专利名称：T细胞抑制肽对类风湿关节炎的治疗作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及T细胞抑制肽的制备及其做为类风湿关节炎(RA)和其他自身免疫病的药物应用。
背景技术：
类风湿性关节炎是一种以慢性进行性关节病变为主的全身性自身免疫性疾病。主要侵犯全身多个关节，呈多发性和对称性慢性滑膜炎，由此引起关节滑膜、软骨和骨的破坏，最后导致关节强直畸形，甚至残疾。在我国，类风湿关节炎患病率为0.32％-0.38％，总患病人数超过400万，致残率高达93％，是造成劳动力丧失与致残的主要疾病之一。
研究发现，类风湿关节炎的发病与抗原驱动的T细胞激活有关。感染因子及自身免疫反应介导的免疫损伤是类风湿关节炎发病及病情演变的基础。抗原多肽通过体内的抗原提呈细胞识别与提呈，并激活T细胞，导致细胞因子的释放及免疫球蛋白、趋化因子和自由基等炎症介质产生增多，进而引起血管炎，滑膜增生，软骨及骨破坏等类风湿关节炎的特征性病理变化。因此，抗原多肽、HLA-DRB1及T细胞受体三分子间的特异性识别与结合是RA异常免疫反应的始动环节[1]。
目前，尚无从根本上控制类风湿关节炎的药物。临床上主要通过非甾体抗炎药如布洛芬及双氯灭酸等消炎、止痛暂时缓解症状。而慢作用抗风湿药如甲氨喋呤等则是通过抑制DNA合成广泛抑制免疫反应的目的，进而抑制关节炎症。因此，这些药物在类风湿关节炎治疗中并非作用于发病的最初环节，难以针对性控制病变，致使全身及关节病变不断进展、最终致残。而且，由于此类药物的广泛免疫抑制作用，副作用较多，很多患者不能用药。
目前急需能够针对类风湿关节炎发病原因，抑制免疫反应的起始环节治疗本病的药物。为此，本发明人经过多年的研究发现了可以用以治疗类风湿关节炎的非抗原性T细胞抑制肽。研究证明，本申请中的多肽能够抑制T细胞介导的自身免疫反应，从类风湿关节炎发病的中心环节遏制本病的发生发展。
本发明的目的之一是提供能够有效治疗类风湿关节炎的T细胞抑制肽制剂。
本发明的另一目的是证明所述T细胞抑制肽在治疗类风湿关节炎中的作用。最后，本发明提供了含有所述T细胞抑制肽的药物组合物。
发明概述抗原多肽、HLA-DRB1及T细胞受体三分子间的特异性识别与结合是类风湿关节炎异常免疫反应的始动环节。因此，本发明从导致类风湿关节炎的关键点-阻断T细胞对抗原的结合入手，从根本上抑制和治疗类风湿关节炎。
已经证明，与类风湿关节炎相关的HLA-DRB1基因第三高变区可变区编码的DR4和DR1蛋白的β链在第70-74位含有一段共同序列QK/RRAA(即谷氨酰胺-赖氨酸/精氨酸-精氨酸-丙氨酸-丙氨酸)。这几个氨基酸残基恰位于HLA-II类分子抗原结合槽的螺旋部位，具有共同的抗原结合特性，可与致病抗原肽结合，并呈递给T细胞，引发自身免疫反应[2-3]。
通过X线衍射技术对HLA-DRB1-抗原肽二聚体结晶结构的研究发现，与类风湿关节炎相关的HLA-DRB1分子相结合的抗原肽在三维结构上及其相似，其中包括II型胶原(CII)、病毒多肽(H)、II类分子相关的恒定链多肽(CLIP)、血红素(HB)及热休克蛋白(HSP)等，但以病毒多肽与HLA-DRB1的结合力最强[4-7]。病毒多肽中的氨基酸残基Y308，Q311，T313，L314和L316被HLA-DR4/1识别，而残基V309，K310，N312或K315与TCR结合。替换病毒多肽308-317中与T细胞受体结合的氨基酸所形成的病毒修饰肽仍可能结合HLA-DR4/1分子，但无T细胞激活作用[8-9]
本发明人的研究证明，替换与T细胞受体结合的氨基酸导致抗原识别、T细胞激活障碍及腺苷环化酶(AC)蛋白激酶A(KA)细胞信号的传递受损。这些结果证明了QK/RRAA共同序列对类风湿关节炎患者细胞内PKA信号传递的抑制作用，并在分子水平提示了类风湿关节炎基因型与类风湿关节炎患者细胞内信号传递的密切关系。以病毒来源的非抗原性T细胞抑制肽抑制致病抗原的作用及T细胞对抗原的识别，则可抑制类风湿关节炎患者体内T细胞介导的异常免疫反应，从而控制类风湿关节炎病情的发展，达到从根本上治疗类风湿关节炎的目的。
基于以上研究基础，本发明人将HLA-DRB1高亲和力的病毒多肽中与T细胞受体结合的氨基酸用丙氨酸(A)替换，但保留与HLA-DRB1结合的氨基酸，形成一种仅与HLA-DRB1结合，而不被T细胞受体识别的T细胞抑制肽。这种T细胞抑制肽可特异性结合HLA-DRB1分子，竞争性地抑制自身抗原与HLA-DRB1的结合，从而抑制T细胞介导的自身免疫反应以及由此引起的炎症反应。本发明的T细胞抑制肽的名称及序列见表1。
因此，在本发明的实施方案中，提供了三条T细胞抑制肽。这些多肽可以与类风湿关节炎相关的HLA-DRB1特异结合，抑制HLA-DRB1相关抗原肽与HLA-DRB1结合，从而使T细胞的激活受到抑制，达到治疗T细胞介导的自身免疫病的目的。
在本发明的实施方案中还提供了含有所述抑制T细胞活化以及可药用载体或佐剂的组合物。
可药用载体或佐剂包括乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、马铃薯淀粉或支链淀粉、纤维素衍生物、明胶、硬脂酸美及硬脂酸钙等。可将所述组合物制成片剂、丸剂、胶囊剂、糖浆剂、粉剂或溶液剂等。例如将所述药物组合用于口服给药时，该活性化合物可以与上述可药用载体或佐剂混合，然后压制成片剂。如果需要亦可包衣。
液体制剂还可以包括本领域技术人员熟知的其他赋性剂。该药物组合物中还可能包含药剂学允许的一些载体，如水，混悬剂和乳化剂等其他成分。
本发明中T细胞抑制肽制剂可通过多种途径(例如口服、注释等)对关节炎患者给药。
以下通过实施例进一步说明本发明，但下列实施例不以任何方式限制本发明的范围。
实施例实施例1特异性T细胞抑制肽的合成以短侧链的A单一或连续替换HLA-DRB1高亲和力的病毒多肽中由T细胞受体识别的氨基酸(V309，K310，N312或K315)，从而得到三条T细胞抑制肽。它们的序列见表1。同时合成抗原肽II型胶原多肽(FKGEQGPKGE)和病毒多肽(YVKQNTLKLA)。上述多肽均由上海申友公司以固相合成法合成、高效液相层析法纯化。这些肽不含易降解的甲硫氨酸、色氨酸及易脱氨基羧基的天门冬氨酸等。因此，肽的稳定性好。为利于肽向细胞内转运，在多肽氨基端均连接十四烷酸(豆蔻酸)。质谱分析结果显示多肽的序列正确，纯度在95％以上。
表1合成的多肽及其序列
注M＝十四烷酸在本发明中，检测了上述多肽在T细胞激活中的作用。结果发现，与阴性对照组相比，II型胶原和病毒多肽在0.1、1、10或100μg/ml的浓度下均可不同程度地刺激T细胞的增殖(图1-A)和诱导IL-2的分泌(图1-B)。而在相同浓度下，三条抑制肽均不能明显诱导T细胞增殖和IL-2的分泌；并且，其T细胞增殖反应和IL-2的水平显著低于相同浓度的II型胶原和病毒多肽。上述结果显示，三条抑制肽在T细胞激活中呈低反应性，有可能抑制T细胞激活。
实施例2T细胞抑制肽对HLA-DR4特异性T细胞激活的抑制作用抗原多肽通过抗原提呈细胞识别激活T细胞，引起体内炎症介质的产生，进而引起关节炎的特征性病理变化。在本实验中，通过测定T细胞增殖及IL-2水平的检测T细胞抑制肽对T细胞激活的抑制作用，试验中将Priess细胞(表达HLA-DR4分子的B细胞)和HLA-DR4限制性T细胞(3838细胞)组成抗原呈递体系，通过比较T细胞抑制肽和抗原肽对抗原提呈作用的差异，筛选出对T细胞激活有明显抑制作用的非抗原性多肽。
在反应体系中，经照射的Priess细胞中同时加入10μg/ml的II型胶原多肽、病毒多肽以及不同浓度(0、2、10和50μg/ml)的T细胞抑制肽。在37℃，5％CO2反应条件下孵育2小时，然后加入T细胞(3838细胞)2×104个/孔，继续培养24小时。收取培养上清，ELISA法检测上清中IL-2的浓度，3H掺入法检测T细胞增殖。
结果发现，与单独加入II型胶原和病毒多肽的对照组相比，三条抑制肽可以抑制II型胶原和病毒多肽诱导的T细胞活化(图2-A和图2-B)，并且加入抑制肽后，其上清中IL-2的浓度显著低于单独加入II型胶原和病毒多肽的对照孔(图3-A和图3-B)。提示T细胞抑制肽可以抑制II型胶原和病毒多肽诱导的T细胞激活。
实施例3T细胞抑制肽对类风湿关节炎患者外周血T细胞激活的抑制作用在本发明的实施方案中，还研究了T细胞抑制肽对类风湿关节炎患者外周血T细胞激活的抑制作用。
选取27例HLA-DR4/1阳性的类风湿关节炎患者，用淋巴细胞分层液分离外周血单个核细胞，接种96孔板(2×105/孔)，同时加入II型胶原、病毒多肽(10μg/L)以及不同浓度(0、2、10和50μg/L)的三条抑制肽，在37℃、5％CO2条件下培养5天后，培养孔内掺入3H-TdR，8小时后用细胞收集仪收集细胞至玻璃纤维滤纸上，3H掺入法检测T细胞增殖。
结果发现，与单独加入II型胶原和病毒多肽原型肽的对照组相比，三条抑制肽可以抑制II型胶原和病毒多肽诱导的T细胞活化(图4-A和图4-B)，并且这种抑制作用呈剂量依赖型，随着浓度的增高，抑制作用增强。
图1.II型胶原、病毒多肽及其抑制肽诱导的T细胞增殖(A)和IL-2的分泌(B)。由图可见II型胶原和流感病毒多肽在0.1、1、10或100μg/ml浓度下均可不同程度地刺激T细胞的增殖(图1-A)和诱导IL-2的分泌(图1-B)。而在相同浓度下，三条抑制肽均不能明显诱导T细胞增殖和IL-2的分泌。
图2.T细胞抑制肽对II型胶原(图2-A)和病毒多肽(图2-B)诱导T细胞增殖的抑制作用。由图可见II型胶原和病毒多肽可诱导HLA-DRB1限制性T细胞系活化，随着加入抑制肽浓度的增加，II型胶原和病毒多肽诱导的T细胞活化逐渐被抑制，并呈剂量依赖性(*P＜0.05；**P＜0.01)。
图3.T细胞抑制肽抑制II型胶原(图3-A)或病毒多肽(图3-B)诱导IL-2的分泌。由图可见II型胶原和病毒多肽可诱导HLA-DRB1限制性T细胞系活化产生IL-2分泌，随着加入抑制肽浓度的增加，II型胶原和病毒多肽诱导的IL-2分泌水平逐渐被抑制(*P＜0.05)。
图4.T细胞抑制肽抑制RA病人外周血II型胶原(图4-A)和病毒多肽(图4-B)诱导的T细胞增殖。II型胶原和病毒多肽可明显诱导RA患者外周血T细胞增殖，随着加入抑制肽浓度的增加，II型胶原和病毒多肽诱导的T细胞增殖逐渐被抑制(*P＜0.05；**P＜0.01)。
序列表1、多肽名称抑制肽1序列长度10(氨基酸)序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列YVAQNTLKLA2、多肽名称抑制肽2序列长度10(氨基酸)序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列YAKQATLKLA3、多肽名称抑制肽3序列长度10(氨基酸)序列类型氨基酸拓扑学线性分子类型肽序列YAKQATLALA
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权利要求
1.与具有共同序列QK/RRAA的靶序列结合的T细胞抑制肽。
2.权利要求1的T细胞抑制肽，其中该多肽含有YVAQNTLKLA、YAKQATLKLA和YAKQATLALA的序列。
3.含有权利要求1的T细胞抑制肽及可药用载体或佐剂的药物组合物。
4.权利要求1的T细胞抑制肽在制备治疗类风湿关节炎的药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种T细胞抑制肽用于类风湿关节炎的治疗。这种多肽治疗剂可特异性抑制RA的异常免疫反应，从发病的起始环节控制本病的发展。
文档编号A61P19/00GK1872873SQ20061008755
公开日2006年12月6日 申请日期2006年6月14日 优先权日2006年6月14日
发明者栗占国 申请人:北京大学人民医院