专利名称：含有效b细胞活化因子基因启动子的重组质粒及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种含有效B细胞活化因子基因启动子的重组质粒及其制备方法和用途。
背景技术：
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一类常见病、多发病，主要表现为B细胞过度增殖活化、产生多种自身抗体(以抗双链DNA抗体最为重要)。该病多发于20～50岁的中青年女性，男女比例约1∶8；如果诊断治疗不及时，60～70％的患者将出现肾功能衰竭，严重影响了劳动力质量。而SLE的发病机理仍若明若暗，至今尚无特定的诊断手段，更无理想的治疗方法。目前在众多可能的SLE的发病机制中，B细胞过度激活的学说已得到广泛认可，但其是否是SLE发病的关键之所在，仍是个未知的重要问题。现已知，对B细胞激活起重要调控作用的B细胞活化因子可能与SLE等自身免疫病的发病非常相关。
B细胞活化因子(B-cell activating factor，BAFF)，又被称为B细胞刺激因子(B-Lymphocyte stimulator，BLyS)、TNF相关的淋巴细胞表达配体1(TNF and ApoL-related leukocyte-expressed ligand 1，TALL-1)、诱导细胞凋亡和活化NF-κB的TNF类似物(TNFhomologue that activates apoptosis，NF-κB，and JNK，THANK)等，是1999年发现的一种多功能的共刺激分子。
BAFF属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族，由人染色体13q34的基因所编码，其长度为285个氨基酸(aa)，是一种II型膜贯通蛋白。其中在47aa到73aa之间有一编码穿膜蛋白的区域，长度为31个氨基酸。细胞质区由46个氨基酸组成，细胞外区由218个氨基酸组成，有2个N-糖甙部位。该细胞外区(17kDa)能被蛋白水解酶切断，成为可溶型分子而游离。BAFF主要特异表达于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等骨髓系细胞，而且IL-10、IFN-γ、IL-4等细胞因子都能明显上调/下调骨髓系细胞对其表达。
纵观近几年来BAFF的研究进展和趋势，主要研究热点是各自从蛋白质和mRNA水平对BAFF与SLE免疫病理的关系进行探索，虽然这些研究为探讨BAFF在SLE中的作用提供了理论依据和实验基础，但还不能在分子水平揭示BAFF作用的实质。这是因为蛋白质的表达调控主要发生在上游的核酸水平和转录水平，mRNA表达的异常会导致其下游蛋白水平的表达异常，而转录水平的任何调控元件的变化，必将会直接导致mRNA表达的异常。所以，研究在不同条件下BAFF基因的异常激活，对阐述SLE的发病机制有特别重要的意义。但是，目前有关BAFF基因上游调控元件的准确定位及其与相应的DNA结合蛋白的相互作用的研究尚属空白，更未见任何有关病理条件下BAFF基因调控元件的功能变化的报道。鉴于此，我们认为有必要联合蛋白质和核酸(mRNA)水平研究BAFF在SLE中的异常表达，探讨BAFF所介导的B细胞激活对SLE的致病机理，并进一步在分子水平开展BAFF基因转录调控机制的研究，形成完整的从转录水平到核酸再到蛋白质水平的调控理论，为揭开BAFF的致病作用、拓展阻断BAFF活化的新技术/方法提供依据，为SLE乃至其他自身免疫病的药物治疗/筛选提供重要的调控靶序列。
发明内容
本发明的目的在于提供含有效B细胞活化因子基因启动子的重组质粒及其制备方法和用途。
本发明根据Genebank(AB730224)中的人BAFF基因上游5’侧翼区-1349～-329bp的片段，经程序DNAassist1.0模拟分析该序列可能存在的主要核因子位点后，挑选-1349～-743bp为研究对象进行克隆表达。以正常人全血基因组DNA为模板，经PCR扩增、定向克隆入含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的pCAT3-Enhancer载体，构建出重组质粒。转化入大肠杆菌JM109以扩增，酶切、测序鉴定后，抽提质粒DNA并定量，培养人骨髓白血病细胞株HL-60，采用脂质体转染试剂，将该重组体质粒DNA转染入靶细胞中培养48小时，对细胞裂解物进行蛋白定量，用CAT报告基因ELISA检测试剂盒测定重组体的CAT活性。
本发明还将所构建的含BAFF基因启动子(-1349～-743bp)的重组质粒转染入HL-60细胞中，培养24小时后，加入不同浓度的细胞因子IL-10、IL-4、IFN-γ及重组BAFF(rBAFF)分子进行干预，对细胞裂解物进行蛋白定量，用CAT报告基因ELISA检测试剂盒测定其CAT表达的活性，观察其转录活性的变化，探讨不同细胞因子对该BAFF基因启动子活性的影响。
结果表明，经酶切、测序鉴定，所构建的BAFF基因重组启动子片段与Genebank中的序列(-1349～-743bp)一致。IFN-γ、IL-10和rBAFF可以提高该BAFF基因启动子重组体的转录活性，而IL-4抑制其转录活性。说明细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-4、rBAFF可以一定程度的在转录水平影响BAFF合成和分泌。
本发明所构建的含有效BAFF基因启动子(-1349～-743bp片段)的重组质粒准确、可靠，而且报告基因测活比较活性的方法简单、可以定量，是一个在转录水平筛选治疗SLE等BAFF相关性疾病药物的简便方法，为进一步研究人BAFF基因激活的调控机制奠定了基础，也为探索SLE等BAFF相关性疾病的防治提供了新思路。
图1是本发明pCAT3-enhancer载体质粒结构2是本发明重组质粒酶切后电泳结果图3是本发明重组质粒的测序结果图4是人BAFF基因的基因组结构图5是计算机模拟分析可能的主要核因子结合位点(DNAassist1.0)图6是不同细胞因子对本发明重组质粒启动子活性的影响具体实施方式
现结合实施例及附图，对本发明作进一步的描述。
实施例1含有效BAFF基因启动子重组质粒的制备人BAFF基因启动子位于该基因上游5’侧翼区大约1020bp的区域(参见Kawasaki A，Tsuchiya N，Fukazawa T，et al.Analysis on theassociation of human BLYS(BAFF，TNFSF13B)polymorphisms withsystemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis[J].Genes Immun，2002，3(7)424-429)，见图4。本研究目的是对人BAFF基因上游5’侧翼区的部分片段(-1349～-743bp序列)进行启动调控活性分析。将该序列与报告基因组成重组启动子质粒，通过基因转染、报告基因测定活性，观察该重组体的启动活性，为探索在转录水平激活/阻断BAFF基因的调控靶序列奠定了基础。
材料与方法1材料1.1主要试剂全血基因组DNA提取试剂盒、ProofSart高保真PCR试剂盒、质粒抽提试剂盒为美国QIAGEN公司产品；限制性内切酶Mlu I、Xhol，T4DNA连接酶，DNA marker均购自大连TakaRa生物工程公司；小量胶回收试剂盒购自MBI公司；Fugene 6脂质体转染试剂、CAT ELISA检测试剂盒为美国Roche公司产品；小牛血清、GI1640培养基购自美国Gibco公司；50ml细胞培养瓶，六、十二孔细胞培养板为美国Corning公司产品；引物合成、DNA测序分析均由上海联合基因生物技术公司完成。
1.2载体、菌株、细胞株表达载体pCAT3-enhancer Vector、CAT表达阳性质粒、β-gal质粒、大肠杆菌JM109均购自美国Promega公司；人骨髓白血病细胞株HL-60由长海医院血液科惠赠。
1.3主要仪器PE-9600PCR扩增仪(美国PE Biosystems公司)，紫外分光光度计Du-600(美国Backman公司)，水平电泳仪(瑞典Bio-Rad公司)，KUBOTA 5420台式高速离心机(日本Kubota公司)，550型酶联免疫检测仪(Model 550 Microplate Reader，Bio-Rad公司生产)。
2实验方法2.1重组体的构建pCAT3-enhancer Vector载体质粒不含启动子，但含有SV增强子、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因(见图1)。重组体内所插入的目的片段即为所要研究的BAFF的启动子片段。
2.1.1引物设计根据Genebank所报道的人BAFF的启动子序列(AccessionAB730224)，应用程序DNA assist1.0模拟分析该序列可能存在的主要核因子位点(见图5)、Primer Premier 5.0引物设计软件设计引物。在引物的两端分别加入限制性内切酶Mlu I、Xhol的酶切位点，拟插入的片段长度分别为606bp，依此构建含人BAFF基因启动子序列的-1349～-743bp片段与pCAT3-enhancer连接的重组体phBAFF3。扩增该重组启动子片段的引物如下正向引物为5’-AGCCTACTCGAGAGCCTGGGTCTGGAGTTC-3’反向引物为5’-ATGTCTACGCGTGGTCGCAGGGTGTTGAGT-3’正、反向引物的5’端分别含有6个保护碱基和限制性内切酶MluI或Xhol识别位点(下划线部分)。引物由联合基因公司合成。
2.1.2基因组DNA的提取取正常人全血200μl，按照QINGEN公司的“QIAamp DNA bloodmini kit”试剂盒说明书操作以提取基因组DNA，在紫外分光光度计上对提取的基因组DNA进行定量，分装-80℃保存备用。
2.1.3目的片段的获得以基因组DNA为模板，用QINGEN公司的“ProofStart高保真PCR试剂盒”扩增该重组体目的片段，通过预实验对反应条件进行调整，具体如下10×PCR buffer5μl2.5mM dNTP6μl10μM正向引物 5μl10μM反向引物 5μlProofStart DNA聚合酶 1μl人基因组DNA(100ng/μl)3μl
共计50μl反应参数95℃2min 2.1.4PCR产物的纯化PCR产物的纯化按MBI公司“小量胶回收试剂盒”说明书操作，预先按标签提示在Washing Buffer液中加入19倍体积的无水乙醇。
1)DNA片段用1％琼脂糖凝胶电泳分离；2)对应分子量Marker，将欲回收片段的凝胶条切下，放1.5ml离心管中，加入3倍体积的Bind Solution；3)55℃水浴5分钟，每2分钟混匀一次；4)按2μl悬液/μg DNA，加入Silica Powder Suspension悬液，55℃水浴5分钟，每2分钟涡悬一次；5)高速离心1分钟后，形成片状沉淀，去除上清；6)加入500μl冰预冷的Washing Buffer，混匀后离心30秒，去除上清，重复三次；7)加入50μl TE液，温和重悬沉淀后，55℃水浴5分钟；8)离心30秒，收集上清，-20℃保存备用；9)取10μl DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；取7μl DNA用纯水稀释10倍，用于紫外分光光度仪定量检测。
2.1.5酶切、连接目的片段和载体质粒用限制性内切酶Mlu I、Xhol双酶切该段目的片段和载体pCAT3-enhancer Vector，酶切反应体系和参数如下DNA片段 30μlMlu I(10U) 2μlXhol(10U)2μl10×Buffer 4μl
去离子H2O 2μl共计 40μl载体质粒 1μlMlu I(10U) 2μlXhol(10U)2μl10×Buffer 4μl去离子H2O 31μl共计 40μl37℃作用2小时，琼脂糖电泳鉴定酶切效率后，切胶回收酶切后的质粒和目的片段，定量。酶切后的目的片段和线性pCAT3-enhancerVector具有相同的粘末端，经T4连接酶连接。连接反应体系T4DNA连接酶 1μl质粒 300ng目的片段 150ng10×连接反应缓冲液 2.5μl补足反应体积(25μl)，16℃连接过夜。
2.1.6感受态细菌的制备和转化1)将大肠杆菌JM109接种于LB培养基，振荡培养过夜；2)按1∶10比例接种过夜的细菌培养物于2ml LB培养基中，振荡培养3小时；8000g离心后弃上清，加入400μl 0.1mol/L CaCl2(初始培养物量的1/5)，混匀置冰上冰浴10min；3)4000g离心10min，小心弃去上清回收细菌。加入初始培养物体积的1/25的0.1mol/L CaCl2，分装50μl/管；4)加入上述连接产物5μl，混匀，冰浴30分钟；5)42℃冲击90秒，冰浴5分钟，加入800μl LB培养基，37℃培养40分钟，振荡培养3小时；6)离心，弃部分上清，剩余部分混匀，接种于含抗生素的LB平板培养基上，37℃培养12～16h；7)同时作载体质粒、无质粒连接产物、酶切质粒的对照。
2.2重组质粒、CAT阳性表达质粒和载体质粒的大量扩增、提取2.2.1重组质粒、CAT阳性表达质粒和载体质粒的大量扩增经氨苄青霉素抗性筛选，小量酶切初步鉴定、测序正确后；将转化有重组质粒、CAT阳性表达质粒、载体质粒的大肠杆菌JM109在含有氨苄青霉素的100ml LB培养基中大量扩增阳性克隆。
2.2.2重组质粒、CAT阳性表达质粒和载体质粒的大量提取由于质粒用于下述的细胞转染，因此，提取的过程需要严格无菌操作。用QIAGEN公司的“QIAfilter Plasmid Midi Kits”试剂盒大量提取各重组质粒，操作均按说明进行。预先将RNaseA加入P1液中至终浓度为100μg/ml，将P3液在4℃预冷。
1)以50ml无菌离心管收集LB菌液，4500rpm、4℃离心25min，倒尽管内沉淀并扣干；2)各管中分别加入P1液4ml，反复吹打混匀；3)各管中分别加入P2液4ml，温和颠倒混匀4～6次，室温静置5min；4)将QIAGEN收集管的管口用盖子塞住，并将其放入一合适的离心管中，在含细菌裂解液的各管中分别加入P3液4ml，温和颠倒混匀4～6次；5)立即将上述裂解液倒入准备好的QIAGEN收集管中，室温静置10min；6)各用QBT液4ml平衡QIAGEN-tip100柱；7)待此柱完全沥干时，取下收集管的盖子，将收集管连接到QIAGEN-tip100柱上；8)以活塞加压轻推收集管，使裂解液的上清部分完全流入tip100柱中；9)待裂解液完全从tip100柱中滤出，各用10ml的QC液分别洗脱tip柱两次；10)换用15ml无菌离心管作收集管，以5ml的QF液洗脱tip柱；11)在上述各15ml无菌离心管中各加0.7倍体积的异丙醇沉淀DNA，混匀后4100rpm、4℃离心1小时，吸除上清；
12)再分别用2ml的70％乙醇浓缩DNA，4100rpm、4℃离心1小时，仔细吸除上清，防止破坏DNA沉淀；13)在空气中干燥10分钟后，各用2ml的灭菌的TE液(pH8.0)溶解DNA；14)紫外分光光度计进行DNA定量。
2.3HL-60细胞的培养人骨髓白血病细胞株HL-60用含10％小牛血清的1640培养基，在37℃，5％CO2条件下进行培养、传代，选择第3～8代培养细胞进行实验。
2.4重组DNA转染DNA转染采用脂质体转染法，操作按FuGENE6脂质体试剂使用说明进行。转染前一天，HL-60细胞以3×105细胞/孔接种于6孔培养板。细胞生长至60％～80％融合时，换新鲜培养基。将1μg上述BAFF基因启动子的重组质粒、1μg作内对照的β-gal阳性表达质粒pSVβ-gal及FuGENE6转染试剂以复合物形式转染至HL-60细胞。同时设置转染1μg的CAT阳性表达质粒作为阳性对照；1μg的pCAT3-enhancer载体质粒作为阴性对照。转染后48小时，转染的细胞裂解、待测CAT报告基因活性。
2.5蛋白定量HL-60细胞转染重组体后48h，终止培养的细胞，用预冷的PBS缓冲液(pH7.4)洗涤3遍，以裂解缓冲液(Roche)裂解细胞，细胞裂解液以紫外分光光度计进行蛋白定量。
2.6β-gal活性测定100μl细胞裂解液中加入100μl“β-gal assay 2×buffer”(Promega)混匀，置37℃12小时，再加入1M碳酸钠混匀，酶标仪420nm测定光密度。
2.7CAT活性测定以ELISA试剂盒(Roche)检测CAT报告基因的活性，操作按使用说明进行。将200μl细胞裂解液加入已包被抗体的96孔板，反应结束后加入底物显色，酶标仪405nm和492nm测定光密度值。
2.8数据处理所有CAT测定结果均用相应的转染质粒的摩尔数、蛋白浓度和β-gal活性进行校正，实验重复4次，采用4次实验的均值计算各重组体的相对活性。实验数据的统计处理均采用SAS 6.12软件，计量资料用t检验和方差分析，P＜0.05认为差异具有统计学意义。
3结果3.1含有效BAFF基因启动子重组质粒的鉴定以人BAFF基因上游5’侧翼区-1349～-329bp片段为靶序列，模板采用正常健康人全血基因组DNA，PCR扩增获得长度为606bp的片段作为启动子，与不含启动子的载体pCAT3-enhancer组成重组体phBAFF3，该重组体经限制性内切酶Mlu I和Xhol双酶切鉴定正确(见图2)。即载体为4.3kb的pCAT3-enhancer，插入启动子的长度为606bp，相应于人BAFF基因上游启动子序列的-1349～-743bp片段。经测序，插入片段与GenBank报道的序列(AB730224)完全一致(见图3)。
图2中相对分子量指示Marker均为wide range DNA marker(TakaRa)，目的条带为phBAFF3(606bp)阳性克隆经Mlu I、Xhol双酶切后的条带。
图3中为重组体phBAFF3的正向测序结果。
3.2转染重组体的细胞CAT表达水平测定人骨髓白血病细胞HL-60在转染上述含有效BAFF基因启动子的重组体后48小时，ELISA方法测定细胞CAT表达量。同时测定细胞裂解液的蛋白浓度及β-gal活性，β-gal活性作为内对照以保持转染效率相同条件下观察CAT表达量。CAT测定结果用相应的转染质粒的摩尔数、蛋白浓度和β-gal活性校正后，计算该重组体的相对活性为(0.17±0.03)。
实施例2部分细胞因子对BAFF转录调控作用的影响大量研究表明，BAFF的异常表达与SLE等多种自身免疫病的免疫病理密切相关。国外文献报道，BAFF分子在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等骨髓系细胞的表达受IL-10、IFN-γ、IL-4等多种细胞因子的影响，这些细胞因子能明显上调/下调BAFF蛋白的合成和分泌。但这些细胞因子如何调节BAFF分子在骨髓系细胞的表达，是否通过转录水平来影响BAFF的合成和分泌，至今尚无明确解释。本研究以“实施例1”中所构建的、含较强转录活性的-1349～-743bp序列的重组体phBAFF3为实验平台，将其瞬时转染人骨髓白血病细胞HL-60，加入细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-4、重组人BAFF标准品(rBAFF)进行干预，探讨这些细胞因子对BAFF基因启动子活性的影响。
材料与方法1材料1.1质粒、细胞株“实施例1”中构建的重组质粒phBAFF3；CAT表达阳性质粒、β-gal质粒美国Promega公司；人骨髓白血病细胞HL-60由长海医院血液科惠赠1.2主要试剂小牛血清、GI1640培养基(美国Gibco公司)；50ml细胞培养瓶，六、十二孔细胞培养板(美国Corning公司)；Fugene转染试剂，CAT ELISA检测试剂盒(Roche公司)；重组人IFN-γ(rh IFN-γ)，重组人IL-10(rh IL-10)，重组人IL-4(rh IL-4)均购自美国R&D公司；重组人BAFF标准品(rBAFF)为美国PeproTech公司产品。
1.3主要仪器紫外分光光度计Du-600(美国Backman公司)，水平电泳仪(瑞典Bio-Rad公司)，KUBOTA 5420台式高速离心机(日本Kubota公司)，550型酶联免疫检测仪(Model 550 Microplate Reader，Bio-Rad公司生产)。
2实验方法2.1HL-60细胞的培养人骨髓白血病细胞株HL-60用含10％小牛血清的1640培养基，在37℃，5％CO2条件下进行培养、传代，选择第3～8代培养细胞进行实验。
2.2重组DNA转染及细胞因子干预2.2.1重组DNA转染DNA转染采用FuGENE6(Roche)脂质体转染试剂法，操作按试剂使用说明进行。转染前一天，HL-60细胞以3×105细胞/孔接种于6孔培养板。细胞生长至60％～80％融合时，换新鲜培养基。将1μgphBAFF3重组质粒、1μg作内对照的β-gal阳性表达质粒pSV β-gal及FuGENE6转染试剂以复合物形式转染至HL-60细胞。同时设置转染1μg的CAT阳性表达质粒作为阳性对照；1μg的pCAT3-enhancer载体质粒作为阴性对照。转染后24小时，换含2％小牛血清的新鲜1640培养基以静息。
2.2.2细胞因子干预HL-60细胞转染重组体后24小时，换含2％小牛血清的新鲜1640培养基，根据预实验和文献设计、选择细胞因子干预剂量为IFN-γ(5ng/ml)、IL-10(100ng/mL)、IL-4(100ng/mL)、rhBAFF(200ng/mL)，加入上述细胞因子进行干预，培养48小时后，测定CAT报告基因活性。每种细胞因子重复2孔，实验重复进行5次。
2.3蛋白定量终止培养的细胞用预冷的PBS缓冲液(pH7.4)洗涤3遍，以裂解缓冲液(Roche)裂解细胞，细胞裂解液以紫外分光光度计进行蛋白定量。
2.4β-gal活性测定100μl细胞裂解液中加入100μl“β-gal assay 2×buffer”(Promega)混匀，置37℃12小时，再加入1M碳酸钠混匀，酶标仪420nm测定光密度。
2.5CAT活性测定以ELISA试剂盒(Roche)检测CAT报告基因的活性，操作按使用说明进行。将200μl细胞裂解液加入已包被抗体的96孔板，反应结束后加入底物显色，酶标仪405nm和492nm测定光密度值。
2.6数据处理所有CAT测定结果均用相应的转染质粒的摩尔数、蛋白浓度和β-gal活性进行校正，实验重复5次，采用5次实验的均值计算各重组体的相对活性。实验数据的统计处理均采用SAS 6.12软件，计量资料用t检验和方差分析，P＜0.05认为差异具有统计学意义。
3结果3.1重组体的鉴定重组体phBAFF3转化大肠杆菌JM109，增菌后大量提取质粒，取少量重组体经限制性内切酶Mlu I和Xhol酶切鉴定鉴定正确(图2)。即载体均为4.3kb的pCAT3-enhancer，插入启动子的长度为606bp，相应于人BAFF基因上游启动子序列的-1349～-743bp片段。
图2中相对分子量指示Marker为wide range DNA marker(TakaRa)，邻近Marker的750bp处的特异扩增条带为目的DNA条带(606bp)，邻近Marker的5000bp处的扩增条带为pCAT3-enhancer载体的DNA条带。
3.2细胞因子对BAFF基因启动子活性的影响HL-60细胞在转染重组启动子phBAFF3培养24h后，换2％小牛血清的新鲜1640培养基静息24h，分别加入细胞因子IFN-γ(5ng/ml)、IL-10(100ng/mL)、IL-4(100ng/mL)、rhBAFF(200ng/mL)干预，48h后收集细胞，ELISA方法测定细胞CAT表达量。同时测定细胞裂解液的蛋白浓度及β-gal活性，β-gal活性作为内对照以保持转染效率相同条件下比较CAT表达量。以未加细胞因子干预的转染phBAFF3的细胞CAT表达量为1，其余各组的CAT相对表达量的结果见表1。
表1.不同细胞因子对BAFF基因启动子活性的影响(n＝5，X±s)
结果表明，细胞以phBAFF3重组体转染后经IFN-γ、IL-10、rBAFF处理，CAT表达量均明显上升(P≤0.05)，而细胞以phBAFF3重组体转染后经IL-4处理，CAT表达量则显著下降(P＜0.05)。其中，IFN-γ(5ng/ml)能使重组体phBAFF3的CAT活性升高3.5倍，IL-10(100ng/ml)可以使重组体的CAT活性升高2.3倍，rBAFF(200ng/ml)能使重组体的CAT活性升高1.4倍，IL-4(100ng/ml)使重组体的CAT活性降低为对照组的72％(图6)。图中Control组为未加细胞因子干预的重组体phBAFF3。
权利要求
1.一种含有效B细胞活化因子BAFF基因启动子的重组质粒，其特征在于它由人BAFF基因上游启动子序列的-1349～-743bp片段和氯霉素乙酰基转移酶CAT报告基因组成。
2.权利要求1所述一种含有效B细胞活化因子BAFF基因启动子的重组质粒的制备方法，包括如下步骤I.pCAT3-enhancer Vector载体质粒不含启动子，但含有SV增强子、氯霉素乙酰基转移酶CAT报告基因；II.人BAFF基因上游启动子序列的-1349～-743bp片段的引物设计正向引物5’-AGCCTACTCGAGAGCCTGGGTCTGGAGTTC-3’反向引物5’-ATGTCTACGCGTGGTCGCAGGGTGTTGAGT-3’引物的5’端分别含有6个保护碱基和限制性内切酶Mlu I或Xhol识别位点；III.以正常人全血基因组DNA为模板，对人BAFF基因上游启动子序列的-1349～-743bp片段的进行PCR扩增、酶切及纯化，将上述目的片段插入pCAT3-enhancer Vector载体质粒，构建重组启动子质粒；IV.通过细胞基因转染，CAT报告基因ELISA检测试剂测定重组体的CAT活性，观察重组质粒的启动活性。
3.权利要求1所述的一种含有效B细胞活化因子BAFF基因启动子的重组质粒，其特征在于细胞因子IFN-γ、IL-10和rBAFF提高它的启动活性，细胞因子IL-4抑制它的启动活性。
4.权利要求1所述的一种含有效B细胞活化因子BAFF基因启动子的重组质粒具有在转录水平激活或阻断BAFF基因的调控靶点的作用。
5.权利要求1所述的一种含有效B细胞活化因子BAFF基因启动子的重组质粒在筛选治疗BAFF相关性疾病的细胞因子类药物方面的应用。
6.权利要求5所述的一种含有效B细胞活化因子BAFF基因启动子的重组质粒在筛选治疗系统性红斑狼疮的细胞因子类药物方面的应用。
全文摘要
本发明涉及生物医药工程技术领域。目前有关B细胞活化因子(BAFF)基因上游调控元件的准确定位及其与相应的DNA结合蛋白的相互作用的研究尚属空白，更未见任何有关病理条件下BAFF基因调控元件的功能变化的报道。本发明提供一种含有效BAFF基因启动子的重组质粒，它由人BAFF基因上游启动子序列的－1349～－743bp片段和氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因组成，本发明还提供了该重组质粒的制备方法和用途。本发明构建的重组质粒准确、可靠；报告基因测活比较活性的方法简单、可以定量，是一个在转录水平探索激活/阻断BAFF基因的调控靶点的简便方法；而且部分细胞因子可以一定程度地影响该重组质粒的启动活性，为研究治疗SLE等BAFF相关性疾病的细胞因子类药物的筛选提供了新思路。
文档编号A61P37/02GK1807648SQ200610023590
公开日2006年7月26日 申请日期2006年1月24日 优先权日2006年1月24日
发明者仲人前, 周琳, 孔宪涛, 高春芳, 王皓, 屠小卿, 陆慧琦 申请人:中国人民解放军第二军医大学