Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，Fv片段，Fd片段，双抗体，以及单链抗体。
15.权利要求13的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段结合到一种多肽上，所述多肽被选自HB7E11(ATCC编号PTA-4587)，HB1H2(ATCC编号PTA-4584)，HB 3G5(ATCC编号PTA-4586)，HB5B10(ATCC编号PTA-4588)和HB2F7(ATCC编号PTA-4585)的杂交瘤产生的单克隆抗体结合。
16.权利要求15的方法，其中所述单克隆抗体由HB 7E11杂交瘤生产。
17.权利要求16的方法，其中所述多肽包含选自下列的氨基酸序列AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQ ID NO7)；LDLSDNAQLR(SEQ IDNO8)；LDLSDDAELR(SEQ ID NO9)；LDLASDNAQLR(SEQ ID NO10)；LDLASDDAELR(SEQ ID NO11)；LDALSDNAQLR(SEQ ID NO12)；LDALSDDAELR(SEQ ID NO13)；LDLSSDNAQLR(SEQ ID NO14)；LDLSSDEAELR(SEQ ID NO15)；DNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO16)；DNAQLR(SEQ ID NO17)；ADLSDNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO18)；LALSDNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO19)；LDLSDNAALRVVDPTT(SEQ IDNO20)；LDLSDNAQLHVVDPTT(SEQ ID NO21)；和LDLSDNAQLAVVDPTT(SEQ ID NO22)。
18.权利要求16的方法，其中所述多肽由选自下列的氨基酸序列组成AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQ ID NO7)；LDLSDNAQLR(SEQ IDNO8)；LDLSDDAELR(SEQ ID NO9)；LDLASDNAQLR(SEQ ID NO10)；LDLASDDAELR(SEQ ID NO11)；LDALSDNAQLR(SEQ ID NO12)；LDALSDDAELR(SEQ ID NO13)；LDLSSDNAQLR(SEQ ID NO14)；LDLSSDEAELR(SEQ ID NO15)；DNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO16)；DNAQLR(SEQ ID NO17)；ADLSDNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO18)；LALSDNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO19)；LDLSDNAALRVVDPTT(SEQ IDNO20)；LDLSDNAQLHVVDPTT(SEQ ID NO21)；和LDLSDNAQLAVVDPTT(SEQ ID NO22)。
19.权利要求1的方法，其中所述治疗上有效的量为0.001mg/Kg-10mg/kg。
20.权利要求19的方法，其中所述治疗上有效的量为0.01mg/kg-1.0mg/kg。
21.权利要求20的方法，其中所述治疗上有效的量为0.05mg/kg-0.5mg/kg。
22.权利要求1的方法，其中所述多巴胺能神经元退变与选自帕金森病，多系统萎缩症，纹状体黑质退变，橄榄桥脑小脑萎缩，香-德综合征，具有帕金森病特征的运动神经元病，Lewy小体痴呆，进行性核上麻痹，皮层-基底神经节退变，额颞性痴呆，伴随帕金森氏综合征的阿尔茨海默氏病，威尔逊病，苍白球色素性退变综合征，Chediak-Hagashi病，SCA-3脊髓小脑共济失调，与X染色体连锁的张力障碍帕金森氏综合征(DYT3)，亨廷顿病(Westphal变体)，朊蛋白病，血管性帕金森氏综合征，大脑性麻痹，重复头外伤，脑炎后帕金森氏综合征和神经梅毒的疾病或病症相关联。
23.一种治疗帕金森病的方法，包括向哺乳动物给药治疗上有效量的NgR1拮抗剂。
全文摘要
本发明提供利用Nogo受体拮抗剂促进哺乳动物中多巴胺能神经元的再生或存活的方法，所述哺乳动物呈现多巴胺能神经元退变的征象或症状，包括患有帕金森病的人。
文档编号A61P25/28GK1946418SQ20058000924
公开日2007年4月11日 申请日期2005年1月28日 优先权日2004年1月30日
发明者简·K·雷尔顿, 托马斯·M·恩格伯, 斯蒂芬·M·斯特里特马特 申请人:比奥根艾迪克Ma公司, 耶鲁大学