专利名称：紫草素在制备诱导细胞坏死样程序性死亡的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属中药有效成分的用途，主要涉及紫草素在制备抗多药耐药肿瘤作用药物的新用途。
背景技术：
紫草素是从紫草科多年生草本植物紫草的根中提取的主要成分之一，紫草在我国大部分省区均有分布，它有消炎、收敛和解热作用，药用其根，已应用于临床，疗效确切。紫草最初记载于《神农本草经》，为防治麻疹的中药。而紫草素则是抗炎症的主要成分。紫草富含紫草素及其衍生物，其含量占3～6.5％，颜色深红，化学结构为萘醌类，在生物体内的氧化还原反应中能传递介子。具有止血、抗炎、抗菌、抗病毒及抗癌的药理活性。紫草的多种成分及其结构决定了其功能的广谱性和用途的多样化，可成为多种行业天然系列产品的中间体原料。
紫草素，英文名为shikonin，CAS number517-89-5，分子量288.2994，化学命名为(+)-5，8-dihydroxy-2-(1-hydroxy-4-methyl-3-pentenyl)-1，4-naphthoquinone，分子式为C16H16O5，结构式如下 它具有旋光性，和异紫草素Alkannin是一对对映体。紫草素是紫红色带有金属光泽的针状晶体，微溶于水，易溶于苯、乙醇、乙醚等有机溶剂，由于能够吸收500～560nm波长的光而呈现红色，且吸收光谱会随pH而发生迁移。它具有酸碱稳定性，并且溶液颜色随着pH而变化，酸性条件下呈红色，中性时紫色，碱性时呈蓝色，由于颜色稳定，并且本身LD50，对雄性小鼠为3.0±0.1g/kg，对雌性小鼠为3.1±0.1g/kg，实际为无毒性组分，目前广泛用于食品添加剂的色素。而且在如面乳、唇膏化妆品中，也用作天然的色素成分，这在日本的化妆品中多见。而早在1984年日本就已经开始利用细胞工程培养的方式来工业化规模生产紫草素，作为化妆品的原料。
对于紫草素的医药用途，还没有一个系统研究，对紫草素的药理研究主要集中在抗炎作用，加速创伤愈合上，对于抗癌活性的研究虽然很早就发现有抗肿瘤作用，但药理的研究较少，在1977年有日本学者对紫草素的抗肿瘤活性的报道，但机理还不明确。而在1991年有中国学者用紫草素复合方剂用于临床实验治疗晚期癌症患者证实了紫草素的疗效。至1999年国外才有紫草素的诱导HL-60肿瘤细胞凋亡的报道，并且发现凋亡细胞中有起关键作用的半胱天冬酶Caspase 3的激活，而国内至2001年才有紫草素诱导大肠癌细胞凋亡的报道。而对于紫草素抗多药耐药肿瘤作用则至今未见有任何的报道。
多药耐药是指肿瘤细胞对不同结构和作用机理的药物产生交叉耐受性，肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉耐药是成为化疗成功的障碍。据不完全统计，90％以上的患者死因与多药耐药(MDR)有关。
多药耐药的原因有很多，例如1.MDR1基因及其编码产物P-糖蛋白(P-gp)过度表达1976年juliano[14]用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)使其对秋水仙碱耐药，首先揭示了MDR与细胞内药物浓度降低有关，并证实MDR细胞内存在一种能量依赖性膜转运蛋白，其相对分子质量为(1.5-1.8)×108，它由Mdr-1基因编码。人类Mdr-1基因位于第7对染色体，在人类正常组织中有不同程度表达。其中在肺，胃肠中有中等程度的表达。P-gp作为一种ATP酶活性的跨膜泵或“换位酶”，将摄入细胞内的药物泵出，促使其外流而维持细胞内化疗药物的低浓度水平。因此P-gp的过度表达与肿瘤细胞的固有耐药性有关。
此外，进一步的研究发现，P-gp在细胞凋亡中可能发挥重要的调控作用。报告抑制caspase活化，改变细胞内PH，抑制质膜去极化和K+外流，减少神经酰胺生成等等，造成细胞的调亡耐受，从而表现出耐药。
2.多药耐药相关蛋白(MRP)过度表达MRP是于1992年由Cole等人在用对阿霉素选择耐药的肺癌细胞株H69AR中发现的第二个与多药耐药有关的ABC转运蛋白。它是一个分子量为190kDa，包含1531个氨基酸残基的膜蛋白，与PgP仅有15％的同源性。后来又有八个MRP同源蛋白报道，分别命名为MRP 2～9，而最早发现的则称为MRP1。这些MRP蛋白均属于ABC家族中的C亚族，其中MRP1～6与多药耐药有过关，其它几个蛋白的功能至今还不明确。
在MRP家族中MRP1是研究的最多的一种，编码该蛋白的MRP1基因位于染色体的16p13.1。MRP1的功能和作用方式同PgP相似，也是作为一种ATP能量依赖泵，通过外排降低药物在胞内的积聚浓度来达到耐药效果。不同的是它的功能的发挥必须借助于胞内的谷胱甘肽(GSH)，是一种GSH结合物转运蛋白(即所谓的GS-X泵)。
与PgP的主要底物是疏水阳离子不同，MRP1的底物主要的是有机阴离子，并且主要以GSH、葡糖醛酰胺以及硫酸盐结合物的形式转运。但MRP1转运的底物也有许多是与Pgp重叠的，但两者也有一些不同点，如MRP1表达的耐药细胞与Pgp表达的相比，它对紫杉醇基本上不产生交叉耐药。
3.抗调亡蛋白Bcl-2，Bcl-xL的过度表达，导致肿瘤细胞调亡耐受近年来，细胞凋亡与多药耐药及肿瘤细胞的抗药性的关系日益受到人们的关注，研究发现抑制调亡与耐药的形成存在一定的关系。细胞凋亡过程受到许多癌基因调控，如p53基因及Bcl-2家族(包括抑制凋亡基因Bcl-2，Bcl-xL，Mcl-1，Al及Bag，促进凋亡的基因如Bax，Bcl-xs，Bad和Bak等)。抑制凋亡基因中Bcl-2蛋白过度表达时，可引起细胞不死亡或病死率下降的抗凋亡作用，从而对抗药物的治疗作用，使化疗药物失去效果。即Bcl-2导致耐药主要是通过抑制肿瘤细胞的凋亡途径而完成。Bcl-2家族中Bcl-x转录形成的mRNA经剪切、加工形成两种拼接形式，其中一种称为Bcl-xL，另一种为Bcl-xs。有研究表明Bcl-xL的过度表达可显著降低顺铂、足叶乙贰、长春新碱等药物的细胞毒作用并抑制细胞凋亡，从而形成多药耐药。促凋亡基因中Bax功能与Bcl-2相反，当Bax增加时自身可形成同源二聚体，致使细胞凋亡加速，肿瘤细胞对化疗药物敏感性增强。当Bcl-2表达增加，Bax同源二聚体解离，形成Bcl-2 Bax异源二聚体，抑制了Bax-Bax同源二聚体的细胞凋亡作用，从而肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性.因而可见，凋亡相关基因与细胞耐药间关系密切，在产生多药耐药的过程中存在着精密的调控系统，其中的调控机理尚不得而知，有待进一步深入探讨。
细胞死亡一般分两类，调亡和坏死。细胞凋亡是最早被研究的程序性死亡现象，并且在过去很长一段时间内，程序性死亡等同于细胞凋亡。这种细胞的有序死亡在形态学上被描述为细胞质和和细胞核的皱缩、染色质向核外周集中、DNA的片断化、细胞分裂成小的凋亡小体，并通过吞噬作用被除去。凋亡主要通过两种信号通路引导，即由从线粒体的释放细胞色素c介导的内源途径和通过死亡受体与配体结合并被激活来介导的外源途径。但随着研究的深入，科学家们发现在凋亡以外，还存在着多种细胞的程序性死亡方式，由不同的信号通路调控。自噬是除凋亡外研究最多的程序性死亡，经历这种死亡方式的细胞的细胞质和细胞器被多个具有双层膜结构的囊泡隔离，并被运输到溶酶体或自噬泡降解。在一定的胁迫条件如饥饿、损伤条件下都可引发细胞的自噬行为，但过度的自噬行为将导致非凋亡性的细胞死亡。此外，细胞还存在着若干种其它程序性死亡方式，如Paraptosis，表现为线粒体和内质网的不断肿胀和细胞质的泡化。又如Mitotic catastrophe，这种死亡是由有丝分裂的失败引起，伴随着线粒体膜的通透化和caspases的激活，但它并不同于凋亡，因为对caspases的抑制和Bcl-2的过表达都不能抑制这种死亡方式的进行。
传统意义上认为，与细胞凋亡这一有序并受到调控的过程对立存在另一种死亡方式，即为坏死。这是一种由胞外损伤引起的混乱无序的死亡方式，主要表现为细胞的肿胀、质膜的破裂和继而引起的细胞成分的释放及组织炎症反应。但近来研究发现，有些坏死过程是有一系列步骤的。神经元细胞excitotoxic death就是通过过量的谷氨酸过度激活NMDA通道，随后细胞内钙离子水平和依赖于钙离子的通道活性提高实现的。在坏死模型的研究中，坏死是通过内质网上的离子通道实现的。
各种非凋亡类程序性死亡的研究已成为细胞生物学的一大热点。这些研究，一方面丰富了我们对细胞内部调控机制的理解，另一方面也为生物体发育控制，疾病治疗等提供了更多的分子靶点和作用机理，具有重要的意义。
2005年，哈佛大学医学院袁均瑛教授及其她的同事确认了一种新的程序性坏死方式-Necroptosis，具有以下几个主要特点1，坏死样的形态学改变，早期细胞膜的破裂；2，线粒体膜电位下降；3，坏死过程中伴随有自噬现象；4，细胞内活性氧升高不是细胞死亡的关键因素；5，这种程序性坏死可以特异性地被一个小分子(necrostatin-1)所抑制，而目前常用的抑制剂都不能抑制这种死亡。
发明内容
本发明的目的是提供紫草素的一种新用途，即紫草素在制备诱导细胞坏死样程序性死亡的药物中的应用，所述紫草素的分子式为C16H16O5，化学命名为(+)-5，8-dihydroxy-2-(1-hydroxy-4-methyl-3-pentenyl)-1，4-naphthoquinone，它具有旋光性，和异紫草素是一对对映体，所述药物由紫草素与制剂允许的药物赋形剂或载体组成。。
本发明所采用紫草素根据现有技术从植物如紫草中提取或化学合成，制备的药物可含有其他的抗肿瘤药物。
所述的药物可按本制剂领域已知方法制成肠道或非肠道组合药的剂型。制剂形式主要包括液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、滴丸剂或注射剂。
制剂的给药形式主要包括口服给药或注射给药。口服制剂包括缓释剂。
肿瘤细胞产生多药耐药性时，细胞内高表达P-gp，MRP1，等药泵，可将进入细胞内的抗肿瘤药物如紫三醇、阿霉素、长春新碱排出细胞外，使药效大大降低，而紫草素对多药耐药肿瘤细胞的作用不受P-gp，MRP1的影响，而且对多药耐药肿瘤细胞的杀伤作用明显优于紫三醇、阿霉素、表阿霉素、长春新碱、羟基喜树碱等。紫草素杀死P-gp，MRP1高表达的多药耐药肿瘤细胞的机理是诱导程序性坏死-necroptosis，与其亲本药敏细胞一致。
肿瘤细胞高表达抗调亡蛋白Bcl-2，Bcl-xL，可以产生调亡耐受。而目前常用的抗肿瘤药物都是通过诱导细胞调亡来发挥药效的，Bcl-2，Bcl-xL通过抑制细胞调亡，使肿瘤细胞获得对多种抗肿瘤药物的耐受性。紫草素通过非调亡的途径(necroptosis)杀肿瘤细胞，可以避开调亡通路，抗调亡蛋白的高表达对紫草素的抗瘤活性影响很小，紫草素对Bcl-2，Bcl-xL高表达的耐药肿瘤细胞的杀伤能力与对其亲本细胞基本一致。
本发明所述的紫草素在制备诱导细胞坏死样程序性死亡药物中的应用的有益效果如下(1)紫草素可杀伤多药耐药肿瘤细胞，其药效不受常规耐药机理影响。其对多药耐药肿瘤细胞的药效显著高于紫三醇、阿霉素、表阿霉素、长春新碱、羟基喜树碱等现有临床药物；(2)紫草素具有较低的毒性，因此，有很好的临床肿瘤化疗、尤其是抗临床肿瘤多药耐药的应用前景。
图1紫草素引起MCF-7细胞膜破裂。
图2紫草素处理后细胞核Hoechst染色图。
图320μM紫草素处理MCF-7不同时间后，流式检测调亡亚二倍体峰。
图4z-VAD-fmk不能抑制20μM紫草素对MCF-7的杀伤效果。
图520μM紫草素杀HL60细胞没有caspase参与。A，caspase 3活性检测试剂盒检测caspase 3活性。
图620μM紫草素处理MCF-7细胞，未发生AIF核转位。
图7透射电镜图。
图8Nec-1特异性抑制紫草引起的MCF-7坏死。
图9相差显微镜示意Nec-1的抑制效果。
图103-MA不能抑制紫草素引起的MCF-7细胞死亡。
图11活性氧在紫草素诱导的细胞死亡中不扮演关键的角色。
图1220μM紫草素处理MCF-7细胞后，同时出现线粒体膜电位下降，细胞膜破损。
图13Nec-1可以抑制由紫草素引起的多种细胞系的坏死。
图14不同浓度紫草素处理细胞6小时后的细胞死亡率。
图1520μM紫草素处理细胞不同时间后的细胞死亡律。
图16紫草素和taxol处理MCF-7及MCF-7/ADR 4小时后，继续培养7天的细胞生存情况。
图17紫草杀肿瘤细胞的能力不受MRP1影响。
图18紫草杀肿瘤细胞的能力不受Bcl-2，Bcl-xL影响。
具体实施例方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例一紫草通过非调亡的方式杀死肿瘤细胞实验材料MCF-7，HL60，Hela均来源于American Type Culture Collection(ATCC)公司。紫草素购自中国药品与生物制品鉴定所。碘化丙啶(PI)，hoechst33342，z-VAD-fmk，staurosporine(STS)购自Sigma。caspase 3活性检测试剂盒购自Bio Vision Research Products。抗caspase 8和9抗体，兔抗AIF抗体购自CellSignaling Technology公司。FITC以及HRP标记的二抗购自Santa CruzBiotechnology。
实验方法1，取长势良好的MCF-7，HL60细胞，MCF-7贴壁过夜，用紫草素处理后，收集细胞，PBS洗涤后，a，30μg/ml PI室温下染色10分钟，用流式细胞仪检测细胞膜通透性。PI本身不能透过细胞膜，但是当细胞膜破损以后，可以进入细胞，使细胞核着色，所以，PI+细胞代表细胞膜破损，PI-细胞代表细胞膜完整。b，hoechst33342染色，荧光显微镜下观察细胞核着色状况。c，把细胞转移至流式管，并加入1ml 70％的乙醇固定细胞。4℃冰箱过夜后，离心倒去固定液，加入少量的PBS，后加入几滴含有RNA酶的PI，避光反应10～20min，上流式细胞仪检测凋亡率。
2，a，取长势良好的MCF-7细胞，种2×105细胞每孔于六孔板，贴壁过夜，50μM z-VAD-fmk提前处理2小时，再在培养基中加入紫草素，使其终浓度为20μM，6小时后收集细胞，同上用PI染色，流式细胞仪检测细胞膜破损的比例。b，种5×105HL60细胞于六孔板，20μM紫草素处理不同时间，caspase3活性检测试剂盒检测是否有caspase 3激活，western blot方法检测是否有caspase 8和9切割激活。
3，接种对数生长期的MCF-7、Hela细胞，贴壁过夜，20μM紫草素处理MCF-7细胞2小时，2μM STS处理Hela细胞9小时后，胰酶消化下细胞，PBS洗一遍，制作细胞甩片，用4％的多聚甲醛固定细胞15分钟，PBS洗三遍，0.1％Triton X-100透化10分钟，PBS洗三遍，接着用3％BSA封闭1小时，兔抗AIF抗体(1∶200)结合细胞2个小时，PBS洗三遍，用FITC标记的羊抗兔二抗结合45分钟，PBS洗去未结合二抗，最后用PI染细胞核10分钟。以上操作都在室温下进行。
4，取长势良好的MCF-7，HL60细胞，MCF-7贴壁过夜，用紫草素处理后，收集细胞，PBS洗涤后，2.5％的戊二醛前固定，再用1％的锇酸后固定，梯度乙醇脱水，Epon 812包埋，制超薄切片，硝酸铀及柠檬酸铅染色，TECNAI 10透射电镜观察。
实验结果1-1，紫草素可以引起MCF-7细胞膜破损，这种细胞毒性呈浓度与时间依赖，参见图1，图中A，不同浓度紫草素处理MCF-7细胞6小时。B，20μM紫草素处理MCF-7不同时间。1-2，Hoechst染色发现紫草素处理后的MCF-7和HL60细胞核没有发现固缩，染色质凝聚现象，参见图2，图中a，对照MCF-7细胞；b，5μM紫草素处理MCF-76小时；c，20μM紫草素处理MCF-76小时；d，对照HL60细胞；e，20μM紫草处理HL60 6小时；f，20μg/ml VP16处理HL60 4小时，(调亡阳性对照)。1-3，细胞凋亡时，由于核酸内切酶的激活，导致染色质在核小体连接处广泛断裂，在细胞用PI染色做FCM前，一些降解的DNA由于70％乙醇的固定导致通透性增加，DNA碎片从细胞内逸出，凋亡细胞的DNA含量减少，染色后荧光强度降低，因而在DNA直方图上的G0/G1期前方出现了一个亚二倍体的凋亡峰。本实施例中20μM紫草素处理MCF-7 3小时或者6小时后，未发现有调亡峰，参见图3。
2，Caspase总抑制剂z-VAD-fmk不能抑制紫草素对MCF-7的杀伤效果，参见图4。20μM浓度下，紫草素杀伤HL60细胞，没有caspase 3，8，9的参与，参见图5，图中纵坐标表示处理组相对于对照组的caspase 3活性倍数。B，western blot检测caspase 8和9的激活。20μg/ml VP16处理HL60 4小时作为调亡阳性对照。
3，AIF为caspase非依赖调亡的重要参与蛋白。正常情况下，AIF定位于线粒体内膜和外膜的膜间隙中。当细胞接受到外加刺激时，AIF从线粒体膜间隙转位到细胞核内，发挥其生物学效应，导致细胞发生AIF依赖的程序性死亡。本实验中，紫草素处理MCF-7细胞，未发现AIF转位。2μM STS处理Hela细胞9小时，发现有AIF的核转位。见图6。
4，发现紫草素处理后的细胞，出现大量的线粒体扩张，破坏；细胞膜断裂，破损；自噬小体常见；内质网拉伸等，具体参见图7，图中a-fMCF-7细胞，a，对照；b，20μM紫草素处理3小时；c，20μM紫草素处理6小时；d，紫草素处理后扩张的线粒体，自噬小体；e，呈同心圆排列的膜状结构；f，极度扩张破坏的线粒体，内部结构已经消失；g-jHL60细胞，g，对照；h，20μM紫草素处理3小时；i，拉伸的内质网，扩张的线粒体；j，内膜结构包绕的自噬体；a，b，c，g，h bar＝2μm，d，e，f，i，j bar＝1μm。
实施例二紫草杀肿瘤细胞的方式为necroptosis实验材料Necrostatin-1(Nec-1)购自美国biomol公司，3-Methyladenine(3-MA)购自Sigma，6-carboxy-2’7’-dichlorodihydro-fluoresceindiacetate(H2DCFDA)和5，5′，6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanine(JC-1)，购买自Molecular Probe公司。
实验方法1，Necrostatin-1提前一个小时处理MCF-7细胞后，再用紫草素处理细胞，用PI拒染的方法来估计细胞死亡率，或者在倒置显微镜下观察细胞生长状况。
2，10mM 3-Methyladenine提前一个小时处理MCF-7细胞后，再用20μM紫草素处理细胞6小时，收集细胞，PI染色法测定死亡率。
3，MCF-7细胞贴壁过夜，用药物处理后收集细胞，a，37℃下，在含有1μM 6-carboxy-2’7’-dichlorodihydro-fluoresceindiacetate(H2DCFDA)的无血清无酚红的RPMI-1640培养基中孵浴30分钟，收集细胞，流式分析细胞内活性氧水平。b，PI染色法测定死亡率。
4，MCF-7细胞贴壁过夜，用药物处理后收集细胞，a，37℃下，在含有10μM 5，5′，6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanine(JC-1)的无血清无酚红的RPMI-1640培养基中孵浴10分钟，洗细胞一次，重悬于PBS后，流式检测细胞线粒体膜电位(MMP)变化。b，PI染色法测定死亡率。
实验结果1，Necrostatin-1可以抑制紫草素对MCF-7细胞的杀伤效果，抑制效果呈浓度依赖性。具体参见图8，图9。图8中A，不同浓度Nec-1提前作用一个小时，20μM紫草素作用6个小时后细胞坏死率；B，60μM Nec-1提前作用一个小时，不同浓度紫草素作用MCF-7细胞6个小时后细胞坏死率。图9中紫草素的浓度为20μM，Nec-1的浓度为60μM。
2，自噬抑制剂3-MA不能抑制紫草素引起的细胞死亡，参见见图10。
3，紫草素处理后，细胞内活性氧水平上升，Nec-1虽然可以抑制细胞死亡，但不能抑制细胞内活性氧的升高。抗氧化剂BHA和Vitamine E都不能抑制紫草素引起的细胞死亡，参见图11，图中A，紫草素引起细胞内活性氧水平升高，Nec-1不能抑制活性氧的升高；B，100μM BHA或者Vitamine E提前作用2小时，紫草素作用6小时，PI拒染计数发现BHA和VE没有保护作用。
4，紫草素使MCF-7细胞膜电位迅速下降，膜电位的下降是和细胞膜破损是同步的，参见图12。
实施例三紫草素在所检测的细胞中均引起necroptosis。
实验材料所用到的细胞系均来自于American Type Culture Collection(ATCC)公司。耐药株细胞MCF-7/ADR，K562/ADR，HL60/ADR，均为本研究组药物诱导筛选所得。质粒pSFFV-Neo，pSFFV-Bcl-2 and pSFFV-Bcl-xL为弗吉尼亚大学Dr.Steven Grant馈赠。真核转染pSFFV质粒，G418筛选得到MCF-7以及HEK293的Bcl2，Bcl-xL高表达株。
实验方法细胞种板以后(贴壁细胞贴壁过夜)，60μM Nec-1提前处理一个小时，再用紫草素处理细胞6小时，收集细胞，PI拒染计算细胞死亡率。
实验结果在所检测的10多种细胞中，紫草素无一例外引起的(包括P-gp，MRP，Bcl-2，Bcl-xL高表达细胞)死亡都可以被Nec-1所抑制，参见图13，说明紫草素是一个广谱的necroptosis的诱导剂。图3中除了NIH3T3细胞是用了5μM的紫草素处理，其他细胞均是用20μM的紫草素处理，Nec-1都是用了60μM，提前处理细胞2小时。
实施例四紫草杀肿瘤细胞的能力不受P-gp影响实验材料同实施例三。
实验方法1，取对数生长期的细胞，接种于6孔板，MCF-7及MCF-7/ADR每孔种2×105，贴壁过夜，K562及K562/ADR每孔种5×105，不同浓度的紫草素处理不同时间以后，收集细胞，用PI拒染的方法计算细胞坏死率。
2，紫草素对MCF-7，K562及其它们的耐药株的IC50的计算。不同浓度紫草素作用细胞72小时后，收集细胞，PBS洗一遍，用流式细胞仪细胞计数的方法，计算IC50。
3，不同浓度紫草素和taxol作用MCF-7及MCF-7/ADR 4小时后，倒去含有药物的培养基，用无菌生理盐水洗三遍后，加入含有小牛血清的完全培养基，继续培养7天，观察是否有细胞重新长起来。
实验结果1，不同浓度紫草素处理细胞6小时，K562以及K562/ADR对紫草素的敏感性基本一致，但MCF-7和MCF-7/ADR有比较大的差异，参见图14。20μM紫草素作用细胞不同时间，发现，随着时间的延长，MCF-7和MCF-7/ADR对紫草的敏感性趋于一致，参见图15。
2，药物作用72小时，紫草素对亲本株细胞和耐药株细胞的IC50非常接近，见以下表1。
表1紫草素对MCF-7，K562及其它们的耐药株的IC50
3，MCF-7对taxol和紫草素非常敏感，低浓度作用4小时后，细胞全部死亡，不能重新生长回来。同样处理下，MCF-7/ADR表现出对taxol的强耐药性，而对紫草素的敏感性于MCF-7一致，参见图16。
实施例五紫草杀肿瘤细胞的能力不受MRP1影响实验材料同实施例三。
实验方法
1，取对数生长期的细胞，接种于6孔板，每孔种5×105，不同浓度的紫草素处理不同时间以后，收集细胞，用PI拒染的方法计算细胞坏死率。
2，如实施例4的方法测定72小时紫草素对HL60及HL60/ADR的IC50。
实验结果1，紫草素对HL60和对HL60/ADR的细胞毒性基本上是一致的，6小时之内有一定的差异，但延长药物作用时间后，没有差异，具体参见图17，图中A，不同浓度紫草素处理6小时后，PI拒染计算细胞坏死率；B，20μM紫草素处理不同时间后，PI拒染计算细胞坏死率。
2，药物作用72小时，紫草素对亲本株细胞和耐药株细胞的IC50非常接近，见以下表2。
表2，紫草素对HL60及HL60/ADR的IC50
实施例六紫草杀肿瘤细胞的能力不受Bcl-2，Bcl-xL影响实验材料同实施例三。
实验方法1，取对数生长期的细胞，接种于6孔板，每孔种2×105，贴壁过夜，不同浓度的紫草素处理不同时间以后，收集细胞，用PI拒染的方法计算细胞坏死率。
2，如实施例4的方法测定紫草素对亲本株和Bcl-2，Bcl-xL高表达株的IC50。
实验结果1，紫草素对MCF-7/neo和对MCF-7/Bcl-2，MCF-7/Bcl-xL的细胞毒性基本上是一致的，6小时之内有一定的差异，但延长药物作用时间后，没有差异。对HEK293/neo，HEK293/Bcl-2，HEK293/Bcl-xL也是如此，参见图18，图中A，MCF-7/neo，MCF-7/Bcl-2，MCF-7/Bcl-xL细胞在不同浓度紫草素下，作用6小时后细胞坏死率。B，HEK293/neo，HEK293/Bcl-2，HEK293/Bcl-xL细胞在不同浓度紫草素下，作用6小时后细胞坏死率。
2，药物作用72小时，紫草素对亲本株细胞和Bcl-2，Bcl-xL高表达株的IC50非常接近，见以下表3。
表3，紫草素对亲本株细胞和Bcl-2，Bcl-xL高表达株的IC50
以上实施例说明紫草素引起细胞死亡的主要方式是一种程序性坏死-necroptosis。由于其杀肿瘤细胞主要为一种非调亡的方式，所以，可以避开普通调亡耐受，如实施例4，5，6所述，紫草素可以克服P-gp，MRP1，以及Bcl-2，Bcl-xL介导的多药耐药。
实施例4中发现，紫草素作用6小时，MCF-7/ADR细胞株相对MCF-7表现出一定的耐药性，可是当延长药物作用时间后，MCF-7/ADR和其亲本细胞MCF-7对紫草素的敏感性基本一致，说明MCF-7/ADR对紫草素本质上是不耐受的，只是对紫草素的反应时间上有些差异。表1和图16同样说明了这个问题。
紫草素对小鼠的LD50为3g/kg左右，实际为无毒性组分，目前广泛用于食品添加剂的色素。1991年已有中国学者用紫草素复合方剂较为成功的用于临床实验，治疗晚期癌症患者。说明紫草素对正常个体的毒性较小。又由于其特殊的杀肿瘤细胞机理，可以克服多种原因介导的调亡耐受，使其在抗肿瘤多药耐药性的药物制备和临床应用上具有广阔的前景。
权利要求
1.紫草素在制备诱导细胞坏死样程序性死亡的药物中的应用，所述紫草素的分子式为C16H16O5，化学命名为(+)-5，8-dihydroxy-2-(1-hydroxy-4-methyl-3-pentenyl)-1，4-naphthoquinone，它具有旋光性，和异紫草素是一对对映体，所述药物由紫草素与制剂允许的药物赋形剂或载体组成。
2.根据权利要求1所述的紫草素在制备诱导细胞坏死样程序性死亡的药物中的应用，其特征是所述药物的制剂形式为液体制剂、颗粒剂、片剂、冲剂、胶丸、胶囊、缓释剂、滴丸剂或注射剂。
3.根据权利要求1或2所述的紫草素的紫草素在制备诱导细胞坏死样程序性死亡的药物中的应用，其特征是所述药物制剂的给药形式为口服给药或注射给药。
全文摘要
本发明提供紫草素在制备诱导细胞坏死样程序性死亡的药物中的应用，所述紫草素的分子式为C
文档编号A61K9/00GK1931152SQ20061005362
公开日2007年3月21日 申请日期2006年9月27日 优先权日2006年9月27日
发明者胡汛, 韩卫东 申请人:浙江大学